Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

이 염색질 확산 준비의 전반적인 목표는 포유류 난자 형성 전반에 걸쳐 염색질 결합 단백질의 동적 국소화 패턴과 난모세포의 염색체 형태를 연대순으로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 상동 염색체 쌍, 시냅스, DNA 복구 및 감수분열 염색체 분리와 같은 여성 생식 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 염색체와 관련된 단백질의 명확한 면역 표지 및 시각화와 난모 세포 ploidy의 평가를 가능하게 한다는 것입니다.

난자형성(Oogenesis)은 오류가 발생하기 쉬우며, 염색체 분리는 종종 유전적 질병을 초래합니다. 이 방법은 이수성 및 불임의 산모 원인에 대한 이해를 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 성교 후 14일에서 19일 사이에 암컷 쥐를 안락사시킨 후 복부 골반강에 V자 모양의 구멍을 만듭니다.

그런 다음 모계의 자궁 뿔을 제거합니다. 다음으로 태반에서 배아를 분리하고 참수하여 배아를 희생합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 3밀리리터의 PBS가 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.

그런 다음 강아지 한 마리를 따뜻한 PBS가 가득 찬 별도의 접시로 옮깁니다. 태아를 안락사시킨 후, 뒤쪽 절반의 복부 정중선을 따라, 앞다리 아래의 앞쪽 절반을 따라, 뒷다리와 꼬리 바로 위를 절단합니다. 그런 다음 3.5인치 가위를 사용하여 배아의 복부를 엽니다.

끝이 가는 집게를 사용하여 간과 장 고리를 옮기거나 제거하여 생식선을 노출시킵니다. 이제 생식선이 남성 생식선인지 암컷 생식선인지 확인하십시오. 난소는 신장 바로 아래와 뒤, 복막강의 후벽을 향해 있습니다.

끝이 가는 집게를 사용하여 양쪽 난소를 모두 제거하고 섭씨 37도로 유지되는 PBS가 들어 있는 작은 용기에 넣습니다. 모든 태아에서 난소를 채취하기 위해 신속하게 진행하십시오. 다음으로, 새로운 작은 용기에 각각의 개별 난소 세트를 갓 만든 하이포엑치 완충액 반 밀리리터에 완전히 담그십시오.

섭씨 25도에서 최소 15분 동안 배양하되 30분을 넘지 않도록 합니다. 배양하는 동안 소수성 장벽 PAP 펜을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 22 x 22mm 정사각형 두 개를 그립니다. 각 난소 세트에 대해 하나의 슬라이드를 준비합니다.

배양이 완료되면 100 밀리몰 자당을 50마이크로리터 방울 떨어뜨려 깨끗한 슬라이드에 넣고 난소 한 쌍을 방울로 옮깁니다. 이제 두 개의 27 게이지 바늘을 사용하여 난소를 자극하고 그 안의 세포를 풀어냅니다. 집게로 큰 난소 조각을 제거하고 버립니다.

그런 다음 자당 용액을 조심스럽게 피펫으로 피펫하여 방출된 세포를 분산시킵니다. 다음으로, 0.2%Triton X-100과 함께 40마이크로리터의 1%PFA가 있는 슬라이드의 각 사각형을 로드합니다. 피펫 팁을 사용하거나 슬라이드를 앞뒤로 흔들어 용액을 사각형 주위에 펴 놓습니다.

그런 다음 세포가 있는 자당 용액의 각 풀에 대해 20마이크로리터의 부유 세포가 있는 두 개의 고정 웅덩이를 로드하여 각 슬라이드에 한 세트의 난소에서 나온 세포가 있도록 합니다. MI 또는 MII 난모세포 채취의 경우 먼저 기증자 마우스를 준비하고 안락사시킵니다. 그런 다음 복부 골반강에 큰 V자 모양의 구멍을 만들고 집게를 사용하여 장을 옮겨 각 자궁 뿔을 찾습니다.

흉곽 근위부에 있는 난소를 찾습니다. 가는 집게로 난관을 잡고 절제 가위를 사용하여 난소보다 높은 지방을 자릅니다. 난관을 잡고 있는 동안 가는 집게를 사용하여 윤활낭에서 난소를 분리하고 난소를 섭씨 37도로 유지되는 배지가 들어 있는 채취 접시로 옮깁니다.

GV 단계 난모세포를 수집하려면 27게이지 바늘이 있는 1ml 주사기를 사용하여 큰 전방 난포를 수동으로 뚫어 적운-난모세포 복합체를 방출합니다. MII 단계 난모세포를 채취하려면 단순히 구멍을 뚫는 것이 아니라 난관의 앰풀라에 구멍을 뚫어 풀어줍니다. 이제 입으로 작동되는 유리 피펫 또는 모세관을 사용하거나 수동 마이크로미터 주사기를 사용하여 난모세포를 수집합니다.

일부 난모세포는 적운 세포로 둘러싸여 있을 수 있지만 다른 난모세포는 그렇지 않을 수 있습니다. MI 난모세포의 경우, 주변 적운 세포의 난모세포를 탈락시키기 위해 MEM-alpha/BSA에 신선한 히알루로니다아제를 준비합니다. 각 난모세포 채취에 대해 2.5ml의 준비된 히알루로니다아제와 함께 인큐베이터에서 3분 동안 처리합니다.

그런 다음 MI 난모세포를 갓 만든 따뜻한 MEM-alpha/BSA 배지로 옮깁니다. 거기에서 입으로 작동되는 유리 피펫을 사용하여 적운 세포를 완전히 분리하는 데 필요한 전단력을 제공합니다. 일반적으로 이 절차의 성공을 위해서는 입으로 작동되는 유리 피펫 또는 모세혈관을 사용하여 난모세포 수집 및 조작을 숙달해야 합니다.

난모세포가 인큐베이터에서 회복할 수 있도록 합니다. 한편, 가열된 9웰 유리판에 300마이크로리터의 따뜻한 Tyrode 용액을 로드합니다. 두 개의 웰에 300마이크로리터의 따뜻한 MEM-알파/BSA를 로드하고 한 웰에 300마이크로리터의 따뜻한 Waymouth's 배지를 로드합니다.

투명대를 제거하려면 5-10 MI 또는 MII 단계 난모세포를 해부 현미경으로 관찰하면서 30-45초 동안 Tyrode 용액의 수조로 옮깁니다. 투명대(zona pellucida)가 눈에 띄게 용해되면, 즉시 MEM-alpha/BSA 배지로 미리 적신 피펫을 사용하여 난모세포를 배지로 옮깁니다. 그런 다음 난모세포를 데워진 배지의 두 번째 욕조로 옮깁니다.

두 번째 목욕 후, 난모세포를 Waymouth의 따뜻한 배지로 옮기고 인큐베이터에서 30분 동안 회복시킵니다. 염색질 확산을 준비하려면 PAP 펜을 사용하여 유리 슬라이드에 11 x 44mm 직사각형을 그립니다. 다음으로 물에 0.2%Triton X-100을 1% PFA의 얇은 층으로 슬라이드를 코팅한 다음 슬라이드를 앞뒤로 흔들어 용액을 퍼뜨립니다.

그런 다음 슬라이드를 탭하여 초과분을 제거합니다. 이제 최소한의 배지로 5개에서 10개 사이의 난모세포를 빨아들입니다. 그런 다음 고착 용액을 통해 피펫 팁을 드래그하는 동시에 약 1cm 위에서 난모세포를 슬라이드에 떨어뜨려 난모세포를 준비된 슬라이드로 이동합니다.

난모세포는 즉시 파열되어 슬라이드에 염색질을 퍼뜨려야 합니다. 이제 밀폐된 가습실에서 실온의 슬라이드를 배양합니다. 염색질이 슬라이드에 부착되도록 하룻밤 동안 가라앉히십시오.

설명된 배아 염색질 수집은 C57 black/6J 배아에서 수확한 난모세포의 교차 형성을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. Prophase 염색질 확산 제제는 SYCP3, SYCP1 및 MLH1을 검출하기 위해 면역 표지되고 DAPI로 염색되었습니다. Pachytene-stage 염색체는 20개의 완전히 조립된 SC 구조를 따라 분포된 27개의 MLH1 병소를 가졌습니다.

확산 제제가 차선책이고 개별 염색체를 구별할 수 없는 경우, 제제는 평가에 포함되지 않았습니다. 양호한 제제에서, SMC6는 중심주위 헤테로크로마틴 영역과 염색체팔을 따라 농축되었고, MLH1 병소는 파키텐 단계에서 SC를 따라 분포되었습니다. 15개의 양호한 야생형 제제에서 MLH1 양성 교차의 수는 약 24개였습니다.

난모세포 수집 방법은 감수분열 재개 후 난모세포의 염색질 형태를 평가하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화(protein localization)와 배수성(ploidy)을 쉽게 평가할 수 있어 염색체 분리 오류의 잠재적 원인을 드러낼 수 있었습니다. 토포이소머라제 II-알파는 염색체팔과 중심주위 이염색질을 따라 볼 수 있습니다.

MII 난모세포에서 쌍을 이루는 자매 염색체는 염색체와 중심체 형태에 의해 구별될 수 있습니다. 일단 숙달되면 배양 없이 또는 배양 후에 이러한 기술을 마우스당 1-2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 전체 세포 난모세포 면역 표지 및 라이브 셀 이미징과 같은 다른 보완 방법을 수행하여 세포의 맥락 내에서 상동 염색체와 자매 염색체를 평가할 수 있습니다.

총체적으로, 여기에 설명된 염색질 확산 방법은 포유류의 난자 형성과 감수분열 중 염색체 및 단백질 역학의 성적으로 이형성된 특징을 평가하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.