수집 및 곰 팡이 DNA의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출

이 공기 샘플링 및 DNA 추출 방법론의 전반적인 목표는 직업 환경 내에서 잠재적인 곰팡이 위험을 식별하기 위해 증폭, 염기서열 분석 및 분류학적으로 배치할 수 있는 곰팡이 게놈 DNA를 얻는 것입니다. 이 방법은 근로자가 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 노출된 곰팡이 위험과 같은 직업적 노출 평가 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배양 또는 현미경 기반 방법을 사용하여 검출되지 않은 곰팡이 종을 염기서열분석 기반 접근 방식을 사용하여 설명할 수 있다는 것입니다.

공기 샘플링 필터 카세트를 조립하려면 베이스 피스의 격자 표면에 셀룰로오스 필터 지지 패드를 놓고 필터 집게를 사용하여 수집 면이 위쪽을 향하도록 필터 지지 패드 위에 필터를 놓습니다. 조립 후 확장 카울을 삽입하고 수동 또는 공압 프레스로 단단히 균일하게 눌러 필터 카세트를 밀봉합니다. 그런 다음 조립된 카세트를 NIOSH 에어로졸 샘플러 상단에 끼우고 최대한 아래로 누릅니다.

19mm 테이프를 사용하여 필터 카세트와 샘플러의 바깥쪽을 감싸고 필터 카세트를 제자리에 고정하고 누출을 방지하기 위한 백업 씰 역할을 합니다. 채취 튜브가 바닥이 드러날 때까지 채취 튜브를 샘플러에 단단히 완전히 조이고 누출에 대한 2차 밀봉 역할을 하는 튜브 주위에 밀봉 테이프를 감습니다. 개인 에어로졸 샘플링을 수행하려면 샘플러를 사람의 호흡 영역 내에 두십시오.

샘플러를 옷깃, 어깨 또는 가슴에 부착한 다음 샘플링 펌프를 허리 높이나 배낭에 보관하십시오. 펌프를 켜고 1분 후에 펌프가 작동하는지 확인하십시오. 공기 샘플링이 완료되면 피험자로부터 공기 샘플러를 수집합니다.

밀봉 테이프를 제거하고 튜브의 나사를 푼 다음 캡을 씌웁니다. 필터 카세트의 세 번째 조각을 필터 위에 놓습니다. 먼저 70% 에탄올로 샘플링 카세트를 닦은 다음 카세트 개방 도구를 사용하여 샘플링 카세트를 엽니다.

그런 다음 필터 리프터를 사용하여 지지 패드를 들어 올리고 필터를 위쪽으로 올립니다. 그런 다음 필터 집게를 사용하여 필터를 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 멸균 메스로 필터를 6등분으로 자른 다음 300mg의 200-500마이크로미터 유리 구슬이 들어 있는 2밀리리터 강화 튜브에 넣습니다.

필터 함유 튜브를 액체 질소에 30초 동안 담근 다음 비드 밀 균질화기에 30초 동안 초당 4.5미터의 속도로 빠르게 놓습니다. 손상되지 않은 나머지 작은 필터 조각이 들어 있는 튜브에 0.5ml의 용해 버퍼를 추가한 다음 15ml 및 1.5ml 공기 샘플러 수집 튜브에 0.3ml의 용해 버퍼를 추가하고 튜브를 각각 10-15초 동안 수직 및 거꾸로 된 위치에서 와류로 회전시킵니다. 각 수집 튜브의 용해 버퍼를 300mg의 유리 구슬이 들어 있는 2ml 강화 튜브로 옮깁니다.

30 초 동안 구슬 선반 균질화기에 있는 관을 가공하고십시오, 그 후에 20, 22 섭씨 온도에 1 분 동안 중력에 표본을 분리기를 설치하십시오. 원심분리 후에, 메마른 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관에 있는 상등액을 옮기고 다시 20, 22 섭씨 온도에 1 분 동안 000배 중력에 상등액을 원심 분리하십시오. 30마이크로리터의 용해 시약을 첨가한 후 튜브를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 0.2ml의 결합 완충액과 100μg/ml의 Proteinase K를 튜브에 추가한 다음 튜브를 섭씨 70도의 블록 히터에서 10분 동안 배양하도록 둡니다. 마지막으로 각 튜브에 100마이크로리터의 이소프로판올을 추가합니다. 그런 다음 700마이크로리터 용량의 유리 섬유 필터 튜브를 2밀리리터 수집 튜브에 넣고 추출물 용액을 그 안에 옮깁니다.

다음 이동, 20, 000배 중력에 수집 관을 22 섭씨 온도에 30 초 동안 원심 분리하십시오. 원심분리 후 유리 필터 섬유를 새 수집 튜브에 삽입하고 수집 튜브를 폐기합니다. 각 관에 억제물 제거 완충액의 0.5 밀리리터를 추가하고 20, 22 섭씨 온도에 30 초 동안 중력에 000배 원심 분리를 지휘하십시오.

원심분리 후 수집 튜브를 버리고 필터 튜브를 새 수집 튜브에 넣습니다. 그런 다음, 각 튜브에 0.5 밀리리터의 세척 버퍼를 추가하고 다시 섭씨 22도에서 30초 동안 20, 000배 중력으로 원심분리합니다. 원심분리 후 수집 튜브를 버리고 새 튜브로 교체하십시오.

다시, 각 관에 세척 완충액의 0.5 밀리리터를 추가하고 22 섭씨 온도에서 30 초 동안 20, 000 배 중력으로 원심 분리기를 만듭니다. 어떤 잔여 세척 완충액든지 제거하기 위하여는, 마지막으로 20, 000배 중력에 수집 관을 22 섭씨 온도에 1 분 동안 원심 분리하고 수집 관을 버리고 새로운 그들로 대체하십시오. 100마이크로리터의 따뜻한 용리 완충액을 첨가한 후 실온에서 1-2분 동안 실험실 벤치에서 튜브를 배양하고 섭씨 22도에서 30초 동안 20, 000배 중력으로 수집 튜브를 원심분리합니다.

필터 튜브를 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 또 다른 원형 원심분리를 위해 용리액을 다시 도포합니다. 0.5 millil PCR 튜브를 사용하여 각 반응에 대해 이미 추출된 DNA의 5 마이크로리터와 함께 50 마이크로리터 반응을 3중으로 설정한 다음 thermocycler를 프로그래밍하고 사이클을 시작합니다. 세 가지 PCR 반응을 모두 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 함께 혼합합니다.

750 마이크로리터의 결합 완충액을 추가하고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 총 혼합물 450마이크로리터를 수집 튜브에 삽입된 스핀 컬럼에 추가하고 30초 동안 중력의 17, 900배에서 원심분리를 시작한 다음 여과액을 버리고 혼합물의 나머지 450마이크로리터를 추가하여 두 번째 원심분리를 수행합니다. 다시 여과액을 버리고 750마이크로리터의 세척 버퍼를 스핀 컬럼에 추가하고 섭씨 22도에서 30초 동안 17, 900배 중력으로 원심분리기를 합니다.

마지막으로 여과액을 버리고 섭씨 22도에서 1분 동안 17, 900배 중력에서 빈 기둥을 다시 회전시킵니다. 스핀 컬럼을 1.5ml 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 45마이크로리터의 용리 완충액을 피펫팅하고 실온의 실험실 벤치에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 섭씨 22도에서 1분 동안 17, 900배 중력으로 기둥을 원심분리합니다.

전기영동 챔버의 1배 TAE 완충액에 1%아가로스 겔을 담근 다음 2마이크로리터의 5배 로딩 완충액과 8마이크로리터의 증폭된 DNA를 혼합합니다. 마지막으로, 10마이크로리터의 샘플 전체를 DNA ladder와 함께 겔에 로드합니다. 젤을 75볼트에서 약 90분 동안 실행합니다.

대표적인 아가로스 겔은 직업적 공기 샘플에서 파생된 진균 게놈 DNA의 내부 전사된 스페이서 영역의 증폭을 보여줍니다. 맨 왼쪽의 차선은 DNA 마커 차선을 나타냅니다. 오른쪽의 밴드는 750에서 1, 000 염기쌍 범위의 다양한 직업 공기 샘플에서 증폭된 내부 전사된 스페이서 영역을 나타냅니다.

대표적인 크로나 차트는 실내 환경에서 다양한 분류학적 곰팡이 종의 존재를 보여줍니다. NIOSH 바이오 에어로졸 사이클론 샘플러는 가정에서 1시간 동안 바이오 에어로졸을 수집하여 존재하는 곰팡이 종을 확인하는 데 사용되었습니다. 표 형식의 데이터는 실내 환경에서 곰팡이 종의 다양성과 풍부도 지수를 나타냅니다.

데이터는 냉난방 및 증발 냉각기 환경에서 더 높은 Chao-1 Richness 지수, Shannon Diversity 지수 및 Bray-Curtis 비유사성 계수를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실내 및 직업용 공기 샘플을 수집하고 미생물 개체군 분석을 위해 게놈 DNA를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플의 미생물 오염을 방지하기 위해 최상의 무균 방법을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.