CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

이 실험의 전반적인 목표는 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 활용하여 사이토카인 의존성 조혈 세포의 칼레티큘린 돌연변이를 모델링하여 발암 활성을 연구하는 것입니다. 이 방법은 생리학적 수준에서 발현될 때 드라이버 돌연변이의 생물학적 기능과 같은 혈액학적 악성 종양 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 활용하여 암과 관련된 유전자의 생물학적 기능을 모델링하고 연구한다는 것입니다.

올리고를 어닐링 및 인산화하려면 얼음 위에 보관된 PCR 튜브에 총 10마이크로리터에 시약을 추가합니다. thermocycler에서 프로그램을 설정합니다. 사이클이 완료된 후 물을 사용하여 반응을 희석하십시오.

렌티가이드-퓨로 벡터를 분해하려면 50마이크로리터의 소화기 반응을 준비합니다. 그런 다음 열 블록에서 섭씨 55도에서 소화 반응을 시작합니다. 1시간 후, 마이크로리터의 BsmB1 제한 효소를 추가로 첨가하고 또 한 시간 동안 반응을 계속합니다.

절단된 뼈를 탈인산화하려면 7마이크로리터의 인산가수분해효소 반응 완충액과 2마이크로리터의 인산가수분해효소를 소화 벡터에 추가합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 이미 절단되고 탈인화된 허리 뼈를 상업용 키트를 사용하여 정제합니다.

결찰 혼합물을 준비하려면 얼음에 보관된 PCR 튜브에 15나노그램의 소화된 등뼈 및 기타 시약을 넣고 물과 함께 부피를 10마이크로리터로 조정합니다. 반응을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 STBL3 호환 세포를 2마이크로리터의 결찰 혼합물로 형질전환시킵니다.

그런 다음 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램이 들어 있는 용원 육수 한천 플레이트에 플레이트를 놓습니다. 그 후, 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 3개의 군체를 선택하여 접종하십시오.

각 배양에 대해 미니 전처리를 수행하고 U6 프로모터 영역 프라이머로 올리고 삽입 부위를 염기서열분석합니다. 10cm 접시에 hek293t 세포를 씨를 뿌립니다. 그리고 하룻밤 부화를 위해 그대로 두십시오.

transfection을 위해 DNA 혼합물을 준비하려면 45마이크로리터의 transfection 시약을 DNA에 피펫으로 주입합니다. 피펫을 사용하여 DNA와 transfection 시약을 조심스럽게 혼합하고 20분 동안 그대로 둡니다. 그 후, DNA 형질주입 혼합물을 시딩된 세포에 적하 방향으로 첨가합니다.

접시를 부드럽게 소용돌이칩니다. 그리고 하루 동안 5 % 이산화탄소와 섭씨 37도에서 배양하십시오. 상층액이 함유된 바이러스는 24시간 및 48시간 후에 0.22 마이크로마이터 필터를 통과시켜 수확합니다.

그리고 각 극저온 바이알에 1.6ml의 상층액을 분취합니다. 다음으로, 상층액을 흡인하고 세포를 위아래로 여러 번 피펫팅하여 배지에서 Ba/F3 세포를 재현탁합니다. 재현탁 세포 500마이크로리터, 바이러스 상등액 1.5ml, 폴리브레렌 4마이크로리터, 쥐 인터루킨 3 밀리리터당 10나노그램을 6웰 조직 배양 플레이트에 추가합니다.

플레이트를 440G에서 섭씨 37도에서 120분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 섭씨 37도에서 5%이산화탄소로 하룻밤 배양합니다. 그런 다음 440G에서 3분 동안 세포를 회전시킵니다.

그리고 6 개의 웰 플레이트에 5 밀리리터의 신선한 따뜻한 매체에 재현 탁합니다. Cas9에 감염된 세포를 선택하려면 먼저 세포를 스핀다운합니다. 그런 다음 감염 48시간 후에 밀리리터당 5마이크로그램의 블라스티시딘이 보충된 신선하고 따뜻한 배지에 재현탁합니다.

감염되지 않은 모든 세포가 죽을 때까지 9일 동안 blasticidin으로 세포를 계속 선택합니다. 그런 다음 저항성 세포를 블라스티시딘 밀리리터당 1마이크로그램이 있는 배지로 옮깁니다. 렌티바이러스 감염을 통해 pXPR-011 reporter construct로 Cas9를 안정적으로 발현하는 모세포와 세포를 transduction.

감염 후 48시간 동안 3일 동안 밀리리터당 2마이크로그램의 퓨로마이신이 함유된 세포를 계속 선택합니다. 렌티바이러스를 사용하여 Cas9 발현 세포를 단일 가이드 리보핵산으로 감염시킵니다. 그런 다음 퓨로마이신 1밀리리터당 2마이크로그램을 사용하여 감염 후 48시간 동안 3일 동안 세포를 선택합니다.

기하급수적으로 성장하는 이소성 Cas9를 발현하는 Ba/F3 세포와 관심 있는 단일 가이드 리보핵산을 비닝합니다. 상층액을 흡인하고 5ml의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척합니다. 세포를 회전시키고 인산염 완충 식염수로 세 번 씻습니다.

그런 다음 세포 생존도 분석기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 그 후, 3 개의 종자 세포는 6 개의 웰 배양 플레이트에서 인터루킨 3이없는 2 밀리리터의 신선한 배지에서 생성된다. 8일 동안 이틀에 한 번씩 세포를 모니터링하고 계수하기 시작합니다.

부모 Ba/F3 세포에서 Cas9 활성과 Cas9 세포를 과발현하는 Ba/F3를 보여주는 대표적인 유동 심리 측정 데이터가 여기에 나와 있습니다. 녹색 형광 단백질 신호는 Cas9 세포를 과발현하는 Ba/F3에서 76% 감소하여 강력한 Cas9 활성을 나타내는 반면, 부모 Ba/F3 세포에서는 녹색 형광 단백질 신호가 100% 유지칼레티큘린의 발암 활성을 나타내는 세포의 대표적인 성장 곡선을 나타냅니다. CRISPR/Cas9 매개 및 1개 염기쌍 프레임 이동 돌연변이는 m1 및 m2 단일 가이드 RNase를 사용하여 칼레티큘린의 엑손 9개 자리에 도입되었습니다.

칼레티큘린 표적 Ba/F3 트롬보포이에틴 수용체 Cas9 세포의 성장 곡선은 쥐 인터루킨 3 독립적 성장을 보여줍니다. 그러나 다른 세포 유형에 대한 성장 곡선은 사이토카인 독립적 성장을 나타내지 않습니다. 염기서열분석 결과는 m1 및 m2 단일 가이드 RNase를 사용하여 calreticulin targeted Ba/F3 thrombopoietin receptor Cas9 세포에서 endogynous calreticulin exon nine의 표적 편집을 확인합니다.

플러스 1 염기 쌍 프레임 이동 돌연변이는 검은색으로 표시됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 관심 유전자의 어떤 종류의 돌연변이가 원하는 표현형의 원인이 될 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라, 세포 신호 전달 또는 단백질 단백질 상호 작용에서의 역할과 같은 돌연변이를 추가로 특성화하는 다른 방법을 수행하여 질병을 유발하는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 Ba/F3 조혈 세포의 세포 변형에 대한 생리학적 수준의 기능 이득 돌연변이의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 방법론을 활용하여 사이토카인 의존성 조혈 세포에서 gain-of-function 돌연변이의 발암 활성을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

렌티바이러스로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 BL2 plus 시설에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.