포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

이 절차의 전반적인 목표는 입자 충격을 통해 보리 알루론 세포에 도입한 후 리포터 구조체에서 유전자 발현을 측정하는 것입니다. 이 방법은 특정 신호 분자가 앱시스산을 보리 유도 유전자로 조절하기 위해 어떻게 작용하는지와 같은 식물 호르몬 조절 유전자 발현의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 방법보다 더 높은 처리량을 제공하여 많은 수의 유전자 구조와 배양 조건을 테스트할 수 있다는 것입니다.

프로토콜을 시연하는 것은 제 연구실의 학생인 Grace가 할 것입니다. 먼저, 20ml의 흡수 용액과 20마이크로리터의 클로람페니콜이 들어 있는 90mm 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에 배아가 없는 곡물 몇 개를 넣습니다. 멸균 집게를 사용하여 각 곡물에서 투명한 종피를 부드럽게 제거합니다.

보리 곡물에서 종피를 벗겨내는 것은 중요한 단계입니다. 종피가 완전히 제거되지 않으면 금 마이크로캐리어가 알루론 세포로 들어가는 것을 방지할 수 있습니다. 그러나 박리를 너무 거칠게 하면 알루론 세포가 손상될 수 있습니다.

모든 곡물에서 종피를 벗겨낸 후 페트리 접시에서 질석 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 껍질을 벗긴 배아가 없는 곡물을 섭씨 24도의 인큐베이터에 16-20시간 동안 놓습니다. 이제, 폭격 실험에 포함될 각 처리에서 1점 5밀리리터 튜브에 라벨을 붙입니다.

각 튜브에 2포인트 5마이크로그램의 UBI 루시페라아제 내부 제어 플라스미드, 2포인트 5마이크로그램의 GUS 리포터 플라스미드 및 원하는 양의 이펙터 플라스미드를 추가합니다. 각 튜브에 초순수를 첨가하여 총 부피를 5마이크로리터로 만듭니다. 각 처리에 대해 50% 글리세롤에 현탁된 50마이크로리터의 마이크로캐리어를 플라스미드 DNA가 들어 있는 각 1포인트 5밀리리터 튜브에 추가합니다.

마이크로캐리어 코딩 절차의 마지막 단계에서, 8마이크로리터의 부유 마이크로캐리어를 5개의 매크로캐리어 각각에 피펫팅하고 공기 중에서 건조시킵니다. 진공 펌프를 켜고 헬륨 밸브를 연 다음 입자 전달 시스템을 켜서 입자 충격 장치를 설정합니다. 1550psi 파열 디스크를 고정 캡에 넣고 입자 전달 시스템에 장착합니다.

원하는 플라스미드 조합과 정지 스크린을 포함하는 매크로캐리어를 마이크로캐리어 런치 어셈블리에 놓습니다. 어셈블리를 폭격실의 상단 슬롯에 삽입합니다. 다음으로, 8개의 배아가 없는 입자를 촘촘한 방사형 패턴으로 배열하고 얇은 끝이 90ml 페트리 접시의 뚜껑에 평평하게 테이프로 감싼 여과지 원의 안쪽을 향하도록 합니다.

곡물이 든 접시를 정지 스크린에서 6cm 떨어진 폭격실에 놓습니다. 문을 닫고 진공 스위치를 눌러 포격실을 95킬로파스칼로 대피시킵니다. 진공 스위치를 유지 위치로 빠르게 돌립니다.

그런 다음 화재 스위치를 누르고 있으면 샘플에 포격을 가할 수 있습니다. 진공을 해제한 후, 폭격을 가한 곡물을 1밀리리터당 1밀리그램의 클로람페니콜과 함께 4밀리리터의 흡수 용액이 들어 있는 라벨이 붙은 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 모든 포격이 완료될 때까지 반복합니다.

그런 다음 24시간 동안 섭씨 24도에서 100rpm으로 진탕 플랫폼에서 폭격을 받은 곡물을 배양합니다. 집게를 사용하여 60mm 페트리 접시에서 폭격을 가한 8개의 알갱이를 제거하고 종이 타월로 닦아내십시오. 입자를 각각 800마이크로리터의 분쇄 버퍼와 5mm 스테인리스강 비드가 들어 있는 2개의 라벨이 붙은 2밀리리터 튜브로 나눕니다.

충격을 받은 모든 입자에 대해 이전 단계를 반복한 후 최대 48개의 2밀리리터 튜브를 비드 균질기의 두 랙에 넣습니다. 그런 다음 균질기에 랙을 장착하고 샘플을 30헤르츠에서 3분 동안 흔듭니다. 완료되면 균질화기에서 랙을 제거하고 샘플을 다시 냉각하기 위해 5분 동안 얼음 위에 놓습니다.

이제 균질기의 랙을 반대 방향으로 장착합니다. 샘플을 30 헤르츠에서 3분 동안 다시 흔듭니다. 균질화기에서 랙을 제거한 후 샘플을 다시 냉각시키기 위해 5분 동안 얼음 위에 놓습니다.

그 후, 곡물 추출물을 섭씨 4도에서 16, 000G에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 직후, 투명한 상등액을 두 번째 마이크로 원심분리 튜브 세트에 디캔팅합니다. 각 튜브를 간단히 소용돌이치고 얼음 위에 보관하십시오.

상등액을 옮긴 후 펠릿에서 스테인리스강 비드를 회수하여 세척 및 재사용할 수 있습니다. 이제 200마이크로리터의 GUS 분석 버퍼를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 곡물 추출물 50마이크로리터를 웰 중 하나에 넣고 피펫 팁과 섞습니다.

그런 다음 밀봉 필름으로 플레이트 상단을 밀봉합니다. 96웰 플레이트를 섭씨 37도의 어두운 곳에서 20시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후 96웰 플레이트를 섭씨 4도에서 4, 000G로 10분 동안 원심분리합니다.

완료되면 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이제 250마이크로리터의 0점 2몰의 탄산나트륨을 검은색 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 원심분리 GUS 분석 혼합물의 6점, 2, 5마이크로리터를 블랙 플레이트의 각 웰에 추가하고 피펫 팁과 혼합합니다.

100 마이크로 몰에서 10-40의 6 점 2 5 마이크로 리터, 4 개의 메틸 umbelliferone을 표준으로 포함하는 우물을 포함하십시오. 검은색 플레이트를 플레이트 형광계에 놓습니다. 40 마이크로 몰의 6 점 2 5 마이크로 리터, 4 개의 methylumbelliferone 및 250 마이크로 리터의 영점 2 몰 탄산 나트륨을 포함하는 우물이 100 형광 단위의 판독 값을 제공하도록 기기의 이득을 설정하는 methylumbelliferone의 형광을 읽으십시오.

이 실험에서는 UBI TaABF1 effector 구조체와 함께 HVA1 GUS 리포터 구조체를 알루론 세포에 도입했습니다. TaABF1 HVA1 비율이 0점에 불과하지만, ABA가 없는 경우 1개만으로도 HVA1 리포터 유전자의 3배 유도를 유발하기에 충분했습니다. TaABF1 구조체의 수치가 높을수록 투여 의존적 방식으로 HVA1 발현이 점진적으로 증가했습니다.

외시성 ABA와 TaABF1 모두 HVA1 GUS 리포터 구조체의 발현을 강력하게 유도할 수 있습니다. 두 경우 모두 하나의 부탄올의 존재는 HVA1 유도를 강력하게 억제했으며, 이는 포스포리파아제 D가 TaABF1을 통한 ABA에 의한 HVA1 유전자 발현 활성화에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. ABA는 Amy32b GUS 리포터 구조체에 대한 지베렐린 유도 발현을 강력하게 억제하는 것으로 나타났습니다.

과산화수소나 니트로프루시드나트륨은 현저한 감소를 일으키지 않았습니다. 따라서 이러한 결과는 알류론 세포 ABA 반응에서 산화질소 및 과산화수소의 역할을 뒷받침하지 않습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 사용하면 비교적 짧은 시간에 유전자 발현을 위해 다양한 샘플을 측정할 수 있습니다.

예를 들어, 200개의 서로 다른 곡물 샘플에 대한 폭격은 두 명의 조사관이 몇 시간 안에 수행할 수 있습니다. 그런 다음 다음 날에는 한 명의 연구자가 2시간 안에 모든 단백질 추출물을 준비할 수 있습니다. 또한 96웰 플레이트에서 수행된 변형된 GUS 분석은 향후 튜브 분석에 사용되는 다른 프로토콜보다 훨씬 적은 노동력이 필요합니다.