Name: 해 부와 Allantoic 첨부 파일의 생체 외에서 분석 Murine Allantois Explant 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 학습하세요 생쥐 allantois의 생체 외 배양 및 부착 분석 방법을 통해 태반 형성의 초기 단계를 연구하는 기술입니다. α4β1 integrin을 이용한 현미경 평가로 포유류 배아 발달 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

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마우스 사육 Regierung 인 운터 프랑 켄에 의해 승인 되었다 그리고 모든 분석 모든 독일과 유럽 연합 해당 법률 및 규정 관리 및 실험 동물의 사용에 따라 실시 했다.
1. 결정의 코팅 전 Utero Allantois Explant 문화에 대 한 α4β1 Integrin와 플레이트
<ol><li>멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 200 µ g/mL에서 동결 건조 된 murine α4β1 integrin reconstitute 미리 데워 진된 (37 ° C) PBS에에서 10 µ g/mL의 최종 농도에 희석. 피 펫 20 µ L/결정 플레이트 (1 allantois/잘)의 우물의 필요한 수에 희석된 α4β1 integrin 솔루션의 음. 참고: 결정 접시의 우물을 코팅 할 때 기포의 형성을 피하십시오.</li>
	<li>습도 조직 문화 인큐베이터에 그들을 배치 하 여 37 ° C에서 60 분에 대 한 결정 번호판을 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 발음 한 피 펫과 상쾌한. 부드러운 흡입을 사용 하 고 경사 접시 피 펫 팁 잘 하단을 만지지 마십시오. 두 번 미리 따뜻하게 (37 ° C) 문화 매체와 같은 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)의 50 µ L을 추가 하 여 우물을 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>중요 한 단계: 블록 무료 50 µ L / 0.1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 음을 추가 하 여 사이트 바인딩 / DMEM 습도 조직 문화 인큐베이터에서 결정 접시를 두어서 ≥ 37 ° C에서 30 분 품 어 및. 참고: Allantois explants는 혈 청의 다양 한 표면에 첨부할 수 있습니다. 일반적인 바인딩 사이트를 차단 하는 것이 필수적 이므로, 코팅 후 웰 스 integrin, 그리고 대 한 해 부 allantois를 추가 하기 전에 포함 하는 혈 청에서 문화 explant 중간 (단계 4.4 참조).</li>
	<li>4.4 단계에서 필요할 때까지 37 ° C에서 차단 솔루션에 코팅된 우물을 유지.</li>
</ol>2. 자 궁 해 부 Dpc 8에서 임신 마우스에서
참고: 체중 증가 차별15거짓 양성 임신 율을 줄일 수 있습니다.
<ol><li>자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 희생. 70% (v/v) 에탄올을 분사 하 여 복 부 지역에 코트를 소독. 참고: 마우스를 처리 하는 경우 장갑을 착용 한다. 마 취약 없이 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 allantois allantois 첨부 파일을 방해할 수 있는의 화학 오염을 방지 합니다.</li>
	<li>가 위는 중간에 작은 절 개를 하 여 복 부 피부를 엽니다. 피부 절 개, 위아래를 gloved 손가락을 사용 하 고 가슴과 마우스의 꼬리 쪽으로 떨어져 피부를 당겨.</li>
	<li>집게와 복을 파악. 다른 한편으로는, 만들어 앞쪽에서 V 자형 절 개 후부 쪽으로 위를 사용 하 여와 이동 멀리 복 부 구멍을 노출 하는 조직. 집게를 사용 하 여 자 궁에 액세스 내장 한쪽으로 밀어.</li>
	<li>두 개의 자 궁 뿔을 찾습니다. 집게와 자 궁 경부 (꼬리 세그먼트)를 누른 괜 찮 아 요가 위 인 대를 잘라. 그런 다음가 위는 oviducts severing 모두 자 궁 뿔 분리 합니다.</li>
	<li>실내 온도 (RT) PBS 살 균, 멸 균 10cm 요리 포함으로 궁 전송 집게를 사용 합니다. 지방 조직, 혈관, 신경 주변 미세 집게 /가 위 (그림 1A)와 자 궁 뿔을 제거 합니다.</li>
</ol>3. 태아의 해 부
참고: 8:1 확대/축소 범위를 갖춘 stereomicroscope에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>가 위는 배아 이식 사이트 사이 절단 하 여 구분 합니다. 집게와 자 궁 싹의 근육 자 궁 안 대기를 잡고 고 (그림 1B) decidua 노출 떨어져 그것을 끌어.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 전송 궁 싹 살 균, 포함 된 새로운 10 cm 접시에 RT PBS.</li>
	<li>태아 주위 decidua 집게의 끝을 함께 해결.</li>
	<li>절 개는 decidua의 안티-mesometrial에 좋은 집게 (그림 1C)와 고 껍질에 decidua 멀리 배아 (그림 1D)를 노출 하는 집게와. 참고:는 decidua의 mesometrial 극 높은 나가도록 하 고 태아를 포함 하 고 더 창백한 나타납니다 안티-mesometrial 부분 보다 그것의 기초에 넓은 수 있습니다.</li>
	<li>집게 (그림 1E, F)와 태아를 해 부.</li>
	<li>마이크로 스푼을 사용 하 여, 살 균 3.5 cm 접시에 포함 된 메 마른 PBS의 한 방울으로 배아를 전송 합니다.</li>
	<li>마이크로 스푼을 사용 하 여 동일한 3.5 cm 접시에 PBS의 신선한 방울에 배아를 전송 하 고 집게 (그림 1G, H)를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 태아를 해 부.</li>
	<li>필요에 따라 필요한 경우 (예를 들어, 연쇄 반응에 의해 유전형), 전송 노른자위 낭 무 균 튜브에와 그것을 발음 하 여 ~ 큰 구멍 200 µ L 피 펫 팁으로 5 µ L PBS. -20 ° c.에 게 참고: 노 른 자 삭 준비를 오염 시킬 수 있는 모성 조직 (즉, 정수 리 른 sac Reichert의 막과 ectoplacental 콘 포함) 잘못 된 유전형 결과 발생할 수 있습니다. 이러한 직물의 제거는 노른자위 낭에서 태아 해 부 전에 더 쉽습니다.</li>
</ol>4. allantois 해 부 및 고정된 α4β1 Integrin에 전 Utero 문화
<ol><li>좋은 집게 (그림 1 H)를 사용 하 여 태아의 뒤 끝에는 기저 삽입 사이트에서는 allantois를 잘라.</li>
	<li>필요에 따라 발달 준비 해야 하는 경우에 somite 쌍 태아의 검사 단계 대조 광학 및 5 ×, 10 × 목표와 현미경을 사용 하 여 계산. 참고: 태아 somite 계산을 촉진 하기 위하여 집게로 확장할 수 있습니다. Chorioallantoic 첨부 파일 및 퓨전 ≥ 6 somite 쌍 태아에서 E 8.0과 9.0 E 간에 발생합니다. 도 6-8 somite 쌍 태아에서 시작 된다.</li>
	<li>피펫은 40 µ L / 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청, L-글루타민, 항생제 미리 코팅된 결정 플레이트 웰 스 (섹션 1을 참조)의 필요한 수에 보충 DMEM의 음.</li>
	<li>그것을 발음 하 여 부동 allantois 수집 ~ 200 µ L 피 펫 팁의 큰 구멍으로 5 µ L PBS. 전송 1 allantois/잘.</li>
	<li>예를 들어에 대 한 습도 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에서 결정 플레이트를 배치 하 여는 allantoides를 품 어 6, 12, 및 24 시간. Allantois 부착을 가진 방해를 방지 하기 위해이 시간 포인트 사이 결정 접시를 이동 하지 마십시오.</li>
	<li>각 시간 점에서 점수 allantois 첨부 파일 (예를 들어, 없음 첨부 파일/부동 allantois; 부분적으로 또는 완전 하 게 연결 된 allantois; 완전히 확산 allantois) 갖춘 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트 광학 현미경을 사용 하 고 5 × 또는 10 × 목표 (그림 2). 참고: 갓 격리 하 고 완벽 하 게 연결 된 allantoides의 대표적인 예는 그림 2에 표시 됩니다. Utero ex, wildtype C57BL/6J 쥐에서 분리 된 allantoides의 원심 끝에 4-6 h (이 라고 하는 allantois의 부분 첨부), 내 연결 및 전체 allantois의 전체 첨부 파일 내에서 이루어집니다 ~ 문화 12 h. 18-24 h는 explant 평평 있으며 CD31-양성 혈관 총9,16원형 (완전히 확산 allantois 함) 가정.</li>
</ol>5. 확실 한 내 피 세포 마커 CD31 위한 Explanted Allantois의 얼룩
<ol><li>완전히 확산 explants의 문화 매체를 발음 하 고 4% (w/v) paraformaldehyde/PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 셀을 해결. 참고: Paraformaldehyde 독성이 있다. 장갑 및 피부와 눈 접촉을 피하기 위해 안전 고글을 착용 합니다.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 incubate 다음은 상쾌한 발음. PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>세포를 permeabilize 40 µ L/잘 PBS의 추가 의해 두 번의 0.1% (v/v) 트리톤 X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) 정상 염소 혈 청 PBS에서 실시간 세척에서 30 분 동안 40 µ L/잘 추가 하 여 비 특정 바인딩 사이트를 차단 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 하룻밤이 시점에서.</li>
	<li>밤새 4 ° c.에 셀 기본 안티-CD31 항 체의 20 µ L/잘 희석 0.1% (w/v) BSA/PBS에에서 1시 50분을 추가 하 여 얼룩 PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>20 µ L/잘 붙일 레이블 보조 염소 반대로 쥐 항 체 희석된 1: 200의 0.1% (w/v) BSA/PBS 배치 하거나 알루미늄 호 일에 포장 하 여 빛에서 실시간 보호 결정 접시에서 1 시간에 대 한 어두운 챔버에 추가 하 여 바운드 기본 항 체를 감지 합니다. PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>20 µ L/잘 장착 매체의 추가 하 여 셀을 포함 합니다. 에 품 어 ~ RT 설치 매체에는 경화 될 때까지에 1 시간. 빛 으로부터 보호 4 ° C, 또는 RT에서 결정 접시를 저장.</li>
	<li>이미지는 allantois의 혈관 총 explants는 5 × 또는 10 × 목표와 적합 한 형광 필터 형광 현미경. 참고: 완전 확산 allantois의 CD31-양성 혈관 총의 대표 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 항 체와 같은 혈관 신경 총에 대 한 다른 마커 Flk-1, Flt에 대 한 감독 잘16넥타이 또는 넥타이-2을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

혈 청, fibronectin 같은 프로 접착제 기질 분자의 풍부한 소스는 존재 allantois explants는 다양 한 플라스틱, 유리, 또는 필터 표면9,16에 쉽게 연결 됩니다. 따라서, 수행된 분석 결과의 목표는 구체적으로 유전자 조작의 효과 조사 하는 경우 allantois 첨부 파일에 다른 치료 움직일 α4β1, 그것은 비 특정 바인딩 사이트 (예를 들어, 소 혈 청을 차단 하는 중요 한 알 부 민) 포함 하는 혈 청으로 잠복기 전에 integrin와 표면 코팅 후 미디어.
고정된 α4β1 integrin allantois explants의 초기 첨부 파일은 매우 민감한 운동, 그리고 조직 문화 접시 따라서 맡겨야 한다 그대로 미리 정해진된 기간 동안 (예를 들어, 12 h) allantois 득점 이전 첨부 합니다. Note는 ...

태 미 발달 성장과 자 궁 환경에서 개발을 위한 불가결 하지 않습니다. 그것은 내 분 비 및 면역 기관으로 산소, 대사 산물, 및 태아 및 산 순환, 그리고 또한 기능 간의 영양 교환을 위한 인터페이스를 구성합니다. Placental 발달을 손상 하는 내 인 성 또는 외 인 모욕 자궁내 성장 지체, 태아 손실, 또는 임신 합병증, 생쥐와 인간1에서 발생할 수 있습니다. 비정상적인 태 반 생리학 시키는 대상된 마우스 돌연변이의 수 증가2, 219 genotypes 현재 마우스 게놈 정보 과학 (MGI) 웹사이트에 나열 된 계속 되는 동안 (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), 기계 론 적인 관점에서 잘 이해 되지 않습니다 많은이 고기. 이외에 유전 변경, 작은 분자 약물, 단일 클론 항 체, 독 소, 병원 체, 과잉 대사 또는 다양 한 환경 요원 영향을 미칠 수 태 반 개발 및 기능3,,45 , 6 , 7. 아직, 간단한 체 외에서 태 반 개발에서 모델 중요 한 단계는 부족 한 분석 실험.
(탯의 발달 전조) allantois chorion8쪽으로 성장 하는 새싹으로 태아의 뒤 끝에서 나올 때 murine placental 개발 초기 midgestation에서 시작 됩니다. Allantoic 새싹의 외부 층에서 Chorioadhesive 셀 중재 첨부 파일 그리고 allantois chorion (chorioallantoic "퓨전")의 표면에의 확산. chorion 이후에 villi는 미로, 영양분과 산소 juxtaposed 밀접 하 게 모성 혈액 사인 및 배아 용기9 사이 교환 되 안 태 반 층을 형성 하는 allantois의 맥 관 구조 성장에 주름 ,10.
allantois의 첨부는 chorion 미로 형성에 중요 한 초기 단계 이며,이 과정에서 결함에 있는 미 발달 치 사 율의 가장 일반적인 원인 중 midgestation1. 어디 chorioallantoic 첨부 파일10, 발생을 실패 하 고 MGI 데이터베이스 현재 나열을 비정상적인 chorioallantoic 퓨전 (http:// 특징으로하는 108 마우스 돌연변이 마우스 돌연변이의 숫자는 설명 www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), 세포 상호 작용은 혈관 세포 접착 분자-1 (VCAM-1, allantoic mesoderm 표현) α4β1 integrin (chorionic mesothelium는에 표현 extraembryonic mesoderm에서 파생 된) chorioallantoic 첨부 파일 및 퓨전11,,1213불가결 것 같다. 약 배아 날 (E) 7.5 VCAM-1 allantoic 줄기의 원심 2/3 내 표현 된다 나타났습니다 Immunohistochemical 전체 산 야생-타입 배아의 얼룩13 (1-4 somite 단계), 그리고의 식을 여전히 높은 동안에 chorioallantoic 첨부 파일 및-퓨전11,12. chorion에 allantoic 첨부 파일의 오류는 일반적으로 자 궁 싹의 조직학 분석에 의해 감지 됩니다. 그러나, allantois 크기 사이와 같은 발달 단계14의 새끼 내 에서도 순수 높은 변수 이며는 allantois만 연결할 수 있는 chorion 신체 접촉 수 있도록 충분 한 크기에 도달 하는 때. 이 자연적인 변화를 반영, chorioallantoic 첨부 파일 일어난다 언젠가 사이 ~ E 8.0과 9.0 E에서 utero에서, 그리고 조직학이이 과정의 통계적으로 신뢰할 수 있는 평가의 많은 수의 분석에 의존 이므로 적절 한 발달 단계에서 충분 한 표본을 conceptuses.
여기, 우리 allantoic 첨부 파일 utero ex allantois 크기에 덜 의존 하는 평가 하는 방법을 설명 합니다. 우리 임신 쥐의 uteri에서 마우스 배아와 그들의 allantoides의 해 부를 입증 ~ 8 일 coitum 게시 (dpc; dpc 0.5 지정 질 플러그 감지), 그리고 allantois의 후속 문화 explants 고정된 α4β1에 integrins입니다. 이 메서드는 첨부 파일 및 여러 allantois explants 병렬에서 및 다른 연속 시간 점에서 확산의 급속 한, 기능 평가 수 있습니다. 프로토콜을 사용할 수 있습니다 allantois 첨부 비보 전에 대상된 돌연변이, 약물, 또는 다양 한 환경 요인의 영향에 대 한 화면으로.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 야생형 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>재고 번호:&nbsp; </td><td></td>000664</tr><tr><td>70 % (v/v) 에탄올</td><td>VWR 국제</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>표준 패턴 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>복강을 여는 데 사용되는 집게.</td></tr><tr><td>미세 해부 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 의료 생물학 팁이 세밀하고 날카로운 팁이 있습니다.</td></tr><tr><td>고급 가위&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>스트레이트 블레이드.</td></tr><tr><td>봄 가위&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>자궁 새싹 박리를 위한 14mm 날이 있는 Noyes 스프링 가위.</td></tr><tr><td>마이크로스푼</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5mm 스푼 직경.</td></tr><tr><td>Microtiter 플레이트</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>우리는 코팅되지 않은 멸균 혈관 형성 슬라이드를 사용합니다(내부 볼륨 50 &micro; L) non-&#945를 줄이기 위해 처리되지 않은 조직 배양 처리가 되지 않은 소수성 표면; 4&#946; 플라스틱에 대한 1 매개 결합.</td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>멸균 조직 배양 접시.</td></tr><tr><td>3.5cm 접시</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>멸균 조직 배양 접시.</td></tr><tr><td>대형 오리피스 피펫 팁&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>낮은 결합 피펫 팁, 200 &L.</td></tr><tr><td>&#945; 4&#946; 1 인테그린</td><td>R& D 시스템</td><td>6054-A4</td><td>쥐 &#945; 4&#946; 1 integrin은 중국 햄스터 난소 세포주에서 재조합 발현 및 정제되었습니다.</td></tr><tr><td>Ca</td><sup<td>>2+ 및 Mg<s>up2+가 없는</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td></tr><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>제형에는 포도당 4.5g/L, 피루브산 나트륨 110mg/L 및 NaHCO3 3g/L 가 포함되어 있지만 별도로 첨가되는 L-글루타민은 없습니다.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL 페니실린 및 10,000 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신) 원액.&nbsp; -20 &deg에서 부분 표본을 준비하고 보관하십시오. C는 동결/해동을 방지합니다.</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) 원액. -20 &deg에서 부분 표본을 준비하고 보관하십시오. C는 동결/해동을 방지합니다.</td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>우리는 열 비활성화 FBS (56 &deg; C를 30분 동안 혼합하여 보체를 비활성화).</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>우리는 프로테아제와 지방산이 없는 알부민을 사용합니다. DMEM에서 0.1%(w/v) 용액을 준비합니다. 멸균 필터는 0.22 &micro의 일회용 세포 배양 필터를 통해 용액을 여과합니다. m 공극 크기와 낮은 단백질 결합 막, -20 °C에서 부분 표본을 저장합니다.</td></tr><tr><td>para-포름알데히드</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>PBS에서 포름알데히드 용액을 만들려면 환기 후드에서 para-포름알데히드 분말의 무게를 달고 ca. 60°C로 예열된 PBS에 첨가합니다. C를 교반 접시에 비커에 넣습니다. 용액이 제거될 때까지 1N NaOH를 적가적으로 추가합니다. 용액을 실온으로 식히고 0.22mm 필터 주사기를 통해 걸러냅니다. 희석된 HCl로 pH를 약 6.9로 조정하고 PBS로 최종 부피로 조정합니다. 우리는 용액을 분취하고 동결하지만 4°C에서 저장할 수도 있습니다. C는 약 4주 동안.&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>광폭 오리피스 피펫 팁을 사용하여 희석되지 않은 Triton X-100을 처리합니다.</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>면역형광 분석에서 항체의 비특이적 결합을 차단합니다.</td></tr><tr><td>&#945;-CD31 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>정제된 쥐 항마우스 단클론 항체, 클론 MEC 13.3.</td></tr><tr><td>2차 염소 항쥐 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>염소 항쥐 IgG(중쇄 및 경쇄), 교차 흡착, Alexa Fluor 488로 형광 표지. 다른 형광 라벨도 가능합니다.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>세포화학용 마운팅 배지. MW ~31,000</td></tr><tr><td>라보베르트&nbsp;</td><td>라이츠</td><td>라보베르트&nbsp;</td><td>솜테 쌍 계수를 위한 4 x 및 10 x 대물렌즈가 장착된 도립 위상차 현미경. 다른 위상차 현미경(예: 조직 배양에 일상적으로 사용되는 현미경)도 적합합니다.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>배아 및 알란토이 해부를 위한 8:1 줌 범위(7.5배에서 60배 사이의 배율)를 가진 실체현미경.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>LED 조명이 있는 조직학용 현미경 시스템. 당사는 HCX, PL, FLUOTAR 5 x/0.15 및 HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 대물렌즈를 사용합니다. 위상차 및 형광 광학이 장착된 다른 현미경을 사용하여 알란토이스 부착을 채점할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr>DM4000B LED 현미경에 부착 된 <td>디지털 카메라</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD 디지털 캡처 카메라. 우리는 Diskus 소프트웨어(Hilgers)를 사용하여 현미경과 카메라를 모두 작동합니다.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>컨포칼 현미경은 allantois explants의 혈관 신경총에 있는 내피의 고해상도 이미징을 위한 것입니다. 면역형광 이미지는 40 x 대물렌즈로 촬영했습니다.</td></tr></tbody></table>

해 부와 allantoic 첨부 파일의 생체 외에서 분석 murine allantois explant 문화

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

태 반 포유류 배아의 개발과 성장을 위해 필수적 이다. 이러한 이유로 수많은 유전 변경 및 태 반 개발 또는 기능을 방해 하는 가능성이 또한 환경 모욕 쥐와 인간에서 이른 임신 손실을 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 태 반 형성에 미치는 잠재적 영향에 대 한 화면 분석 간단한 체 외에 부족 합니다. 여기, 우리는 allantois의 첨부는 chorion 이루어져 있는 태 반 형성에 중요 한 첫 번째 단계를 모델링에 초점. 빠르게 움직이지 α4β1 integrin chorio 모방 기판 역할에 allantoic explants의 첨부 파일을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 생체 외에서 이렇게 하면 첨부 파일 및 확산 다른 연속 시간 포인트에서 여러 allantois explants의 동작의 질적 평가 수 있습니다. 타겟된 마우스 돌연변이, 약물, 또는 임신 합병증 이나 allantois 첨부 ex vivo에태아 손실에 연결 된 다양 한 환경 요인의 효과 조사 하는 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜 murine allantoides ex vivo, explant를 격리 하는 방법을 설명 하 고 chorioallantoic 융합 vivo에서 동안 α4β1 integrin allantois 첨부, 중요 한 프로세스의 질적 평가 자세히 설명. 그림 1A-H 에서 대표적인 결과 allantois 격리 임신 자 궁에서 시작의 연속 단계를 보여 줍니다. 자 궁 뿔, 지방 조직 등 선박 (그림 1A)를 둘러싸고 모성 조직 제거 되 고 태아는 자 궁 근육 레이어 (그림 1B-개방 후 단계별 방식에서 endometrium에서 해 부 E). 그 후, 정수 리 ...

생체 외에서 시험 모델 chorioallantoic 첨부 파일, 태 반 형성의 첫 번째 단계를 설명합니다. 프로토콜에 고정된 α4β1 integrin murine allantoides의 해 부 및 explant 문화를 보여 줍니다. 미리 정해진된 시간 포인트 allantois 첨부 현미경으로 평가 됩니다.

해 부와 Allantoic 첨부 파일의 생체 외에서 분석 Murine Allantois Explant 문화

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

이 절차의 전반적인 목표는 in vitro 알란토스 부착 분석을 위한 쥐 알란투아의 해부 및 이식 배양입니다. 이 방법은 태반 형성을 위한 동종 부착 조절과 같은 포유류 배아 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외에서 태반 형성의 첫 번째이자 중요한 단계를 모델링한다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Kerstin Hadamek입니다. 플레이트를 설정하려면 먼저 갓 만든 Alpha 4/Beta 1 인테그린 용액 20마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 우물당 하나의 알란투아를 계획하십시오.기포가 있는 용액을 침전하지 마십시오., 적절한 코팅을 방해합니다. 웰을 넣은 후 가습 인큐베이터에서 한 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 플레이트를 비스듬히 유지하면서 웰에서 상층액을 흡인하여 피펫이 웰 바닥을 건드리지 않고 용액을 부드럽게 빨아들일 수 있도록 합니다.다음으로, 50 마이크로 리터의 따뜻한 배양 배지를 사용하여 우물을 두 번 씻으십시오. 세척 매체를 제거할 때는 부드러운 흡입을 사용하십시오. 각 웰에 50마이크로리터의 블록 용액을 도포합니다.그런 다음 필요할 때까지 최소 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 알랑투아 외식은 매우 끈적합니다. 따라서 블록 단계는 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다.임신한 쥐를 희생한 후 복부를 70% 에탄올로 소독합니다. 그런 다음 가위로 정중선을 작게 절개하여 복부 피부를 엽니다. 장갑을 낀 손가락을 사용하여 절개 부위 위와 아래의 피부를 잡고 마우스의 가슴과 꼬리 쪽으로 피부를 당겨 분리합니다.이제 집게로 복막을 잡고 다른 손으로 앞쪽에서 뒤쪽으로 V자 모양으로 절개합니다. 복강에 접근하기 위해 조직을 이동한 다음 자궁에 접근하기 위해 장을 옆으로 밀어 넣습니다. 이제 두 개의 자궁 뿔을 찾습니다.자궁경각의 꼬리 부분인 집게로 자궁경부를 잡고 가는 가위를 사용하여 인대를 자릅니다. 그런 다음 가위로 난관을 절단하여 양쪽 자궁 뿔을 분리한다. 일단 분리되면 집게를 사용하여 실온 PBS가 들어 있는 10cm 접시에 자궁을 옮깁니다.접시에서 가느다란 집게와 용수철 가위를 사용하여 자궁 뿔을 둘러싼 지방 조직, 혈관 및 신경을 제거합니다. 그런 다음 배아의 미세 해부를 진행합니다. 8:1 줌 범위의 실체 현미경으로 배아 해부를 수행합니다.가위로 착상 부위 사이를 잘라 배아를 분리하는 것으로 시작합니다.

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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해 부와 Allantoic 첨부 파일의 생체 외에서 분석 Murine Allantois Explant 문화

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