전통적인 담배 연기와 전자 담배 연 무질에서 액체 추출의 세대에 대 한 장치를 운영 하는 마이크로컨트롤러

이 절차의 전반적인 목표는 독성 분석에 사용하기 위해 전자 담배 에어로졸에서 액체 추출물을 생성하는 것입니다. 이 방법은 전자 담배 에어로졸이 인간 혈관 세포에 어떤 영향을 미치는지와 같은 전자 담배에 대한 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 연구 요구 사항을 충족하기 위해 개별 실험실에서 공기 흐름 및 퍼프 타이밍 프로토콜을 사용자 정의할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 전자 담배 사용의 잠재적 위험에 대한 더 나은 이해로 확장되는데, 이는 자신의 실험실에서 전자 담배 에어로졸 추출물을 생성할 수 있는 맞춤형 플랫폼을 제공하기 때문입니다. 이 방법은 전자 담배의 위험에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 기존 담배 제품이나 대마초 제품과 같은 다른 제품에도 적용할 수 있습니다.

시작하려면 100ml Buchner 플라스크를 강철 링 스탠드에 고정하고 건조제 역할을 할 염화칼슘 50g을 채워 진공 트랩을 만듭니다. 그런 다음 고무 관통 구멍 마개로 플라스크를 밀봉합니다. 스토퍼 접합부를 파라핀 필름으로 감싸고 구멍을 통해 피펫을 통과시킵니다.

비닐 튜브를 사용하여 토퍼에서 연장된 피펫을 T-교차 호스 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 이를 사용하여 두 개의 임프저를 서로 연결하고 두 번째 임핑저의 출력을 T-교차 호스 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 비닐 튜브를 사용하여 흡입 포트 역할을 하는 첫 번째 임프저의 입력 포트를 연결합니다.

또한 Buchner 플라스크의 사이드암을 기류 조절기의 입력 포트에 연결합니다. 그리고 기류 조절기의 출구 포트를 진공 펌프에 연결합니다. 그런 다음 510 나사산 베이스를 링 스탠드 cl에 놓습니다.amp 비닐 튜브를 사용하여 솔레노이드 밸브를 T-교차 호스 커넥터의 자유 끝에 연결합니다.

완료되면 모든 조인트가 밀폐되어 있는지 확인하고 필요에 따라 호스 클램프와 진공 그리스를 바르십시오. 먼저, 각 전자 담배 카토마이저 또는 탱크를 사용하기 전에 분석 저울에 올려 놓고 질량을 측정합니다. 사용 전과 후의 무게 차이에 따라 적절한 투여량이 결정됩니다.

상업용 3R4F 연구용 담배의 경우 니코틴 함량은 7mg입니다. 다른 모든 상업용 담배의 경우 니코틴 함량은 기존의 분석 방법으로 측정해야 합니다. 다운스트림 분석을 위해 중성 적색 흡수 세포 생존율 분석을 사용하는 경우, 1차 임핑어의 저장소를 4.3ml의 내피 세포 배양 배지로 채웁니다.

다음으로, 추출을 위해 전자 담배 또는 일반 담배를 준비합니다. 일반 담배를 추출할 준비를 하려면 필터 주위에 투명 테이프를 붙이고 담배 종이가 필터와 연결되는 위치에 쉽게 볼 수 있는 표시를 합니다. 전자 담배를 준비하려면 배터리가 잘 충전되어 있고 카토마이저가 배터리에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.

전자 담배 탱크를 사용하는 경우 탱크에 적절한 양의 전자 담배 액체가 적재되어 있는지 확인하고 탱크를 510 나사산 베이스에 나사로 고정하십시오. 기존 담배의 경우 흡입 포트에 담배를 넣고 호스 클램프로 고정합니다. 그런 다음 진공 펌프를 켭니다.

유량계를 조정하여 분당 1.65리터를 당기도록 하여 2초 동안 55리터 퍼프를 보장합니다. 그런 다음 마이크로 컨트롤러를 켜고 이를 사용하여 첫 번째 퍼프에서 담배에 불을 붙입니다. 예상되는 원하는 농도에 도달할 때까지 펌프를 가동합니다.

전자 담배의 경우 흡입 포트에 담배를 넣고 호스 클램프로 고정하는 것으로 시작합니다. 일반 담배와 마찬가지로 진공 펌프를 켜고 유량계를 조정하여 분당 1.65리터를 당기도록 하여 2초 동안 55밀리리터 퍼프를 보장합니다. 예상되는 원하는 부피가 사용될 때까지 펌프를 가동합니다.

그런 다음 진공을 중지하고 분석 저울을 사용하여 각 전자 담배 카토마이저 또는 탱크의 사용 후 질량을 측정합니다. 소비된 총 질량을 결정하기 위해 이것을 사용 전 질량과 비교하십시오. 불충분한 질량을 섭취한 경우 전자 담배를 장치에 다시 넣고 추가 시간 동안 추출을 실행하십시오.

추출할 때마다 장치의 튜브와 저장소를 70% 에탄올과 탈이온수로 헹구어 샘플 간의 캐리오버를 방지합니다. 그런 다음 빈 장치를 잠시 실행하여 공기 흐름이 라인 건조를 도울 수 있도록 합니다. 추출물을 세포 배양에 사용하는 경우 0.22미크론 폴리에테르설폰 주사기 필터를 통해 추출물이 포함된 배지를 필터링합니다.

분석실험을 달리기 하루 전에, 10에 96 우물 판으로 인간적인 배꼽 정맥 내피 세포를 씨를 뿌리십시오, 내피 세포 성장 매체의 100 마이크로리터에 있는 우물 당 000의 세포. 섭씨 37도, CO2 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 기존 배양 배지를 대조군 역할을 할 100마이크로리터의 새로운 내피 세포 배양 배지로 교체하거나 500마이크로몰의 소비된 니코틴을 포함하는 100마이크로리터의 내피 세포 성장 배지로 교체하여 치료 그룹 역할을 합니다.

웰을 밀폐하기 위해 호일 씰로 플레이트를 밀봉한 다음 플레이트를 18-24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 담배 연기 및 전자 담배 에어로졸의 많은 구성 요소는 휘발성이므로 우물이 밀폐되도록 우물을 호일 밀봉으로 덮는 것이 중요합니다. 사용 직전에 세포 배양 배지에 100x 중성 적색 원액을 1 - 100으로 희석하여 1x 중성 적색 염색 용액을 만듭니다.

중성 적색 염색 용액을 사용하기 전에 최소 30분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 일부 결정이 배양 중에 침전되는 것은 정상입니다. 이러한 결정이 세포 배양 웰에 적용되지 않도록 하려면 용액을 22미크론 필터에 통과시킵니다.

실험용 배양 배지를 제거하고 각 웰에 100마이크로리터의 중성 적색 염색 용액을 추가합니다. 과도한 염색을 사용하여 적절한 정량화를 위해 최소 3개의 빈 웰을 만듭니다. 플레이트를 2-4시간 동안 배양한 다음 중성 적색 염색 용액을 제거하고 PBS에 담궈 세포를 세 번 세척합니다.

다음으로, 중성 적색 얼룩 제거 용액을 바르고 흔들면서 실온에서 최소 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 완료되면 540나노미터의 흡광도에서 플레이트를 읽습니다. 인간 제대 정맥 내피 세포가 기존 담배 연기 추출물 또는 전자 담배 에어로졸 추출물에 노출된 후 24시간 이내에 세포 생존율이 크게 감소합니다.

세포 생존율 연구 외에도 아세톤으로 추출된 경우 가스 크로마토그래피 질량 분석법을 사용하여 추출물 자체를 분석할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 추출물의 많은 성분을 측정할 수 있습니다. 에어로졸이나 연기를 가지고 작업하는 것은 위험할 수 있으며 모든 추출은 화학 안전 후드에서 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오.