Name: 포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 배우세요 보리 알레우론 세포에서 입자 폭격법을 이용한 유전자 발현 측정 방법을. 자동화된 곡물 분쇄와 96웰 플레이트 효소 분석을 결합하여 처리량을 높이고, 식물 호르몬 조절 유전자 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 실험, 곡물 균질에 대 한 조언 주 디 돌 및 fluorometry에 대 한 조언 린 Hannum 수행에 대 한 도움 Greyson 버틀러와 마가렛 배 럿을 감사 합니다. 이 작품은 기관 개발 수상 (IDeA는) 국립 과학 연구소에서의 일반 의료 보조금 번호 P20GM0103423, 건강의 국가 학회에 의해 그리고에서 교부 금에 의해 국립 과학 재단 (IOB 0443676)에 의해 지원 되었다 Colby 대학 자연 과학의 사단입니다.

1. 준비 이펙터와 취재 원 유전자의 구성
<ol><li>원하는 열려있는 독서 프레임에서 드라이브 식 제정 발기인 (예: 옥수수 유비퀴틴, UBI)를 사용 하는 이펙터 구조를 빌드하십시오. 예를 들어 드라이브 TaABF15의 강한 제정 식 UBI::TaABF1 를 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.</li>
	<li>거 스같은 열려있는 독서 프레임의 업스트림 배치 기자 구조 측정, 그 활동은 발기인을 포함 하는 빌드. 예를 들어 HVA1::GUS HVA1 발기인2,5에서 측정을 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.</li>
	<li>내부 제어 구조를 구축 (예: UBI::luciferase).</li>
	<li>실리 카 바인딩 열을 사용 하 여 프로토콜 ( 재료의 표참조), 각 필요한 유전자 구조에 대 한 높은-품질 플라스 미드를 준비. 자외선 분광학을 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 신중 하 게 각 플라스 미드 준비의 농도 측정.</li>
</ol>2입니다. 보 리 곡물의 준비 사격에 대 한
<ol><li>스프레드시트를 설정 (예를 들어 그림 1 참조) 포 격 될 것 이다 플라스 미드, 적절 한 호르몬 치료 및 실험의 일부가 될 것입니다 각 치료에 대 한 기타 관련 정보를 나타내는.</li>
	<li>히말라야 보 리는 (실험에 포함 하는 각 치료에 대 한 40)의 곡물에서 배아를 잘라 절단 보드를 사용 하 여 살 균 면도날. 변색 또는 실질적으로 평균 보다 작은 알갱이 제외 합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 모든 embryoless 곡물을 놓습니다. 10 분 동안 물과 바위의 40 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 ()을 피하기 위해 곡물을 잃고 물에 밖으로 부 어과 10% 표 백제의 40 mL를 추가. 20 분 동안 바위입니다.</li>
	<li>표 백제에 밖으로 부 어과 메 마른 물 40 mL를 추가. 5 분 동안 바위입니다. 이 메 마른 물 세척 4 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>40 mL Imbibing 솔루션 (20 m m 나트륨 호박, 20 m m 칼슘 염화 물, pH 5.0)의 추가 페니 재고 솔루션 (10 mg/mL)의 40 μ.</li>
	<li>질 석 접시에 튜브에서 Imbibing 솔루션 (페니)의 대부분을 전송 ( 재료의 표참조). 그런 다음 전송 Vermiculite 접시에 젖은 필터 종이의 표면에 곡물. 곡물에 밖으로 균등 하 게 퍼졌다. 충분 한 imbibing 솔루션을 부분적으로 (하지만 완전히)는 곡물을 계속 부 어 침수. 질 석 판 위에 뚜껑을 놓습니다.</li>
	<li>형광 조명에 대해 48 h 24 ° C에서 embryoless 곡물을 품 어. 필요에 따라 추가 Imbibing 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>90 m m 플라스틱 페 트리 접시를 열고 거꾸로 뚜껑으로 자체와 20 mL 접시에 Imbibing 솔루션의 20 mL를 붓는 다. 각 페니 (10 mg/mL)의 20 μ를 추가 합니다. 알코올에 그들을 담거 서 좋은 포인트 집게의 두 쌍을 소독.</li>
	<li>페 트리 접시의 뚜껑으로 embryoless 곡물의 몇 가지를 놓습니다. 부드럽게는 집게를 사용 하 여 각 곡물에서 (투명) 씨 외 투를 제거 합니다. 곡 식의 부드러운 측면에서 씨 외 투를 제거 하는 동안 기본 (aleurone) 세포를 손상 하지 마십시오. 벗 겨 곡물 Imbibing 솔루션을 포함 하는 배양 접시에 전송.</li>
	<li>모든 곡물의 씨앗 외 투, 필 링 후 Vermiculite 접시에 그들을 반환 합니다. 16-20 시간 24 ° C에서 벗 겨 embryoless 곡물을 품 어.</li>
	<li>그냥 사용 하기 전에 곡물 폭격에 대 한, 페 트리 접시에 필터 논문 사이 그들을 흔들어 표면 수 분을 제거 합니다.</li>
</ol>3입니다. 사격에 대 한 플라스 미드 DNA의 준비
<ol><li>1.5 mL 튜브 사격 실험에 포함 될 각 치료에 대 한 레이블을 지정 합니다. 각 튜브를 유비의 2.5 µ g 추가::luciferase 내부 제어 플라스 미드, 거 스 기자 플라스 미드와 이펙터 플라스 미드의 원하는 금액 (2.5 µ g 일반적으로 0.025 µ g) 2.5 µ g. 총 볼륨 5 µ L을가지고 물을 추가 합니다.</li>
	<li>1.6 µ m 금 microcarriers ( 재료의 표참조)를 준비 다음 게시 프로토콜6.</li>
	<li>각 치료에 대 한 플라스 미드 DNA를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 일시 중단 된 microcarriers의 50 µ L를 추가 합니다. 제조 업체의 프로토콜6에 플라스 미드 DNA와 microcarriers를 코트.</li>
	<li>마지막 단계에서 플라스 미드 코팅 microcarriers 48 µ L 100% 에탄올, 5 macrocarriers의 각각에 정지 microcarriers의 피펫으로 8 μ에에서 일시 중단 되 고 공기에 그들을 허용 하는 때 건조.</li>
</ol>4. Embryoless 보 리 곡물의 입자 사격
<ol><li>( 재료의 표참조) 입자 사격 장치 설정6.</li>
	<li>1550 psi 파열 디스크를 고정 캡에 놓고 악기에 마운트 합니다.</li>
	<li>(정지 화면) 함께 원하는 플라스 미드 조합을 포함 하는 macrocarrier microcarrier 실행 어셈블리에 놓습니다. 어셈블리 사격 챔버의 상단 슬롯에 삽입 합니다. 모자 및 표준 거리 (6 m m)에서 macrocarrier 커버 뚜껑 파열 디스크 사이의 거리를 설정 하 고 수 있도록 11 밀리미터 (그림 2A)의 macrocarrier 여행 거리 (표준) 중간 위치에서 정지 화면 지원 장소.</li>
	<li>정렬 꽉 방사형 패턴에서 8 embryoless 곡물 (얇은 끝 안쪽으로 가리키는) 평면 90 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 아래로 녹화 필터 종이 동그라미에 ( 그림 2B참조).</li>
	<li>중지 화면에서 6 cm의 거리에서 사격 챔버로 곡물을 가진 접시를 놓습니다.</li>
	<li>95 인민군을 폭격 챔버를 철수 하 고 샘플을도 배.</li>
	<li>진공을 해제 한 후 포 격하 곡물 Imbibing 솔루션 페니의 1 mg/ml를 포함 4 mL를 포함 레이블이 60 m m 페 트리 접시에 전송.</li>
	<li>사격의 모두 완료 될 때까지 반복 합니다. 24 시간 동안 24 ° c (100 rpm에서 떨고 플랫폼)에서 품 어.</li>
</ol>5. 포 격하 곡물에서 수용 성 단백질의 추출
<ol><li>집게를 사용 하 여, 60 mm 페 트리 접시에서 8 포 격하 곡물을 제거 하 고 그들을 종이 타월에 건조 되 리. 나눌 알갱이 두 레이블이 2.0 mL 튜브 (튜브 당 4 곡물) 각 800 μ 연 삭 버퍼 (100 m m 나 인산 염 pH 7.2, 5mm DTT, 10 µ g/mL leupeptin, 20% 글리세롤)와 5 m m 스테인리스 구슬. 포 격하 곡물의 모든에 대해이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>(최대 48) 2.0 mL 튜브 비드 균질 화기의 두 개의 선반에 배치 ( 재료의 표참조). 랙에 균질 화기에 탑재 합니다.</li>
	<li>3 분 30 Hz에서 샘플을 흔들어.</li>
	<li>균질 화기에서 균질 화기 선반을 제거 하 고 샘플을 다시 얼음 (5 분)에 그들을 배치.</li>
	<li>균질 화기-반대 방향에서에서 다시 랙에 탑재 합니다. 흔들어 샘플 다시 30 Hz에서 3 분.</li>
	<li>그런 다음 얼음, 랙 냉각 5.5 단계 5.3를 반복. 이 떨고의 12 분의 총에 추가 됩니다.</li>
	<li>10 분간 4 ° C에서 16000 x g에서 곡물 추출 물 원심</li>
	<li>
즉시 후에 원심 분리, microcentrifuge 튜브의 두 번째 세트에 분명 supernatants를 가만히 따르다. 빠른 소용돌이 각 튜브를 제공 합니다. 얼음에 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>세척 하 고 다시 사용할 수 있도록는 상쾌한 전송 후 펠 릿에서 강철 구슬을 복구 합니다.</li>
</ol>6. 곡물 추출 물에서 Luciferase 활동의 측정
<ol><li>분석 수로 곡물 추출의 각 관에 대 한 준비 Luciferase 분석 결과 혼합물의 200 μ를 포함 12 m m x 75 m m 유리 테스트 튜브 (45 m m Tris 황산 pH 7.7, 15 m m MgCl2, 20 mM DTT, 1.5 m m EDTA, 소 1 m m, 1mm ATP).</li>
	<li>첫 번째 분석 결과 튜브를 첫 번째 곡물 추출 물 100 μ를 추가 합니다. 잘 혼합을 신속 하 게 소용돌이. 즉시 는 루미 노의 튜브 홀더 튜브를 삽입 하 고 문을 닫습니다. 측정 완료 되 면 다음 튜브의 배치를 위해 문을 열어두고-루미 노에서 튜브를 제거 합니다.</li>
	<li>이 프로세스를 반복 하 여 모든 샘플 측정 되었습니다.</li>
</ol>7. 곡물 추출 물에서 GUS 활동의 측정
<ol><li>96 잘 접시의 각 음에 거 스 분석 결과 버퍼 (50 m m 나 인산 염 pH 7.2, 2.5 m m 4-methylumbelliferyl-D glucuronide 10mm DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptin, 20% 메탄올, 0.02% 나트륨 아 지 드)의 200 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>각 곡물의 장소 50 μ 잘 해당 추출 합니다. 추가 팁과 혼합. 씰링 필름으로 최고 봉인.</li>
	<li>20 시간 동안 어둠 속에서 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어.</li>
	<li>96 잘 접시 4 ° C에서 4000 x g에서 10 분간 원심 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>블랙 96 잘 접시의 각 음에 0.2 M 나2CO3 의 250 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>해당 각 centrifuged 거 스 분석 결과 혼합물의 6.25 μ 추가 잘 (포함 0.2 M 나2CO3) 블랙 96 잘 접시. 추가 팁과 혼합. 기준으로 10 μ M, 40 μ M, 그리고 100 μ M 4-methylumbelliferone의 6.25 μ와 웰 스를 포함 한다.</li>
	<li>플레이트 fluorometer에 검은 접시를 놓고 methylumbelliferone의 형광을 읽고. 360의 여기 파장에서 수치를가지고 nm 그리고 460의 방출 파장 nm. 40 μ M 4-methylumbelliferone의 잘 포함 6.25 μ와 0.2 M 나2CO3 의 250 μ 제공 1000 형광 단위의 읽기 같은 악기의 이득을 설정 합니다.</li>
</ol>8. 데이터 분석
<ol><li>스프레드시트에 luciferase 및 거 스 분석 실험에 대 한 값을 입력 합니다. 이 유전자 구조 aleurone 셀에 성공적으로 배달 되지 않은 나타냅니다 모든 샘플의 20000 상대 발광 단위의-1보다 낮은 luciferase 읽기와 고려 대상에서 제외 합니다.</li>
	<li>각 성공적으로 포 격하 곡물 추출 (4 embryoless 곡물의 그룹 대표), 다음과 같이 원시 거 스와 luciferase 데이터에서 정규화 된 거 스 식 계산: 거 스 정규화 = [(거 스 식-거 스 빈) (2000000) x] / (luciferase 식-빈 luciferase)입니다. 참고:이 무슨 2000000의 luciferase 독서를 준 사격에서 관찰 되어 거 스 활동의 금액을 정규화 합니다.</li>
	<li>이펙터 구문 또는 호르몬 치료 이펙터 또는 호르몬의 부재에 식의 수준에 비교 하 여 테스트 되 고 있을 때 특정 기자 구문 식의 상대적 수준을 보고 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이펙터 유전자의 도입 구성 입자 사격을 통해, 해 부 결과 호르몬 조절 유전자와 조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할에 대 한 귀중 한 전략은 과도 식 기자 구문 뒤 식입니다. 그러나, 보 리 aleurone 셀2,3,,45,6 에서 같은 실험 수행에 대 한 기존 프로토콜은 매우 노동 집약 이다. 각 그룹의 폭격 겨우 곡물 손 박격포와 유 봉, 무 균 이어야 하며 결과 추출 거 스와 luciferase 활동에 대 한 개별적으로 분석 됩니다. 현재 프로토콜은 따라서 같은 실험에 포함 될 수 있으며 합리적으로 각 치료에 대 한 포함 될 수 있는 생물 복제의 수를 제한 하는 별도 처리의 수를 제한 합니다. 이러한 제한은 어려워질 더 포괄적...

보 리 aleurone 레이어 식물1호르몬 통제 유전자 발현의 학문을 위한 기초가 튼튼한 모델 시스템입니다. 특히, 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 발 아 또는 초기 종묘 개발에 필요한 유전자의 수 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 경로 고리로 연결 되었다는, 일부가 활성화 유전자의 표정을 ABA와 반대로1저해로.
조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할 입자 사격, 기자 구문에 효과 허용 하는 과도 식으로 다음을 통해 이펙터 유전자 구조 도입 되었습니다 이해를 위한 중요 한 전략 다운스트림 유전자 식 결정 됩니다. 거 스 (β-glucuronidase) 등 Luciferase 리포터 유전자를 사용 하 여 특별히 이펙터 구조 받은 셀 내에서 유전자 발현의 과민 하 고 양적 측정을 수 있습니다. 예를 들어 녹음 방송 요인 TaABF15,6 인코딩 이펙터 구문의 도입 HVA1 같은 ABA 유발 유전자는 Amy32b 같은 유전자가 유도 하는 동안 TaABF1에 의해 유도 된 설립 억 누른 다. 입자 사격 실험 전략으로 조지아/ABA 신호의 다양 한 측면을 조사 하기 위해 여러 실험실에 의해 사용 되었습니다. 같은 일이 유도2 및 ABA 유도 유전자3, 활성화에 대 한 중요 한 발기인 요소의 식별 하 고 단백질 kinases4 의 발견을 주도하 고 있다 및 녹음 방송 요인5 규제는 이 유전자의 표현입니다.
기존 프로토콜2,3,,45,입자 사격 및 일시적인 유전자 발현의 후속 측정에 대 한6 는 아주 노동 집약, 각 세트의 포 격으로 간신히 곡물은 박격포 및 방 앗 공이에서 손으로 무 균 그리고 효소 분석 실험 개별적으로 수행 됩니다. 이 원고를 보고 부분적으로 자동화 하 고 균질 단계를 능률화 하는 향상 된 프로토콜 및 동일한 실험에서 테스트 하는 치료의 많은 수를 허용 훨씬 더 많은 처리량을 허용 하도록 분석 실험은 거 스는 또는 더 많은 통계적으로 강력한 결과를 얻을 각 치료에 대 한 더 많은 복제의 포함. 대표 결과 GA, ABA, 및 다른 규제 분자 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 TaABF1에 의해 통제 하는 HVA1 및 Amy32b 기자 구문, 표현에 대 한 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP 플라스미드 Maxiprep 키트</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis 분광 광도계</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>히말라야 보리 곡물</td><td></td>/<td>/</td><td>다양한 껍질 없는 보리(4°C에서 어둠 속에 보관; C)</td></tr> <tr><td>숙신산 나트륨</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>흡수 용액 용 시약</td></tr><tr><td>염화칼슘 (이수화물)</td> <td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>흡수</td></tr><tr><td>용액</td><td>수용 용액 가정용</td><td></td> / <td>20 mM 숙신산 나트륨, 20 mM 염화칼슘, pH 5.0. 사용하기 전에 오토클레이브로 살균하십시오.</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마</td><td>C0378</td><td>70% 에탄올에 10mg/mL 원액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>질석</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>질석 플레이트에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>여과지 서클 (90mm)</td> <td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>질석 및 포격 전 곡물 준비에 사용</td></tr><tr><td>질석 플레이트</td><td>집에서 만든</td> <td>/</td> <td>유리 페트리 접시에 질석 50mL를 추가합니다. 질석 위에 90mm 종이 원을 놓습니다. 오토 클레이 브.</td></tr><tr><td>집게(뾰족한)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>보리 곡물에서 종피를 제거하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>겸자(초미세점)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>보리알에서 종피를 제거하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>금 마이크로캐리어(1.6 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarriers</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(이수화물)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>2.5 M 원액을 준비하고 -20°C에서 1 mL 분취액을 보관합니다.</td></tr><tr><td>spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>100mM 원료 용액을 준비하고 500μ를 저장합니다. L 분취량은 -20&deg; C (2 개월 이내 사용).</td></tr><tr><td>Rupture Discs (1550 psi)</td><td></td> <td>BioRad</td> 1652331 <td></td></tr><tr><td>정지 스크린</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>macrocarrier 홀더</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic 입자 전달 시스템</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>1M 인산나트륨 pH 7.2</td></tr><tr>용 시약<td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>S9763</td><td>1M 인산나트륨 pH 7.2</td></tr><tr><td>1M 인산나트륨 pH 7.2</td><td>가정용</td> <td>시약/</td><td>인산나트륨 일염기성 일수화물 6.9g과 인산나트륨 이염기성 7.1g을 결합합니다. 100mL에 물을 넣으십시오. NaOH를 첨가하여 pH 7.2를 얻습니다.</td></tr><tr><td>디티오트리에톨 (DTT)</td><td>시그마</td><td>43819</td><td>1 M의 물에 녹여 -20°C;에서 1 mL의 분취액에 보관합니다.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>10mg/mL까지 물에 녹입니다. -20°C에 저장하십시오. C.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td>물에 50% 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>분쇄 버퍼</td><td>홈 메이</td><td>드/</td><td>1 M 소듐 포스페이트 pH 7.2, 500 10 mL 결합; 1M DTT의 L, 100 &mu; L 10mg/mL 류펩틴 및 40mL의 50% 글리세롤. 100mL에 물을 넣으십시오.</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비드 (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>이 특정 튜브 모델은 균질화기와 함께 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>비드 균질화기 (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75mm 유리 시험관</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>25mM 원액을 준비하고 -20°C에서 1mL 분취액을 보관합니다.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마</td><td>A7699</td><td>100 mM 재고 용액을 준비하고 250 μm를 저장하고; L 분취량은 -20&deg; &nbsp;C입니다.</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마</td><td>T1503</td><td>1M 트리스 설페이트 pH 7.7용 시약.</td></tr><tr><td>황산</td><td>시그마</td><td>258105</td><td>1M 트리스 황산염 pH 7.7 용 시약.</td></tr><tr><td>1M 트리스 설페이트 pH 7.7</td><td>홈 메이</td><td>드/</td><td>12.1g 트리스 염기를 물 100mL에 용해시킵니다. 황산으로 pH를 7.7로 조정합니다.</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td></td><td>Sigma M9397</td><td>2m까지 물에 용해시킵니다.</td></tr><tr><td>Luciferase 분석 버퍼 (LAB)</td> <td>집에서 만든</td><td>/</td><td>1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &mu 3 mL 결합; L 2M 염화마그네슘, 1M DTT 1mL 및 200μ; 0.5M EDTA의 L. 50&nbsp에 물을 추가하십시오. 밀리리터.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Mixture</td><td>집에서 만든</td><td>/</td><td>LAB 15mL, 800 &mu 결합; 25 mM 루시페린의 L, 200 &mu; L 100mM ATP 및 물 4mL. 이것은 충분한 분석 혼합물을 만듭니다(20&nbsp; mL)를 사용하여 100개의 루시퍼라제 분석을 수행할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>광도계 (Sirius)</td><td>Berthold</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>4-methylumbelliferyl-&beta; -D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>DMSO에서 100mM까지 용해</td></tr>.<tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마</td><td>S8032</td><td>물에 2% 원액을 준비하고 -20°C에서 1mL 분취액을 보관합니다.</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 (표준)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS 분석 버퍼</td><td>집에서 만든</td><td>/</td><td>MUG 2.5 mL, 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 &mu 5 mL 결합; L 0.5 M EDTA, 1 mL 1 M DTT, 100 &mu; L의 10mg/ml 류펩틴, 20mL의 메탄올 및 1mL의 2% 아지드화나트륨. 100mL에 물을 넣으십시오.</td></tr><tr><td>TempPlate 밀봉 필름</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트(검정색)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>물에 200mM 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>시그마</td><td>M1381</td><td>100 &mu를 준비하십시오; 물에 M 용액. -20°C에서 1mL 부분 표본을 동결합니다. &nbsp;C입니다.</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 형광 리더</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

포 격하 보 리 aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

보 리 곡물의 aleurone 레이어 식물에서 호르몬 통제 유전자 발현에 대 한 중요 한 모델 시스템입니다. Aleurone 세포에서 유전자 발 아에 필요한 또는 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 초기 종묘 개발 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 메커니즘은 효소 분석 실험을 사용 하 여 측정 결과 과도 식으로 입자 사격을 통해 aleurone 세포로 리포터 유전자 구조를 도입 하 여 심문 수 있습니다. 향상 된 프로토콜을 부분적으로 자동화 하 고 간소화 곡물 균질 단계 및 효소 분석 실험 보고는 기존의 방법 보다 훨씬 더 많은 처리량을 허용. 균질 곡물 샘플 자동된 조직 균질 화기를 사용 하 여 밖으로 실행 되 고 거 스 (β-glucuronidase) 분석 실험 96 잘 접시 시스템을 사용 하 여 실시 됩니다. 프로토콜을 사용 하 여 대표 결과 phospholipase D 활동 ABA, 녹음 방송 요인 TaABF1 통해 HVA1 유전자 식의 활성화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 것이 좋습니다.

여기에 설명 된 기술은 보 리 곡물의 aleurone 세포로 어떤 테스트 유전자 구조를 소개 사용할 수 있습니다. 테스트 유전자 발현의 수준 다음 있을 수 있습니다 (그림 2)를 편리 하 게 측정. 높은 처리량 프로토콜 크게 여기에 설명 된 연 삭 씨앗과 효소 분석 실험 단계의 효율성을 증가 합니다. 이 방법은 HVA17ABA 유도 유전자 표현의 활성화 녹음 방송 요인 TaABF15,6 의 능력을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 여기에 제시 하는 대표적인 결과 HVA1::GUS 기자 구문 UBI::TaABF1 이펙터 구조 (그림 3A)와 aleurone 세포에 도입 되었...

향상 된 프로토콜은 입자 사격 후 보 리 aleurone 세포에서 기자 구문에서 일시적인 유전자 발현의 측정에 대 한 제공 됩니다. 96 잘 접시 효소 분석 실험 연 삭 자동화 된 곡물의 조합을 절차에 대 한 높은 처리량을 제공 합니다.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

이 절차의 전반적인 목표는 입자 충격을 통해 보리 알루론 세포에 도입한 후 리포터 구조체에서 유전자 발현을 측정하는 것입니다. 이 방법은 특정 신호 분자가 앱시스산을 보리 유도 유전자로 조절하기 위해 어떻게 작용하는지와 같은 식물 호르몬 조절 유전자 발현의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 방법보다 더 높은 처리량을 제공하여 많은 수의 유전자 구조와 배양 조건을 테스트할 수 있다는 것입니다.프로토콜을 시연하는 것은 제 연구실의 학생인 Grace가 할 것입니다. 먼저, 20ml의 흡수 용액과 20마이크로리터의 클로람페니콜이 들어 있는 90mm 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에 배아가 없는 곡물 몇 개를 넣습니다. 멸균 집게를 사용하여 각 곡물에서 투명한 종피를 부드럽게 제거합니다.보리 곡물에서 종피를 벗겨내는 것은 중요한 단계입니다. 종피가 완전히 제거되지 않으면 금 마이크로캐리어가 알루론 세포로 들어가는 것을 방지할 수 있습니다. 그러나 박리를 너무 거칠게 하면 알루론 세포가 손상될 수 있습니다.모든 곡물에서 종피를 벗겨낸 후 페트리 접시에서 질석 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 껍질을 벗긴 배아가 없는 곡물을 섭씨 24도의 인큐베이터에 16-20시간 동안 놓습니다. 이제, 폭격 실험에 포함될 각 처리에서 1점 5밀리리터 튜브에 라벨을 붙입니다.각 튜브에 2포인트 5마이크로그램의 UBI 루시페라아제 내부 제어 플라스미드, 2포인트 5마이크로그램의 GUS 리포터 플라스미드 및 원하는 양의 이펙터 플라스미드를 추가합니다. 각 튜브에 초순수를 첨가하여 총 부피를 5마이크로리터로 만듭니다. 각 처리에 대해 50% 글리세롤에 현탁된 50마이크로리터의 마이크로캐리어를 플라스미드 DNA가 들어 있는 각 1포인트 5밀리리터 튜브에 추가합니다.마이크로캐리어 코딩 절차의 마지막 단계에서, 8마이크로리터의 부유 마이크로캐리어를 5개의 매크로캐리어 각각에 피펫팅하고 공기 중에서 건조시킵니다. 진공 펌프를 켜고 헬륨 밸브를 연 다음 입자 전달 시스템을 켜서 입자 충격 장치를 설정합니다. 1550psi 파열 디스크를 고정 캡에 넣고 입자 전달 시스템에 장착합니다.원하는 플라스미드 조합과 정지 스크린을 포함하는 매크로캐리어를 마이크로캐리어 런치 어셈블리에 놓습니다. 어셈블리를 폭격실의 상단 슬롯에 삽입합니다. 다음으로, 8개의 배아가 없는 입자를 촘촘한 방사형 패턴으로 배열하고 얇은 끝이 90ml 페트리 접시의 뚜껑에 평평하게 테이프로 감싼 여과지 원의 안쪽을 향하도록 합니다.곡물이 든 접시를 정지 스크린에서 6cm 떨어진 폭격실에 놓습니다. 문을 닫고 진공 스위치를 눌러 포격실을 95킬로파스칼로 대피시킵니다. 진공 스위치를 유지 위치로 빠르게 돌립니다.그런 다음 화재 스위치를 누르고 있으면 샘플에 포격을 가할 수 있습니다. 진공을 해제한 후, 폭격을 가한 곡물을 1밀리리터당 1밀리그램의 클로람페니콜과 함께 4밀리리터의 흡수 용액이 들어 있는 라벨이 붙은 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 모든 포격이 완료될 때까지 반복합니다.그런 다음 24시간 동안 섭씨 24도에서 100rpm으로 진탕 플랫폼에서 폭격을 받은 곡물을 배양합니다. 집게를 사용하여 60mm 페트리 접시에서 폭격을 가한 8개의 알갱이를 제거하고 종이 타월로 닦아내십시오. 입자를 각각 800마이크로리터의 분쇄 버퍼와 5mm 스테인리스강 비드가 들어 있는 2개의 라벨이 붙은 2밀리리터 튜브로 나눕니다.충격을 받은 모든 입자에 대해 이전 단계를 반복한 후 최대 48개의 2밀리리터 튜브를 비드 균질기의 두 랙에 넣습니다. 그런 다음 균질기에 랙을 장착하고 샘플을 30헤르츠에서 3분 동안 흔듭니다. 완료되면 균질화기에서 랙을 제거하고 샘플을 다시 냉각하기 위해 5분 동안 얼음 위에 놓습니다.이제 균질기의 랙을 반대 방향으로 장착합니다. 샘플을 30 헤르츠에서 3분 동안 다시 흔듭니다. 균질화기에서 랙을 제거한 후 샘플을 다시 냉각시키기 위해 5분 동안 얼음 위에 놓습니다.그 후, 곡물 추출물을 섭씨 4도에서 16, 000G에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 직후, 투명한 상등액을 두 번째 마이크로 원심분리 튜브 세트에 디캔팅합니다. 각 튜브를 간단히 소용돌이치고 얼음 위에 보관하십시오.상등액을 옮긴 후 펠릿에서 스테인리스강 비드를 회수하여 세척 및 재사용할 수 있습니다. 이제 200마이크로리터의 GUS 분석 버퍼를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 곡물 추출물 50마이크로리터를 웰 중 하나에 넣고 피펫 팁과 섞습니다.그런 다음 밀봉 필름으로 플레이트 상단을 밀봉합니다. 96웰 플레이트를 섭씨 37도의 어두운 곳에서 20시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후 96웰 플레이트를 섭씨 4도에서 4, 000G로 10분 동안 원심분리합니다.완료되면 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이제 250마이크로리터의 0점 2몰의 탄산나트륨을 검은색 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 원심분리 GUS 분석 혼합물의 6점, 2, 5마이크로리터를 블랙 플레이트의 각 웰에 추가하고 피펫 팁과 혼합합니다.100 마이크로 몰에서 10-40의 6 점 2 5 마이크로 리터, 4 개의 메틸 umbelliferone을 표준으로 포함하는 우물을 포함하십시오. 검은색 플레이트를 플레이트 형광계에 놓습니다. 40 마이크로 몰의 6 점 2 5 마이크로 리터, 4 개의 methylumbelliferone 및 250 마이크로 리터의 영점 2 몰 탄산 나트륨을 포함하는 우물이 100 형광 단위의 판독 값을 제공하도록 기기의 이득을 설정하는 methylumbelliferone의 형광을 읽으십시오.이 실험에서는 UBI TaABF1 effector 구조체와 함께 HVA1 GUS 리포터 구조체를 알루론 세포에 도입했습니다. TaABF1 HVA1 비율이 0점에 불과하지만, ABA가 없는 경우 1개만으로도 HVA1 리포터 유전자의 3배 유도를 유발하기에 충분했습니다. TaABF1 구조체의 수치가 높을수록 투여 의존적 방식으로 HVA1 발현이 점진적으로 증가했습니다.외시성 ABA와 TaABF1 모두 HVA1 GUS 리포터 구조체의 발현을 강력하게 유도할 수 있습니다. 두 경우 모두 하나의 부탄올의 존재는 HVA1 유도를 강력하게 억제했으며, 이는 포스포리파아제 D가 TaABF1을 통한 ABA에 의한 HVA1 유전자 발현 활성화에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. ABA는 Amy32b GUS 리포터 구조체에 대한 지베렐린 유도 발현을 강력하게 억제하는 것으로 나타났습니다.과산화수소나 니트로프루시드나트륨은 현저한 감소를 일으키지 않았습니다. 따라서 이러한 결과는 알류론 세포 ABA 반응에서 산화질소 및 과산화수소의 역할을 뒷받침하지 않습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 사용하면 비교적 짧은 시간에 유전자 발현을 위해 다양한 샘플을 측정할 수 있습니다.예를 들어, 200개의 서로 다른 곡물 샘플에 대한 폭격은 두 명의 조사관이 몇 시간 안에 수행할 수 있습니다. 그런 다음 다음 날에는 한 명의 연구자가 2시간 안에 모든 단백질 추출물을 준비할 수 있습니다. 또한 96웰 플레이트에서 수행된 변형된 GUS 분석은 향후 튜브 분석에 사용되는 다른 프로토콜보다 훨씬 적은 노동력이 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

곡물의 전사체 프로파일링을위한 방법이 제시된다. 마이크로어레이 기반 유전자 발현 프로파일링은 시리얼 곡물로부터 고품질의 총 RNA를 분리하는 것으로 시작하여 cDNA 생성을 계속합니다. cRNA 라벨링 및 마이크로어레이 혼성화 후 신호 감지 및 품질 관리를 위한 권장 사항이 제공됩니다.

유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

여기에 제시된 것은 식물 조직의 레이저 포획 미세 절(LCM)을 위한 프로토콜입니다. LCM은 오염없는 방식으로 조직의 영역을 격리하기위한 현미경 기술입니다. 절차는 조직 고정, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출을 포함한다. RNA는 다운스트림 조직 특이적, 전사의 현세적으로 해결된 분석에서 사용된다.

레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석

배우세요 보리 알레우론 세포에서 입자 폭격법을 이용한 유전자 발현 측정 방법을. 자동화된 곡물 분쇄와 96웰 플레이트 효소 분석을 결합하여 처리량을 높이고, 식물 호르몬 조절 유전자 연구에 활용할 수 있습니다.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

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