Name: 수집 및 곰 팡이 DNA의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 학습하세요 직업 환경에서 공기 샘플을 수집하고 곰팡이 DNA를 추출하여 ITS 영역을 증폭 및 서열 분석하는 방법을. 이 기술은 전통적 방법으로 탐지되지 않는 곰팡이 종을 식별하여 작업자 건강 위험을 평가하는 데 도움을 줍니다.

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이 작품은 NIOSH와 NIEHS (AES12007001-1-0-6) 사이 부처간의 합의 의해 부분에서 지원 되었다.

1. 준비 NIOSH 졸 샘플러
참고: NIOSH 졸 샘플러 bioaerosols 두 샘플링 튜브와 소계 (PTFE) 필터를 사용 하 여 수집 하는 2 단계 사이 클론 졸 샘플러가입니다.
<ol><li>어셈블리, 전에 조심 스럽게 샘플러를 검사 합니다. 그것을 보장 하기 위해 샘플러 손상 되지 않은, 장소 및 아늑한, 모든 나사가 및 경계선 주변 씰링 테이프는 2에 의해 형성 된 반쪽은 그대로. 샘플러 어떤 흠, 균열 또는 눈물 그리고 그것이 실리콘 그리스의 매우 가벼운 코팅 있지 않습니다 있도록 O-ring를 검사 합니다. 참고: 샘플러는 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 3 종 필터 카세트에서 37 m m 3 µ m PTFE 필터를 포함합니다.<ol>
<li>기본 조각의 gridded 표면에 셀 루 로스 또는 플라스틱 필터 지원 패드 (필터 포함)을 배치 하 여 필터 카세트를 조립 ( 그림 1참조). 필터 집게를 사용 하 여 컬렉션 면이 필터 지원 패드 위에 필터를 넣어.</li>
		<li>수동 또는 공 압 프레스를 사용 하 여 필터 카세트 인감. 손 폐쇄 공기 필터 주위 누출 하 수집 효율을 줄일 수 있습니다. 고리 모양의 조각 (확장 물통)를 삽입 하 고 언론을 사용 하 여 단단히 그리고 균등 하 게 그것을 밀어. 필터 주위 공기 누설 하지 않는 수 있도록 충분히 단단히 필터에 확장 물통 아래로 누릅니다. 참고: 카세트의 상단 부분 샘플링 하는 동안 사용 되지 않습니다 하지만 샘플링 완료 되 면 필터를 저장 한다.</li>
		<li>샘플러의 위에 조립된 카세트를 맞게 하 고 최대한 그것을 밀어. 외부 필터 카세트와 샘플러에에서 필터 카세트를 개최 하 고 누출을 방지 하기 위해 백업 인감 역할에 19mm (3/4 인치) 테이프의 조각을 래핑하십시오.</li>
		<li>누수에 대 한 보조 인감 역할을 밖으로 바닥까지 샘플러 포장 바다 표범 어업 테이프 각 관 주위에 각 관을 단단히 하 고 완전히 나사. 참고: 첫 번째 튜브, 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브의 공기 역학적 직경 비 호흡 입자를 수집 > 4 µ m. 두 번째 튜브 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 1 및 4 µ m 사이 호흡 입자를 수집합니다. 나머지 작은 입자, < 1 µ m, PTFE에 수집 되어 필터 ( 그림 2참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 사용 하기 전에 보정 항아리와 NIOSH 샘플러를 통해 공기를 보정 필터 및 시료에서 차이 다를 공기를 발생할 것입니다.<ol>
<li>교정 항아리를 사용 하려면 필터 카세트의 상단에 항아리의 루어 피팅 삽입, 샘플러, 항아리에 놓고 항아리를 밀봉 합니다.</li>
		<li>샘플링 펌프 캘리브레이션 유량 계를 교정 항아리를 연결 합니다. 유량 계를 켜고 몇 분 동안 따뜻하게 수 있습니다. 참고 흐름 미터 항상 흐름 미터와 샘플러 오염 방지의 입구에 연결 된 필터를가지고 있어야 합니다.</li>
		<li>샘플링 펌프를 켜고 따뜻하게 안정 하는 몇 분 동안 실행할 수 있도록.</li>
		<li>조정 펌프 3.5 L/min에서 올바른 흐름 속도 설정 합니다. 참고: NIOSH 졸 샘플러 유량 3.5 L/min 일반적으로 설정 됩니다. 이 흐름 속도, 샘플러 호흡 입자 샘플링16ACGIH/ISO 기준에 따릅니다. 다른 흐름 레이트 다른 잘라 크기는 원하는 또는 소음 수준을 줄일 수 있지만 유의 다른 흐름 율을 사용 하는 경우 다음 샘플러는 더 이상 준수 호흡 샘플링 기준 하는 경우 사용할 수 없습니다.</li>
		<li>교정 끝나면 펌프와 유량을 끄십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 정적 및 개인 졸 샘플링
<ol><li>어느 개인 또는 정적 영역 샘플링에 대 한 NIOSH 졸 샘플러를 설정 합니다. 참고: 정적 샘플링은 삼각대 또는 다른 저장 장치에 연결 하는 동안에 어로 졸 샘플러를 사용 하 여 (그림 3참조), 개인 때 샘플링 대 샘플러와 펌프는 ( 그림 4참조) 공부 되 고 사람에 탑재.<ol>
<li>정적 지역 샘플링에 대 한 계속 샘플러 특정 지역에 가능한 가깝게 공부 되 고. 공기 인 레트, 방 입구 및 공기 흐름의 경로에 있을 수 있는 장소에서 시료를 유지. 참고: 졸 농도가 달라질 수 있습니다 상당히 짧은 거리에도 졸 소스 방17에 있는 경우에 특히.</li>
		<li>개인 샘플링에 대 한 사용자의 호흡 영역 내 샘플러를 설정 합니다. 옷 깃, 어깨 또는 가슴, 샘플러를 부착 하 고 허리에서 또는 가방에 샘플링 펌프를 놓습니다. 참고: 호흡 영역은 주변 사람의 코는 대부분 공기의 흡입17동안 그려집니다 30 cm 반구로 일반적으로 간주 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브 샘플러 샘플러 후미의 잘 분명 하다 고 아무것도 방해 인 레트는 또는 샘플러에 공기 흐름에 방해가 있는지 확인 합니다. 튜브 샘플러 슬쩍 하거나 눌릴 해야 합니다 하지. 어떤 막힘 펌프를 중지 하면 됩니다.</li>
	<li>펌프를 켭니다. 2 분 후 펌프 실행 중인 경우 확인 합니다. 참고: 행위 환경10,,1819에 따라 전체 8 h 작업 교대 10 분 만큼 적은에서 배열 하는 기간에 대 한 샘플링 공기. 그림 6 에 제시 하는 결과 실내 환경에서 60 분 샘플링 기간의 대표.</li>
	<li>공기 샘플링 완료 샘플 튜브와 필터를 수집 합니다. 봉인 테이프를 제거 하 고 나사 튜브, 그들 모자. 장소 필터에 필터 카세트의 세 번째 작품. 처리를 위해 준비 될 때까지 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>3. 공기 샘플에서 게놈 DNA 추출
<ol><li>NIOSH BC251 샘플러의 각 단계에서 게놈 DNA (gDNA)를 추출 합니다. 샘플링 컬렉션 튜브 공기를 처리 하 고 샘플에서 호흡 및 호흡 비 미생물 졸의 결정에 대 한 수 있도록 별도로 필터링. 참고: 또는, 3 단계 수 수 결합 하 고 샘플 inoculum 너무 작으면 추출.<ol>
<li>클래스 II 생물 안전 캐비닛 또는 층 흐름 클린 벤치, aseptically 필터를 제거 합니다. 70% 에탄올과 지레 샘플링 카세트 카세트 오프닝 도구를 사용 하 여 열을 사용 하 여 샘플링 카세트를 닦아냅니다. 필터 기중 장치를 사용 하 여 필터 및 지원 패드를 위쪽으로 밀어. 잡고 집게를 필터를 사용 하 여 필터 멸 균 페 트리 접시에 놓습니다. 6 동일한 조각으로 필터를 잘라내어 300 mg 유리 구슬 (0.2-0.5 m m)를 포함 하는 강화 2 mL 튜브에 넣어.</li>
		<li>30에 대 한 액체 질소에 필터를 포함 하는 튜브를 놓고 s 고 즉시에 4.5 m/s 30 설정 비드 밀 균질 화기 s.</li>
		<li>반복 단계 3.1.2 번 필터 났습니다. 그대로 필터의 작은 조각에 남아 있을 수 있습니다. 세포의 용 해 버퍼 (4 M 요소, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), pH 7.4) 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>15 mL와 1.5 mL 공기 샘플러 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 0.3 mL를 추가 합니다. 와 10-15에 대 한 관 동 직 립 하면서 s와 다른 10-15 s 반전. 300 mg 유리 구슬을 포함 하는 강화 2 mL 튜브 각 튜브의 내용을 전송. 참고: 각 샘플러 튜브에 수집 된 자료의 대부분은 튜브의 상단 부근에 축적 됩니다.</li>
		<li>모든 튜브 비드 밀 균질 화기 4.5 m/s로 30 s와 원심 분리기에서에서 처리 그들 20000 x g 22 ° c.에 1 분에서 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브 supernatants 전송 및 22 ° c.에 1 분 동안 다시 20000 x g에서 튜브 원심 이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 µ L 세포 시 약의 추가 ( 재료의 표참조) 각 튜브와 튜브 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>바인딩 버퍼 (10 M 요소, 6 M guanidine-HCl, 10 mM Tris HCl, 20% 트라이 톤 X-100, pH 4.4)의 0.2 mL를 추가 하 고 성분을 K (100 µ g/mL) 각 튜브와 튜브 각 튜브에 소 프로 파 놀의 10 분 추가 100 µ L 70 ° C에서 품 어.</li>
	<li>유리 섬유 필터 튜브 (700 µ L 용량) 2 mL 컬렉션 튜브에 배치 추출 솔루션을 전송 하 고 20000 x g 30에 컬렉션 튜브 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소.</li>
	<li>각 튜브를 억제제 제거 버퍼 (5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris HCl, pH 6.6, 38% 에탄올) 0.5 mL를 추가 하 고 컬렉션 튜브 30 20000 x g에서 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소.</li>
	<li>각 튜브를 워시 버퍼 (20 m m NaCl, 2 mM Tris HCl, pH 7.5, 80% 에탄올) 0.5 mL를 추가 하 고 컬렉션 튜브 30 20000 x g에서 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소. 이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>모든 잔여 워시 버퍼를 제거 하려면 22 ° C에 추가 1 분에 대 한 20000 x g에서 컬렉션 튜브 원심 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 컬렉션 튜브 필터 튜브를 배치.</li>
	<li>추가 100 µ L를 각 튜브 (≥70 ° C) 차입 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.5) 따뜻하고 컬렉션 튜브 20000 x g 30에 1-2 분 원심 분리기에 대 한 실내 온도에 그들을 품 어 22 ° c.에 s Microcentrifuge 살 균 1.5 mL 튜브에 빈 필터 튜브를 전송 하 고 다시 단계 3.8에서에서 있다를 적용 합니다. 20000 x g 30에 1-2 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 품 어 22 ° c.에 s 참고: 있다 사용할 수 있습니다 즉시 단계 4 또는 사용할 준비가 될 때까지-20 ° C에서 저장에 대 한. Genomic DNA에 저장 될 수 있다-20 ° c.에서 1 년까지 장기 보관이 필요한 경우 DNA-80 ° C에 저장 되는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4입니다. 곰 팡이 ribosomal DNA의 증폭
<ol><li>보편적인 곰 팡이 프라이 머를 사용 하 여 그것의 지구 1와 2에서 추출한 gDNA 증폭. 참고:이 프로토콜에 대 한 뇌관 쌍 Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')는 지역4,5의 가장 큰 범위를 제공 하는 데 사용 됩니다. 혼자 ITS1 또는 ITS2 영역을 증폭 하는 다른 뇌관 세트를 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>살 균 0.5 mL PCR 튜브 또는 96-잘 PCR 접시 triplicate 50 µ L 반응에서 각 샘플에 대 한 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 다음과 같이 설정: 5 µ L (3 단계)에서 추출 된 템플릿 DNA의 PCR 학년 물의 33.3 µ L, 10 x PCR 버퍼의 5 µ L 50 mM MgCl2의 1.5 µ L, 10 m m 2'-deoxynucleoside 5'-된의 1 µ L, 20 µ M Fun18Sf 앞으로 뇌관의 0.5 µ L, 20 µ M ITS4R 역 뇌관의 0.5 µ L 및 Taq DNA 중 합 효소의 0.2 µ L.</li>
		<li>반응 열 cycler에서 수행: 3 분;에 대 한 95 ° C에서 변성 변성의 6 주기 (96 ° C, 30 s) 어 닐 링 (50 ° C, 45 s) 및 뇌관 연장 (72 ° C, 3 분); 변성의 20 주기 (96 ° C, 30 s), 어 닐 링 (50 ° C, 45 s), 및 뇌관 연장 (72 ° C, 1 분); 그리고 10 분을 위한 72 ° C에 뇌관 연장 다음 단계까지 4 ° C에서 반응 혼합물을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결합 triplicate PCR 반응 실리 카 멤브레인 기반 정화 키트를 사용 하 여 정화. 참고:이 절차는 PCR 구성 요소 (프라이 머, dNTPs, 효소, 소금, 등) 및 증폭 된 DNA 준비에서 다른 오염 물질의 제거에 대 한 수 있습니다.<ol>
<li>각 샘플 (총 150 µ L) 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 대 한 세 가지 반응 결합. 5 배 볼륨 (750 µ L)에서 바인딩 버퍼 (5 M guanidine-HCl, 30% 소 프로 파 놀)을 추가 하 고 10 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 혼합.</li>
		<li>열 컬렉션 튜브에 배치 스핀 하 원심 17,900 x g에서 튜브 30 s. 삭제는 filtrates 혼합물의 450 µ L를 추가 합니다. 열에 나머지 450 µ L을 추가 하 고 30 17,900 x g에서 원심 22 ° c.에 s 참고: 스핀 열 열에 DNA의 흡착에 대 한 허용 하는 실리 카 멤브레인을 포함 됩니다.</li>
		<li>filtrates을 삭제 하 고 스핀 열에 750 µ L 세척 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 80% 에탄올)를 추가 합니다. 원심 17,900 x g 30에 열 22 ° c.에 s 참고:이 과정은 위에서 언급 한 PCR 반응에서 오염 물질을 제거 합니다.</li>
		<li>여과 액을 폐기 하 고 원심 17,900 x g 22 ° c.에 1 분 동안에 빈 열 참고:이 단계는 모든 잔여 세척 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 수 있는 버퍼를 제거 하는.</li>
		<li>살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 회전 열을 전송 합니다. 차입 버퍼 (10 mM Tris Cl, pH 8.5)의 45 µ L을 추가 하 고 5 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 튜브 17,900 x g 22 ° c.에 1 분 동안에 스핀 열을 품 어</li>
		<li>단계 4와 5 단계 eluted DNA를 즉시 사용 하는 방법 또는 사용에 대 한 준비까지-20 ° C에서 저장. 참고:는 amplicons 저장할 수 있습니다-20 ° c.에서 1 년까지 장기 보관이 필요한 경우 DNA-80 ° C에 저장 되는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 곰 팡이 증폭 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 확인
<ol><li>캐스트는 1 %agarose 젤 포함 1 µ g/mL ethidium 평범한 사람. 분해 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼 x 1을 끓는 agarose. 솔루션이 약 50 ° C에 냉각 하 고, 일단 ethidium 평범한 사람을 추가 하 고 주조 하는 젤으로 부 어.</li>
	<li>Agarose 젤은 경화 후 담가 1에서 젤 x TAE 젤에 적재 될 amplicons 준비. 증폭 된 DNA의 8 µ L, 버퍼 로드 x 5의 2 µ L 추가 합니다. 참고: 이러한 볼륨 원하는 로딩 버퍼의 농도 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플, 크기 기준에 대 한 DNA 사다리와 함께 젤에 모든 10 µ L을 로드 합니다. 75 V에서 젤을 실행 (6 V/cm) 대략 90 분 및 밴드, 일반적으로 750 사이 본을 시각화 하 고 자외선을 사용 하 여 1, 000의 기본적인 쌍 라이트 ( 그림 5참조).</li>
</ol>6. 시퀀싱 및 곰 팡이 영역의 분석
<ol><li>Sequence gDNA 추출된 또는 곰 팡이 ITS 영역 증폭된 하 고 현재 하 고 적절 한 방법을 사용 하 여 시퀀스 분석.</li>
</ol>

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결과 및 결론은이 보고서에는 작가 이며 반드시 질병 관리 및 예방에 대 한 직업 안전 및 건강, 센터에 대 한 국립 연구소의 공식적인 위치를 대표 하지 않습니다.

시퀀싱 기반 방법을 사용 하 여 직업 환경 내에서 곰 팡이 다양성을 결정 하는 것은 곰 팡이 위험 식별 및 노출 평가 개선 했다. 이 방법을 사용 하는 많은 종의 추가 곰 팡이 종종 문화 또는 평가의 현미경-기반 메서드를 사용 하 여 검색 검색에 대 한 허용 했다. 직업 및 실내 환경 및 그것의 증폭 및 시퀀싱에 대 한 공기 샘플에서 게놈 DNA 추출에서 bioaerosols 샘플링 하는 방법은 여기에 제공 됩니다. 이러한 방법을 사용 하 여 곰 팡이 다양성의 결정은 높게에 지: (1) 성공 하 고 완전 한 genomic DNA에서에서 추출 공기 샘플링, 틀에 그 시퀀스는 증폭의 비교에 대 한 허용 하는 뇌관으로 gDNA의 확대 (2) 데이터베이스 및 한도 확대 편견, 및 (3) 올바른 분류학 식별 데이터베이스 내에서 시퀀스의 시퀀스입니다.
게놈 DNA 추출은 추출 방법론 및 연구에 사용 하는 시 약에 의존. 프로토콜에 언급은 튜브의 상단에 있는 bioaerosols 그리고 다른...

아니라 알레르기, 천식1를 포함 하 여 호흡기 morbidities 실내 및 산업 환경에서 곰 팡이 노출 될 수 있습니다. 곰 팡이 위험 식별 위험을 평가 하 고 작업자 노출 방지를 위해 중요 하다. 이 곰 팡이 위험 실내 오염, 실외 공기 침입, 또는 노동자는 존재2영역으로 곰 팡이 자료의 전송에서 발생 하는 환경 장애의 결과 수 있습니다. 뿐만 아니라 곰 팡이 포자의 미세한 식별 가능한 문화 샘플링 방법 곰 팡이 노출 평가를 포함 했다. 이러한 접근 방법은 몇 가지 제한 있고 전반적으로 곰 팡이 부담3에 기여 될 수 있는 많은 곰 팡이 종 종종 간과. 문화 기반 접근만 영양소 미디어에 재배 될 수 그 가능한 곰 팡이 균을 차별화할 수 있습니다. 현미경을 통해 종 수준으로 곰 팡이 포자를 식별 유사한 형태학을 공유 하는 포자에 의해 혼동 될 수 있습니다. 두 방법 모두 매우 mycologists 분석 하 고 많은 나머지 미확인으로 균 종 확인에 의존 하고있다.
직업 위험 식별 및 노출 평가에 사용 되는 기존의 방법론에 따라 개선 하기 위해 많은 연구 자들은 분자 기반 기술에 아닙니다. 시퀀싱-기반 접근 실내 및 산업 환경에서 미생물 다양성을 평가 하기 위한 현미경 등 가능한 문화3,4 방법에 비해 곰 팡이 발생의 광범위 한 스펙트럼을 계시 했다 ,5. 여기에 제시 된 방법 직업 환경의 공기 샘플링 및 잠재적인 균 위험 식별에 대 한 게놈 DNA의 추출에 설명 합니다. 위험 식별 핵 ribosomal 내부 베낀된 스페이서 또는 ITS, 버섯 중 매우 다양 하 고 일반적으로 곰 팡이 종6,7, 차별화 하는 데 사용 영역을 시퀀싱에 의해 수행 됩니다. 8,9. 많은 종 문 Basidiomycota에 속하는 일부 수 종 식별 가능한 문화에서 하지와 같은 직업 설정에서 발견 하 고 현미경으로 구분 하기가 어렵습니다. 이러한 버섯 시퀀싱 곰 팡이 그 지역3,,410평가 및 직업 환경에서 높은 관계 되는 풍부에 관찰 되었습니다. 그것의 시퀀싱 실내 및 산업 환경에서 발생 하는 버섯의 다양성에 더 큰 지식을 제공 하고있다.
프로토콜 여기 세부 정보 수집, 추출, 시퀀스 분석 bioaerosols에서 곰 팡이 ITS 영역 증폭 하는 데 사용 되는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 공기에서 입자를 수집 직업 안전과 건강 (NIOSH) 2 단계 사이 클론 졸 샘플러의 국립 연구소를 활용 합니다. 이 샘플러 bioaerosols 그리고 분리 호흡 (≤4 µ m 공기 역학적 직경)를 수집 하기 위해 개발 되었습니다 및 비 호흡 (> 4 µ m 공기 역학적 직경) 대부분은 실내 환경에서 곰 팡이 생물의 식별을 위해 수 입자 작업자11에 의해 흡입 있을 것. 입자가 호흡 범위 내에서 수집 하는 능력을가지고 시장에 다른 공기 샘플러를 사이 클론 샘플러를 포함 하 여 사용할 수 있습니다 (< 4 µ m)12,13필터를 사용 하 여. 반면, NIOSH 2 단계 사이 클론 졸 샘플러 다운스트림 응용 프로그램14즉시 처리 될 수 있는 일회용, 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들의 공기 역학적 직경에 따라 균 종을 분리 합니다.
게놈 DNA를 추출 하 고 곰 팡이 ITS 영역 증폭의 프로세스가이 프로토콜에 자세히 나와 있습니다. 많은 상용 키트 포유류 세포, 박테리아, 또는 특히 효 모15를 대상으로 추출 방법론 제시에서 균 류, 박테리아, genomic DNA 추출 위해 특별히 개발 되었습니다. 이 연구에 사용 된 뇌관은 곰 팡이 1와 그것의 2 지역4,5의 그들의 전체 범위에 따라 선택 됩니다. 이 지역의 시퀀싱 수 있습니다 그들을 포함 하 여 많은 은행된 ITS 시퀀스의 비교에 대 한 시퀀스의 1 지역, 그것의 2 지역, 또는 그것의 1와 그것의 2 지역. 공기 샘플의 곰 팡이 다양성 Ascomycota 그리고 Basidiomycota는 문의에 배치 하는 시퀀스와 같은 덜 지배적인 균 phyla에 속하는 다른 시퀀스의 상당한 수를 공개 이러한 방법을 표시 됩니다를 사용 하는 실내 설정에서 수집 Zygomycota입니다. 이 접근을 사용 하 여 식별 하는 곰 팡이 시퀀스의 광범위 한 다양성 재배 또는 현미경 같은 전통적인 위험 식별 방법론을 사용 하 여 캡처되지 않습니다 것입니다. 곰 팡이 영역의 시퀀싱 곰 팡이 위험을 식별 하 고 실내 및 산업 균 노출의 더 나은 이해를 허용 하는 향상 된 방법을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>NIOSH BC251 바이오 에어로졸 사이클론 샘플러</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>NIOSH 샘플러는 아직 상용화되지 않았습니다. NIOSH 샘플러</td></tr><tr><td>Fisherbrand 멸균 마이크로 원심분리기 튜브(스크류 캡 포함)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-373</td><td>공기 샘플링용 1.5mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리기 튜브를 구하는 방법에 대한 정보는 William Lindsley 박사(wlindsley@cdc.gov)에게 문의하십시오. 스크류 탑 스레딩은 NIOSH 샘플러의 스레딩과 일치해야 합니다.</td></tr><tr>공기 샘플링을 위한<td>Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td></td><td>352096 15 mL 폴리프로필렌 튜브</td></tr><tr><td>클린룸 비닐 테이프, 쉽게 제거할 수 있는, 1/4" 너비</td><td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td><td>밀봉 테이프</td></tr><tr><td>필터 카세트, 투명 스티렌, 37mm</td><td>SKC Inc.</td><td>225-3LF</td><td>3피스 샘플링 카세트(필터 없음). 포함: 카세트 베이스, 확장 카울, 카세트 캡 및 입구/출구 플러그</td></tr><tr><td>PTFE 소수성 형광단 멤브레인 필터, 3.0 &마이크로; m, 37 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>FSLW03700</td><td>포함: 37 mm, 3.0 &마이크로; m PTFE 필터 및 지지 패드</td></tr><tr><td>Fisherbrand 필터 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-50</td><td>필터 집게</td></tr><tr><td>모델 502 정밀 PanaPress</td><td>PanaVise</td><td>502</td><td>공압 카세트 프레스는 이 정밀 아버 프레스</td></tr><tr><td>Scotch Super 33+ 비닐 전기 테이프</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>19mm 테이프</td></tr><tr><td>다목적 교정 용기, 대형</td><td>SKC로 제작되었습니다. 주식회사</td><td>225-112</td><td>교정 용기</td></tr><tr><td>범용 PCXR4 샘플 펌프</td><td>SKC Inc.</td><td>224-PCXR4</td><td>샘플링 펌프</td></tr><tr><td>질량 유량계 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>4140</td><td>유량계</td></tr><tr><td>Roche High Pure PCR 템플릿 키트</td><td>게</td><td></td><td>놈 DNA 추출에 사용되는 Roche Diagnostics 11796828001 키트. 함유 성분: 용해 완충액, 결합 완충액, 단백질 분해 효소 K, 억제제 제거 완충액, 세척 완충액, 용출 완충액, 유리 섬유 필터 튜브 및 2 ml 수집 튜브</td></tr><tr><td>Fisherbrand 2 mL 강화 폴리프로필렌 스크류 캡 튜브(캡 포함)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>15340162 비드 균질화를 위한 2 mL 강화 튜브</td></tr><tr><td>유리 비드, 산 세척, 212-300 &micro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td>유리 구슬</td></tr><tr><td>Fisher Scientific 비드 밀 24 균질화 Fisher</td><td>Scientific</td><td>15-340-163</td><td>비드 균질화</td></tr><tr><td>CelLytic B 세포 용해 시약, 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td><td>용해 시약</td></tr><tr><td>Platinum Taq 중합효소</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>함유 성분: 백금 Taq 중합효소, 10X PCR 완충액(MgCl2 없음), 50mM MgCl2, KB 증량제</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>진균 앰플리콘을 정제하는 데 사용되는 키트. 내용물: 완충액 PB(결합 완충액), 완충액 PE(세척 완충액), 완충액 EB(용리 완충액), pH 지시 염료(선택 사항) 및 GelPilot 로딩 염료</td></tr><tr><td>Owl EasyCast Mini Gel 전기영동 시스템</td><td>Thermo Fisher</td><td>B1 또는 B2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus DNA ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>10488-085</td><td>DNA ladder</td></tr></tbody></table>

수집 및 곰 팡이 dna의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

문화와 현미경-기반 접근, 같은 직업 환경에서 곰 팡이 노출 식별의 전통적인 방법에는 많은 종류의 배제에 결과가 여러 제한이. 지난 2 년간 분야에서 발전 산업 보건 연구원 곰 팡이 위험 식별에 대 한 분자-기반 접근법을 주도 했습니다. 이러한 방법은 전통적인 방법을 사용 하 여 발견 되지 않은 실내 및 산업 환경에서 많은 종류의 탐지에서 이어지고 있다. 공기 내 곰 팡이 다양성을 결정 하기 위한 접근 게놈 DNA 추출, 증폭, 시퀀싱, 및 내부 곰 팡이의 분류학 식별을 통해 샘플이 프로토콜 세부 스페이서 (ITS) 영역을 복사할 수 있습니다. 많은 곰 팡이 종 하지 감지 또는 문화 또는 현미경을 사용 하 여 종 수준으로 식별 하기 어려운의 검출에는 시퀀싱 결과. 이러한 방법 곰 팡이 부담의 정량적 측정을 제공 하지 않습니다, 그러나 그들은 위험 식별에 대 한 새로운 접근을 제공 하 고 전체 종 부유 및 다양성 직업 환경 내에서 결정 하는 데 사용 수 있습니다.

종 배포 환경 내에서 관계 되는 풍부의 공기 샘플에서 확인 된 각 OTU 클론의 수를 결정 하 여 평가 될 수 있습니다. 그림 6 는 공기 샘플링의 60 분에 따라 실내 환경 내에서 배치 taxonomically 종 대표 크로나 차트입니다. 그것은 종 문 Zygomycota (Rhizopus microsporus)에 속하는 두 개의 주요 곰 팡이 문의 Ascomycota Basidiomycota, 내 종의 다양 한 환경에 포함 되어 있음을 관찰할 수 있습니다. 평가의 전통적인 방법으로 많은 Basidiomycota culturable 또는 현미경 기반 방법을 사용 하 여 분화 될 수 없다 Ascomycota 종으로 바이어스는. 곰 팡이 지역의 시퀀싱 수많은 균 종, 특히 일부 Basidiomycota, 자주 들 키 지 않고가 감지 할 수 있습니다. 이 환경의 분석 확인 곰 팡이 시퀀스의 68% 소유는 ...

환경 내에서 곰 팡이 다양성을 결정 하는 것은 건강 위험을 식별 하기 위해 산업 보건 연구에 활용 방법입니다. 이 프로토콜 설명 증폭 및 곰 팡이 지역의 시퀀싱에 대 한 직업 공기 샘플에서 DNA를 추출을 합니다. 이 이렇게 많은 곰 팡이 종 전통적인 평가 방법에 의해 간과 수 있습니다 감지 합니다.

수집 및 곰 팡이 DNA의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

이 공기 샘플링 및 DNA 추출 방법론의 전반적인 목표는 직업 환경 내에서 잠재적인 곰팡이 위험을 식별하기 위해 증폭, 염기서열 분석 및 분류학적으로 배치할 수 있는 곰팡이 게놈 DNA를 얻는 것입니다. 이 방법은 근로자가 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 노출된 곰팡이 위험과 같은 직업적 노출 평가 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배양 또는 현미경 기반 방법을 사용하여 검출되지 않은 곰팡이 종을 염기서열분석 기반 접근 방식을 사용하여 설명할 수 있다는 것입니다.공기 샘플링 필터 카세트를 조립하려면 베이스 피스의 격자 표면에 셀룰로오스 필터 지지 패드를 놓고 필터 집게를 사용하여 수집 면이 위쪽을 향하도록 필터 지지 패드 위에 필터를 놓습니다. 조립 후 확장 카울을 삽입하고 수동 또는 공압 프레스로 단단히 균일하게 눌러 필터 카세트를 밀봉합니다. 그런 다음 조립된 카세트를 NIOSH 에어로졸 샘플러 상단에 끼우고 최대한 아래로 누릅니다.19mm 테이프를 사용하여 필터 카세트와 샘플러의 바깥쪽을 감싸고 필터 카세트를 제자리에 고정하고 누출을 방지하기 위한 백업 씰 역할을 합니다. 채취 튜브가 바닥이 드러날 때까지 채취 튜브를 샘플러에 단단히 완전히 조이고 누출에 대한 2차 밀봉 역할을 하는 튜브 주위에 밀봉 테이프를 감습니다. 개인 에어로졸 샘플링을 수행하려면 샘플러를 사람의 호흡 영역 내에 두십시오.샘플러를 옷깃, 어깨 또는 가슴에 부착한 다음 샘플링 펌프를 허리 높이나 배낭에 보관하십시오. 펌프를 켜고 1분 후에 펌프가 작동하는지 확인하십시오. 공기 샘플링이 완료되면 피험자로부터 공기 샘플러를 수집합니다.밀봉 테이프를 제거하고 튜브의 나사를 푼 다음 캡을 씌웁니다. 필터 카세트의 세 번째 조각을 필터 위에 놓습니다. 먼저 70% 에탄올로 샘플링 카세트를 닦은 다음 카세트 개방 도구를 사용하여 샘플링 카세트를 엽니다.그런 다음 필터 리프터를 사용하여 지지 패드를 들어 올리고 필터를 위쪽으로 올립니다. 그런 다음 필터 집게를 사용하여 필터를 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 멸균 메스로 필터를 6등분으로 자른 다음 300mg의 200-500마이크로미터 유리 구슬이 들어 있는 2밀리리터 강화 튜브에 넣습니다.필터 함유 튜브를 액체 질소에 30초 동안 담근 다음 비드 밀 균질화기에 30초 동안 초당 4.5미터의 속도로 빠르게 놓습니다. 손상되지 않은 나머지 작은 필터 조각이 들어 있는 튜브에 0.5ml의 용해 버퍼를 추가한 다음 15ml 및 1.5ml 공기 샘플러 수집 튜브에 0.3ml의 용해 버퍼를 추가하고 튜브를 각각 10-15초 동안 수직 및 거꾸로 된 위치에서 와류로 회전시킵니다. 각 수집 튜브의 용해 버퍼를 300mg의 유리 구슬이 들어 있는 2ml 강화 튜브로 옮깁니다.30 초 동안 구슬 선반 균질화기에 있는 관을 가공하고십시오, 그 후에 20, 22 섭씨 온도에 1 분 동안 중력에 표본을 분리기를 설치하십시오. 원심분리 후에, 메마른 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관에 있는 상등액을 옮기고 다시 20, 22 섭씨 온도에 1 분 동안 000배 중력에 상등액을 원심 분리하십시오. 30마이크로리터의 용해 시약을 첨가한 후 튜브를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.그런 다음 0.2ml의 결합 완충액과 100μg/ml의 Proteinase K를 튜브에 추가한 다음 튜브를 섭씨 70도의 블록 히터에서 10분 동안 배양하도록 둡니다. 마지막으로 각 튜브에 100마이크로리터의 이소프로판올을 추가합니다. 그런 다음 700마이크로리터 용량의 유리 섬유 필터 튜브를 2밀리리터 수집 튜브에 넣고 추출물 용액을 그 안에 옮깁니다.다음 이동, 20, 000배 중력에 수집 관을 22 섭씨 온도에 30 초 동안 원심 분리하십시오. 원심분리 후 유리 필터 섬유를 새 수집 튜브에 삽입하고 수집 튜브를 폐기합니다. 각 관에 억제물 제거 완충액의 0.5 밀리리터를 추가하고 20, 22 섭씨 온도에 30 초 동안 중력에 000배 원심 분리를 지휘하십시오.원심분리 후 수집 튜브를 버리고 필터 튜브를 새 수집 튜브에 넣습니다. 그런 다음, 각 튜브에 0.5 밀리리터의 세척 버퍼를 추가하고 다시 섭씨 22도에서 30초 동안 20, 000배 중력으로 원심분리합니다. 원심분리 후 수집 튜브를 버리고 새 튜브로 교체하십시오.다시, 각 관에 세척 완충액의 0.5 밀리리터를 추가하고 22 섭씨 온도에서 30 초 동안 20, 000 배 중력으로 원심 분리기를 만듭니다. 어떤 잔여 세척 완충액든지 제거하기 위하여는, 마지막으로 20, 000배 중력에 수집 관을 22 섭씨 온도에 1 분 동안 원심 분리하고 수집 관을 버리고 새로운 그들로 대체하십시오. 100마이크로리터의 따뜻한 용리 완충액을 첨가한 후 실온에서 1-2분 동안 실험실 벤치에서 튜브를 배양하고 섭씨 22도에서 30초 동안 20, 000배 중력으로 수집 튜브를 원심분리합니다.필터 튜브를 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 또 다른 원형 원심분리를 위해 용리액을 다시 도포합니다. 0.5 millil PCR 튜브를 사용하여 각 반응에 대해 이미 추출된 DNA의 5 마이크로리터와 함께 50 마이크로리터 반응을 3중으로 설정한 다음 thermocycler를 프로그래밍하고 사이클을 시작합니다. 세 가지 PCR 반응을 모두 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 함께 혼합합니다.750 마이크로리터의 결합 완충액을 추가하고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 총 혼합물 450마이크로리터를 수집 튜브에 삽입된 스핀 컬럼에 추가하고 30초 동안 중력의 17, 900배에서 원심분리를 시작한 다음 여과액을 버리고 혼합물의 나머지 450마이크로리터를 추가하여 두 번째 원심분리를 수행합니다. 다시 여과액을 버리고 750마이크로리터의 세척 버퍼를 스핀 컬럼에 추가하고 섭씨 22도에서 30초 동안 17, 900배 중력으로 원심분리기를 합니다.마지막으로 여과액을 버리고 섭씨 22도에서 1분 동안 17, 900배 중력에서 빈 기둥을 다시 회전시킵니다. 스핀 컬럼을 1.5ml 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 45마이크로리터의 용리 완충액을 피펫팅하고 실온의 실험실 벤치에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 섭씨 22도에서 1분 동안 17, 900배 중력으로 기둥을 원심분리합니다.전기영동 챔버의 1배 TAE 완충액에 1%아가로스 겔을 담근 다음 2마이크로리터의 5배 로딩 완충액과 8마이크로리터의 증폭된 DNA를 혼합합니다. 마지막으로, 10마이크로리터의 샘플 전체를 DNA ladder와 함께 겔에 로드합니다. 젤을 75볼트에서 약 90분 동안 실행합니다.대표적인 아가로스 겔은 직업적 공기 샘플에서 파생된 진균 게놈 DNA의 내부 전사된 스페이서 영역의 증폭을 보여줍니다. 맨 왼쪽의 차선은 DNA 마커 차선을 나타냅니다. 오른쪽의 밴드는 750에서 1, 000 염기쌍 범위의 다양한 직업 공기 샘플에서 증폭된 내부 전사된 스페이서 영역을 나타냅니다.대표적인 크로나 차트는 실내 환경에서 다양한 분류학적 곰팡이 종의 존재를 보여줍니다. NIOSH 바이오 에어로졸 사이클론 샘플러는 가정에서 1시간 동안 바이오 에어로졸을 수집하여 존재하는 곰팡이 종을 확인하는 데 사용되었습니다. 표 형식의 데이터는 실내 환경에서 곰팡이 종의 다양성과 풍부도 지수를 나타냅니다.데이터는 냉난방 및 증발 냉각기 환경에서 더 높은 Chao-1 Richness 지수, Shannon Diversity 지수 및 Bray-Curtis 비유사성 계수를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실내 및 직업용 공기 샘플을 수집하고 미생물 개체군 분석을 위해 게놈 DNA를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플의 미생물 오염을 방지하기 위해 최상의 무균 방법을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

진균 DNA 분석을 위한 직업적 공기 시료의 수집 및 추출

종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

공기 샘플링 필터에서 대기 중 생물학적 입자에 대한 두 가지 상호 보완적인 분석, 즉 내독소 및 DNA의 추출 및 검출에 대해 설명합니다.

독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

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여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

환경 미 립 자 물질의 생물 학적 구성을 이해 하는 것은 인간의 건강과 질병 확산에 중요 한 영향의 연구에 대 한 중요 하다입니다. 여기, 우리 사용 bioaerosol 샘플링 방법의 세 가지 유형 및 공 수 미생물의 생물 학적 분석 더 나은 다른 환경 조건 하에서 공 수 미생물 지역 사회를 탐구.

구성 및 다른 환경 조건에서 Bioaerosols의 유통 분석

여기서 우리는 상피 세포 DNA에서 VNTR 궤적 D1S80을 증폭하여 DNA 지문 프로파일을 생성하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

실험실 클래스에서 D1S80 로커스를 사용하여 DNA 지문 응용 프로그램

이 프로토콜은 진공 보조 흡착제 추출 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 휘발성 유기 화합물을 추출하는 방법, Entech 샘플 준비 레일을 사용한 질량 분광법과 결합 된 가스 크로마토그래피 및 데이터 분석을 설명합니다. 또한 생물학적 샘플 및 안정한 동위원소 프로빙의 배양을 기술한다.

진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

신뢰할 수 있고 정확한 현장 배치 가능한 DNA 분석은 많은 산업에서 매우 중요합니다. 본 논문은 현장에서 환경 미생물 분석을 위한 두 가지 방법을 제시합니다: 1) 생물학적 추출 필드 키트를 이용한 환경 샘플에서 미생물 DNA를 분리하는 방법, 2) 현장 qPCR 유닛을 통한 DNA 분석.

생물학적 추출 필드 키트와 현장 qPCR 유닛을 이용한 현장 내 미생물 DNA 분석

학습하세요 직업 환경에서 공기 샘플을 수집하고 곰팡이 DNA를 추출하여 ITS 영역을 증폭 및 서열 분석하는 방법을. 이 기술은 전통적 방법으로 탐지되지 않는 곰팡이 종을 식별하여 작업자 건강 위험을 평가하는 데 도움을 줍니다.

수집 및 곰 팡이 DNA의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출

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