Name: Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 학습하세요 마우스 난모세포에서 염색질 확산 준비법을 통해 염색질 결합 단백질과 염색체 형태를 시각화하는 방법을. 이 기술은 감수분열 염색체 분리 메커니즘과 여성 생식 건강 연구에 활용됩니다.

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이 작품 G.H. 하 세영 훈련 그랜트 화목에서 미국 국립 암 연구소 (NIH) (CA009110)와 NIGMS (R01GM11755) P.W.J에 의해 지원 되었다

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다. 야생-타입 C57BL/6J 쥐에 실험을 수행 했다.
1. 확산 수확 태아 또는 신생아 난소와 의향 Chromatin의 준비
<ol><li>14.5-19.5 일 배아 추출 게시물-coitum (dpc) 자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 임신 여성을 희생. 참고: 출생 후 하루 1-5 난소에 대 한 1.3 단계로 건너뜁니다. 그림 1 에 다른 배아 및 출생 연령대에 농축 meiotic 의향 단계 요약 되어 있습니다.</li>
	<li>살 균가 위, V 자형 오프닝 만들기를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 어머니 자 궁 경적 밖으로 dissect, 태아는 태에서 분리 하 고 35mm 페 트리 요리 미리 데워 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° c.에 x의 3 mL에 배아를 전송 참고: fliptop 인큐베이터 37 ° C에서 설정 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 무대 또한 난소 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>3.5 인치 수술가 위, 배아 또는 IACUC 지침에 따라 잘린 통해 새끼를 희생. 더 절 개 전에 미리 데워 공영에 잘린된 배아 또는 새끼를 배치 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 미리 데워 공영 3 mL를 포함 하는 별도 35 mm 페 트리 접시에 한 번에 하나의 배아 또는 강아지 해 부 앞 발 아래 앞쪽 절반 바로 위에 뒷 다리 사지 및 꼬리 그림 2A-B에 명시 된에 따라 배아의 후부 절반의 복 부 정중 선 따라 절단 하 여 진행 합니다.</li>
	<li>3.5 인치 수술가 위를 사용 하 여 복 부를 엽니다. 뾰족한 집게를 사용 하 여 치환 하거나 간, 창 자, 37 ° C에 미리 데워 공영 3 mL를 포함 하는 새로운 35mm 페 트리 접시에 난소를 노출의 루프를 제거 ( 그림 2B에 설명서 참조). 난소와 복 막 구멍 (그림 2B-C)의 후부 벽 쪽으로 신장 뒤에 바로 아래 있습니다. 남성과 여성의 생식 기 사이 차별에 대 한 가이드는 그림 차원에서 제공 됩니다. 참고: 최적의 조건에 대 한 신속 하 게 해 부 난소 밖으로 후 임신 여성 희생 이다.</li>
	<li>절 개 범위 및 시계 안경에서 뾰족한 집게의 쌍을 사용 하 여 각 여성 태아에서 양쪽 난소를 제거 하거나 멀티 잘의 별도 우물 접시 미리 따뜻하게 PBS의 0.5 ~ 1.0 mL를 포함 하 고 37 ° c.에 유지</li>
	<li>깨끗 한 시계 유리 또는 난소 comp를 담가 9-잘 접시의 작은 우물에서 0.5 mL hypo-추출 버퍼 (17mm trisodium 시트르산이 수화물, 50mm 자당, 5 mM EDTA, 0.5 m m DTT, 30 mM Tris HCl, 프로 테아 제 억제 물, pH 8.2)에 난소의 각 쌍을 배치 letely입니다. 적어도 15 분, 하지만 더 이상 30 분 품 어. 참고: 포 추출 버퍼 신선한 만들고 DTT 추가의 2 시간 이내에 사용.</li>
	<li>그림 3A와 같이 부 화, 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하는 동안 깨끗 한 유리 25 x 75 m m2, 1 m m 두께 현미경 슬라이드 22 x 22 m m2 사각형을 그립니다. 참고: 슬라이드 미리 준비 될 수 있습니다.</li>
	<li>깨끗 한 슬라이드에 100mm 자당의 45-50 µ L 플라스틱 하 고 드롭 난소의 한 쌍을 전송.</li>
	<li>자당 솔루션에 셀 출시 떨어져 난소를 애타게 두 27 G 바늘의 날카로운 끝을 사용 하 여. 집게, 난소의 큰 조각을 제거 하 고 신중 하 게 플라스틱 셀 분산 자당 솔루션.</li>
	<li>통 솔루션의 장소 40 µ L (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.2% 세제 ( 재료의 표참조), pH 9.2) 준비 된 슬라이드의 각 광장으로. 200 µ l 피 펫 팁, 슬라이드 표면 통 솔루션을 균등 하 게 확산.</li>
	<li>20 µ L 자당 믹스에는 정착 액을 포함 하는 슬라이드의 각 사각형의 플라스틱 참고:이 슬라이드 당 난소의 한 쌍을 사용 하는 것 같습니다.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 닫힌 습 챔버에서 슬라이드를 품 어. 참고: 야간 보육 주위 배열할 수 있다 (12-15 시간) 실내 온도에.</li>
	<li>챔버 뚜껑 열고 슬라이드 완전히 건조 허용 합니다.</li>
	<li>씻어 0.4% 일로 에이전트-PBS 솔루션 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드 2 분, 건조 한 공기 및 immunolabelling 프로토콜 (6 단계)로 이동 ( 재료의 표참조). 참고: 나중 사용을 위해-80 ° C에서 슬라이드를 저장할 수 있습니다 하지만 이것은 관심사의 단백질에 따라 다릅니다. 최적의 결과 대 한 immunolabelling 프로토콜 (6 단계)로 즉시 이동 합니다.</li>
</ol>2. 분열 나 Oocyte 컬렉션
<ol><li>각 마우스에서 격리 antral 낭의 수를 최대화 하려면 intraperitoneally 임신 암 말의 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG, 일컬어 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG))의 5 IU와 성적으로 성숙한 처녀 여성 쥐를 주사. 참고: 최적의 oocyte 수율에 대 한 쥐 해야 1 ~ 3 개월, oocytes 수확의 수 나이로 줄일 것 이다. -20 ° c.에 600 µ L의 단일 사용 aliquots에 살 균 PBS (5 U/0.1 mL) 저장소의 100 ml에서 5000 IU의 병 해산 PMSG를 준비 하려면</li>
	<li>44-48 h 후 준비 컬렉션 매체, 최소 필수 중간 알파 (MEMα) 매체 3 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 MEMΑ/BSA/FBS). 0.2 µ m 기 공 필터를 통해 미디어를 소독. MEMα/BSA/FBS 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에 따뜻하고 마우스 당 한 유리 그릇에 중간의 2.5 mL을 가만히 따르다. 참고: 다른 수집 및 상용 (m 2와 M16)는 문화 미디어도 자주 사용 됩니다. 주의: 조작 단계 동안 주변 공기 노출을 최소화 하기 위해 제한 된 기간 동안 한 번에 하나는 5% CO2 배양 기에서 문화 요리를 제거 것이 좋습니다.</li>
	<li>자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 쥐를 희생.</li>
	<li>큰 V 자형 여 만드는 살 균가 위를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 집게를 사용 하 여 창 자를 마우스의 머리 쪽으로 치환. 각 자 궁 경적을;를 찾습니다 난소는 흉 곽에 인접 제시 됩니다. 좋은 집게와는 수 란 관을 보유 하 고 해 부가 위 (그림 4)를 사용 하 여 난소에 지방 등을 잘라. 수 란 관, 그리고 좋은 집게의 또 다른 세트 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 컬렉션 접시로 부르사와 장소에서 난소 릴리스 계속. 참고: 1 단계에서 그것은 37 ° C에서 난소를 유지 하 고 5% CO2에 유지 하는 것이 필수적. 5% CO2 혼합 연결 fliptop 인큐베이터 온도 CO2 레벨의 최적의 유지 보수를 위해 수 있도록 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 단계 또한 oocyte 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용 한다.</li>
	<li>수동으로 큰 antral 낭을 puncturing 의해 적 운 oocyte 단지 릴리스 27 게이지 바늘 (또는 비슷한 크기), 1 mL 주사기를 사용 하 여.</li>
	<li>해 부 현미경을 통해 관찰 하는 동안 GV 준비 oocytes 입 운영 하는 유리 피 펫 또는 모 세관, 또는 수동 마이크로미터-주사기 (그림 5)를 사용 하 여 수집 합니다. 만 antral 낭에서 출시 된 oocytes를 수집 합니다. GV oocytes 약 90의 직경이 있다 µ m. GV oocytes granulosa 셀의 2-3 층으로 둘러싸여 있을 수 있고 약 200 µ m의 총 직경.</li>
	<li>깨끗 한 시계 유리 또는 분열에 도달 6 h에 대 한 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 9-잘 접시에 oocytes를 문화 나 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서.</li>
	<li>4 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>3. 분열 II (MII) Oocyte 컬렉션
<ol><li>Oocytes 각 마우스에서 분리를 최대화 하기 위해 intraperitoneally PMSG의 5 IU와 성적으로 성숙한 처녀 여성 쥐를 주사. 44-48 h 후 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 5 IU와 주사 intraperitoneally. 참고: 최적의 oocyte 수율에 대 한 쥐 해야 1 ~ 3 개월, oocytes 수확의 수 나이로 줄일 것 이다. HCG를 준비 하려면 10000 U 200 mL PBS의 병 해산 (5 U/0.1 mL). -20 ° c.에 600 µ L의 단일 사용 aliquots에 저장</li>
	<li>12-14 시간 후 2.2, 단계에서 설명한 것 처럼 MEMα/BSA/FBS 컬렉션 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 쥐를 희생.</li>
	<li>큰 V 자형 여 만드는 살 균가 위를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 집게를 사용 하 여 창 자를 마우스의 머리 쪽으로 치환. 각 자 궁 경적을 찾습니다, 그리고 난소 근 흉 곽에 제시 됩니다. 좋은 집게와는 수 란 관을 보유 하 고 해 부가 위 (그림 4)를 사용 하 여 난소에 지방 등을 잘라. 다음 난소와 수 란 관을 제거 하 고 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 컬렉션 접시에 놓습니다. 참고: 단계 1과 2에서 그것은 37 ° C에서 난소를 유지 하 고 5% CO2에 유지 하는 것이 필수적. 5% CO2 혼합 연결 fliptop 인큐베이터 온도 CO2 레벨의 최적의 유지 보수를 위해 수 있도록 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 단계 또한 oocyte 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용 한다.</li>
	<li>1 mL 주사기 27 G와 함께 (또는 비슷한 크기)를 사용 하 여 또는 날카로운 집게, MII oocytes를 해제 수 란 관의 ampulla에 구멍을 찢 어. 주: 수는 ampulla에 oocytes를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. ampulla가 나타납니다 부 어 반투명 되도록 oocytes는 표시 (그림 4).</li>
	<li>입 식 유리 피 펫 또는 모 세관, 또는 수동 마이크로미터-주사기 (그림 5)를 사용 하 여 컬렉션 매체와 새로운 그릇에는 수 란 관의 ampulla에서 MII oocytes를 수확.</li>
	<li>4 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>4. oocyte Denuding 및 Zona Pellucida 제거
<ol><li>보충 3 mg/mL BSA 주변 적 운 세포 (2.5 mL/마우스)는 시계 유리, 37 ° C, 5% CO2에서 계속의 oocytes를 발가 벗기다 MEMα 매체에 hyaluronidase의 300 IU/mL를 준비 합니다. 참고: Hyaluronidase 효능 준비의 1 시간 후 급격히 감소합니다. MII oocytes hyaluronidase 치료 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>Oocyte-적 운 세포 단지 주변 적 운 세포의 oocytes를 발가 벗기다를 3 분 MEMα/BSA에 hyaluronidase의 300 IU/mL를 노출 합니다. 주의: 그것에 oocytes를 손상 것 이다 hyaluronidase, 노출 3 분을 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>Oocytes는 세척, 신선한 oocytes 전송 MEMα/BSA 중간 접시를 따뜻하게 합니다. 작은 입 운영 하는 유리 피 펫 또는 모 세관 (oocyte는 대략 90 µ m의 직경 보다 약간 큰)을 사용 하, 복합물을 플라스틱 하 고 적 운 세포를 완전히 분리를. 다음 단계를 위해 준비 하는 동안 인큐베이터에 복구 oocytes를 허용 합니다.</li>
	<li>따뜻한 산 Tyrode의 솔루션, MEMα/BSA, 고 37 ° c (500 µ L/마우스) Waymouth의 미디어. 장소 300 µ L 작은 9 잘 유리 접시의 각 잘.</li>
	<li>Zona pellucida (ZP)를 제거 하려면 Tyrode의 솔루션으로 5-10 oocytes를 전송. 솔루션에만 30 ~ 45 s oocytes를 노출 합니다. 참고: 솔루션에 너무 작은 노출 제거 되지 않습니다는 ZP 완전히는 파열 및 확산에서 염색체는 oocytes를 방지할 것 이다. 너무 많이 노출 손상 하 고는 oocyte 죽 일 것입니다. 해 부 현미경 ZP 디졸브를 보고 노출 시간 최적화에 도움이 있습니다. 주의: 신선한 Tyrode의 솔루션을 사용 하는 중요 기능 나 이와 함께 감소입니다. Oocytes는 ZP의 균일 한 소화 되도록 치료의 각 그룹에 대 한 Tyrode의 솔루션의 신선한 잘을 사용 합니다.</li>
	<li>ZP 제거 직후에 oocytes 따뜻하게 MEMα/BSA/FBS 매체에 전송 하 여 세척. 이 세 단계를 반복 합니다. 참고: 전송, oocytes 쉽게 뭉쳐 것과 유리 피 펫 또는 모 세관 다음 제거는 ZP의 다는 것을 조심 하십시오. 유리 피 펫 또는 모 세관 Waymouth의 중간에 미리 일로 함께 튀어나와 oocytes 최소화 됩니다.</li>
	<li>전송 및 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 Waymouth의 중간에 30 분 동안 복구 oocytes를 허용.</li>
	<li>5 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>5. 미와 MII Oocyte Chromatin
<ol><li>PAP 펜을 사용 하 여 그림 6A와 같이 유리 슬라이드에 11 x 44 m m2 사각형을 그립니다.</li>
	<li>정착 액의 얇은 층으로 슬라이드 코트 (1 %paraformaldehyde, 0.2% H2O, pH 9.2 트리톤 X 100) 슬라이드에 정착 액의 100 µ L를 pipetting 앞뒤로 슬라이드 락을. 초과 정착 액의 제거를 누릅니다.</li>
	<li>가능한 작은 미디어와 작은 입 피 펫 바늘 5-10 oocytes 사이 선택 하 고 끌어 바늘 줄에 고정 제-코팅 슬라이드 통 솔루션으로 슬라이드 위에 1 cm에서 oocytes를 입금 하는 동안. Oocytes는 입금 되었습니다 하 고 그들은 버스트 있다 해 부 현미경을 사용 하 여이 단계를 수행 합니다. 참고:는 oocytes 슬라이드에 즉시 폭발 한다. 높이 oocytes는 영향 chromatin 확산의 정도 입금. 자세한 내용은 그림 6 에 대표적인 결과 참조 하십시오.</li>
	<li>닫힌된 습도 챔버에 하룻밤 준수 chromatin 있도록 실 온에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>완전히 건조 린스 0.4% 일로 에이전트-H2O, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드를 슬라이드 수 있습니다.</li>
	<li>6 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>6입니다. Immunolabelling
<ol><li>표 1에 설명 된 항 체 희석 버퍼 (ADB)를 준비 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼 (WB) 솔루션 (ADB PBS에 희석 10%)의 50 mL를 포함 하는 두 개의 Coplin 항아리와 50 mL WB와 0.05% 세제 솔루션을 포함 한 Coplin jar 준비 (예를 들어, 50 mL WB에 10% 세제의 250 µ L을 추가).</li>
	<li>워시 슬라이드 섹션 1과 5 10 분 동안이 프로토콜의 WB의 50 mL를 포함 하는 하나의 Coplin jar에서에서 준비 했다. 주의: 슬라이드 immunolabelling 중 어느 시점에서 말리 게 하지 마십시오.</li>
	<li>워시 Coplin jar 포함 50 mL WB와 0.05% 세제 용액에서 10 분에 대 한 슬라이드. 그런 다음 나머지 Coplin jar 10 분에 대 한 WB 솔루션 50 mL를 포함 하는 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>ADB에서 희석 하는 선택한 기본 항 체의 100 µ L 초과 액체와 커버 슬라이드 누릅니다. 닫힌된 습 챔버에 하룻밤 4 ° C에서 품 어. 참고: 부 화 3 2 단축 될 수 있다 37 ° c.에 시간 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예, 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다.</li>
	<li>0.2% 일로 에이전트-PBS 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>6.2에서 6.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>ADB에 희석 된 이차 항 체의 100 µ L 초과 액체와 커버 슬라이드 누릅니다. 슬라이드 2 1 품 어 닫힌된 습 실에서 37 ° C에서 시간.</li>
	<li>워시 Coplin 단지 0.2% 일로 에이전트-PBS 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 10 분에 대 한 2 번 슬라이드.</li>
	<li>워시 Coplin 단지 0.2% 일로 에이전트-H2O 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 5 분에 대 한 2 번 슬라이드.</li>
</ol>7. 마운트 슬라이드
<ol><li>의향 chromatin 확산 단계 2에서에서 준비, 100 µ L 4', 6-diamidino-2-phenylindole를 포함 하는 설치 매체의 추가 (DAPI, 1.5µg / mL). 미와 MII chromatin에서 준비 단계 5 확산, 대 추가 DAPI를 포함 하는 설치 매체의 50 µ L (1.5µg / mL). 부드럽게 멀리 초과 액체를 되 리.</li>
	<li>22 m m x 60 m m coverslip 위에 배치 하 고 명확한 매니큐어와 인감. 형광 현미경 검사 법을 통해 평가까지 4 ° C 또는-20 ° C에서 슬라이드 상자에 저장 합니다. 참고: 탭 커버 슬립에 가볍게 매니큐어와 씰링 전에 초과 설치 매체를 제거 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

Chromatin 확산 준비 시간순으로 여성 포유류 감수 분열 및 관련된 단백질의 동적 지역화를 공부 하는 연구자를 수 있습니다. 배아 및 신생아 chromatin 스프레드 meiotic 의향에 걸쳐 이벤트의 가까운 분석 하실 수 있습니다. 분열 중 기 나 고 분열 II chromatin 스프레드 단일 자매를 구별 하는 데 사용 수에서 chromatids 쌍 자매 및 쌍된 동종 염색체 뿐만 아니라 ploidy 평가. 비교 함으로써, 여기서 설명 하는 프로토콜 수 유리한 자주 배경 신호 chromatin-바인딩 단백질의 해상도 감소 하는 높은 수준의 생성 전체 oocyte immunolabelling에 비해. 게다가, chromatin 확산 기법 라이브 셀 이미징, 시간 및 특수 장비의 큰 투자를 요구 하는 매력적인 대안을 나타냅니다.
배아 및 신생아 난소를 찾아서 추출 어려울 수 있습니다. 신중 하 게 다른 모든 장기와 난소에 대 한 검색 및 각 태아/강아지 (<strong cl...

Spermatogenesis, 동안 meiotic 세균 세포의 큰 반동기 파도 신속 하 고 지속적으로 충만 한 사춘기와 성인 기1에 걸쳐 발병에 고환에. 남성, 달리 여성에서 감수 분열은 태아 개발 중 유일 하 게 시작 됩니다. 출생, 다음 oocytes 체포 의향의 장기간된 dictyate 단계에 남아 나는 그대로 germinal 소포 (GV; 핵 봉투) 사춘기까지. 사춘기의 개시에 oocytes의 하위 집합을 성장과 성숙, meiotic 재개의 개시를 표시 주기적으로 선택 됩니다. Meiotic 재개 가득 oocytes에서 germinal 기 쇠 약 (GVBD)로 알려진 프로세스에서 GV의 실종에 의해 명시 됩니다. oocyte는 염색체 응축 및 분리, 극 지 몸 밀어 남에 의해 다음 다음 겪 습. Oocytes는 MII 진행 시 체포 되 고 수정 후에 두 번째 그리고 마지막 meiotic 부문 완료 자극.
여성 불 임은 매우 meiotic 의향의 성공에 따라 달라 집니다 내가 진행. 이 핵심은 동종 염색체 크로스 오버 재결합2를 통해 유발된 DNA 이중 가닥 틈 (DSBs)의 수리에 의해 중재 chiasmata로 알려진 사이의 물리적 링크의 형성 이다. 이 프로세스는 동적 단백질이 풍부한 비 계 라고 자신의 synapsis3촉진 하기 위하여 상 동 염색체 사이 형성 하는 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 컨텍스트 내에서 발생 합니다. 사우스 캐롤라이나 지퍼 처럼 노사 정 구조 이다 중앙 지역 단백질에 의해 연결 된 2 개의 병렬 측면 요소 구성 된 지속적인 DNA 수리에 걸쳐 함께 homologs를 보유 하 고. Synapsis, 이전 축 요소 라는 측면 요소의 선구자 형성 자매 사이 chromatids. SYCP2 및 SYCP3 같은 synaptonemal 복잡 한 단백질 초기 의향 동안 자매 chromatid 결합 축에 colocalize 축 요소를 형성 합니다. 나중에 이러한 역할을 가로 필 라 멘 트 단백질, SYCP1, 중앙 요소 어셈블리 및 정렬된 homologs4사이 synapsis 용이 대 한 사이트를 바인딩. 마우스 oocytes에서 완전 한 synapsis 표시 됩니다 20의 존재에 의해 완전히 겹치는 chromatin를 사용 하 여 구상 될 수 있다 SYCP3와 SYCP1 뻗어 확산 준비. Synapsis는 pachytene substage, 그것에 의하여 homologs 사이의 양식 chiasmata 운명 성숙한 크로스 꾸며져 홍보 그들의 정확한 처리5,6 mutL 체 (MLH1/3) 이합체에 진입 시 완료 , 7. cohesin, condensin, 및 SMC5/6 복잡 한, 포함 하는 염색체 (SMC) 단지의 구조 유지 염색체 역학 및 감수 분열8,9, 전체 구조 규제에 대 한 중요 하다 10,,1112. 이러한 이벤트는 사우스의 해체 다음 스핀 들 극 반대를 상 동 염색체의 올바른 bi 방향을 보장 하는
Meiotic 세포 주기 프로그램된 유도 및 DNA DSBs의 후속 수리 유지 보수 게놈에서에서 다양 한 단백질의 역할을 검사 하는 강력한 모델입니다. 또한, 포유류 감수 분열 후 성적인 수정 및 각 인13의 연구에 대 한 관련 모델 이기도합니다. 그러나, 포유류 (그림 1) 태아 및 신생아 난소에서 여성 감수 분열 동안 이러한 이벤트를 평가 하기 위해 기술적으로 어렵습니다. 의향 나 5 substages로 나눌 수 있습니다: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema 및 dictyate. 여기, 우리가 격리 태아 및 신생아 난소와 고환 (그림 2) 사이 구별 하는 방법을 설명 합니다. 앞에서 설명한 방법에서 적응이 원고 또한 프로토콜 (1 단계) 여성 meiotic 의향의 준비에 대 한 비디오 데모와 함께 설명 난 chromatin 확산14,,1516,17 . 6-7 단계에 설명 된 대로 immunolabelling와 결합 하면이 프로토콜 사용 의향의 상세한 현미경 분석 나 oocytes에서 이벤트.
Oogenesis 오류가, 이며 첫 번째 meiotic 부문 중 염색체 missegregation 이벤트 자손18,19에서 유전자 질환의 가장 일반적인 소스를 나타냅니다. 이 원고 (프로토콜 단계 2), 우리는 성숙한 GV 준비 oocytes 성인 여성 쥐의 끝났다 난소에서 추출 되는 프로토콜을 설명 합니다. 지원 조건 가득 oocytes 고립과 문화20다음 감수 분열의 황 호르몬 독립 재개를 받 다. Meiotic 재개 다음 oocytes 감수 분열을 통해 진행, 다음 분열 II에 체포. . 을 수정 하지 않는 한 oocytes 유지 분열 II에서 체포 단계 2-5, 우리가 이전에 보고 된 프로토콜, 문화를 수집 하 고 chromatin 확산 준비21MI와 MII oocytes를 준비 하는 방법을 설명 하는 비디오 데모와 함께 적응. 기술 확산이 chromatin 염색체와 관련 된 단백질의 명확한 immunolabelling 수 있습니다. 또한,이와 일가 염색체 사이 구별 하는 데 사용 수 프로토콜과 단일 자매 해결 더 수 oocyte ploidy의 평가 촉진 하기 위하여 chromatids. 따라서, meiotic 단백질의 지 방화 패턴을 공개, 뿐만 아니라이 프로토콜 수 역할도 elucidating MI와 MII 동안 염색체 missegregation의 잠재적인 원인에 대 한 귀중 한 도구.

<table><tbody><tr><td>10X 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4</td><td>품질 생물학적</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60mm x 15mm 페트리 접시</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mm 페트리 접시</td><td>Denville</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>해부&nbsp; 가위, 날카로운 팁, 41/2"</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>시계 유리 광장 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>매번 사용하기 전에 오토클레이브</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>트리소듐 시트레이트 이수화물</td><td>시그마</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스</td><td>시그마</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>사용 직전 저장성 완충액에 추가</td></tr><tr><td>50x 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>11873580001</td> 사용 <td>직전 저장성 완충액에 추가</td></tr><tr><td>바늘이 있는 Turberculin 주사기(1cc, 27G x 1/2인치)</td><td>Becton, Dickinson(BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>골드 씰 울트라 프로스트 유리 슬라이드(25X75mm, 두께 1mm)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 펜, 대형 (액체 차단제)</td><td>전자 현미경 과학 (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 수성</td><td>전자 현미경 과학 (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>원고 내 세제</td></tr><tr><td>면역 염색 수분 챔버</td><td>에버그린</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>코플린 항아리</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>74257</td><td>원고의 습윤제</td></tr><tr><td>임산부 암말 혈관 성선 자극 호르몬 (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>-20C에서 부분 표본 저장</td></tr><tr><td>인간 융모성 성선 자극 호르몬 (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>-20C에서 부분 표본 저장</td></tr><tr><td>9개의 오목한 공동이 있는 PYREX Spot Plates</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>매번 사용하기 전에 오토클레이브</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>난모 세포 수집 바늘 제작</td></tr><tr><td>브랜드 Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>난모 세포 수집 바늘 제작</td></tr><tr><td>용 라텍스 고무 튜브 (내경 3.2mm x 외경 6.4mm)</td> <td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>난모 세포 수집 바늘 제작</td></tr><tr><td>라텍스 고무 튜브 (내경 6.4mm x 외경 11.1mm)</td> <td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>난모 세포 수집 바늘</td></tr><tr><td>제작 용 유연한 실리콘 고무 노즈 피스, 단단한 플라스틱 마우스 피스 및 15 인치 라텍스 튜브</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>난자 수집 바늘</td></tr><tr><td>Mitutoyo 마이크로 미터 헤드</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>난자 수집 바늘 제작</td></tr> 용 <tr><td>주사기 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>난모 세포 수집 바늘 주</td></tr><tr><td>사기 필터 0.45 &mu; m 필터</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>난모 세포 수집 바늘 제작용</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫 5 3/4 "</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>난모 세포 수집 바늘</td></tr><tr><td>제작 83 x 0.5 mm 피펫 팁</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>난모 세포 수집 바늘</td></tr> <tr><td>제작 용 및 알파;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth의 미디어</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>11220035</tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>피셔</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마</td><td>A3311</td><td>난모 세포 배양 매체</td></tr><tr><td>용 500ml 필터 유닛 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode ' s 솔루션</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>-20C에서 부분 표본 저장</td></tr> 호스 <tr><td>세럼</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>ADB/세척 완충액</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td>용 <td>Sigma</td><td>A1470</td><td>ADB/세척 완충액</td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 슬라이드(22mmx60mm)</td><td>가</td> 있는 페이드 방지 장착 매체Fisher <td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>투명 매니큐어</td><td>아마존</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>희석 계수 - 1:100</td></tr><tr><td>토끼 anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>희석 인자- 1:1000</td></tr><tr><td>염소 항-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>희석 계수- 1:50</td></tr><tr><td>인간 항-중심체 단백질</td><td>항체 통합</td><td>15-235</td><td>희석 인자- 1:100</td></tr><tr><td>토끼 항-TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>희석 인자- 1:100</td></tr><tr><td>마우스 항-히스톤 H4 (디 메틸 K20, 트리 메틸 K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>희석 계수- 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Rec8</td><td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>희석 계수- 1:10,000</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG (H + L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>희석 계수 - 1:500</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG (H + L) Alexa Fluor 488 접합체</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>희석 계수 - 1:500</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG (H + L) Alexa Fluor 647 접합체</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-31573</td><td>희석 계수 - 1:500</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H + L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>희석 계수 - 1:500</td></tr><tr><td>염소 anti-Human IgG (H + L) 교차 흡착 된 2 차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>희석 계수 - 1 : 500</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (H + L) Alexa Fluor 568 접합체</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>희석 계수 - 1 : 500</td></tr></tbody></table>

chromatin 확산 마우스 oocyte 진행 의향에서 분열 ii의 분석에 대 한 준비

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin 확산 기법 gametogenesis spermatogenesis 위해 특히 동안 다양 한 단백질의 동적 지역화를 평가 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 이러한 기술을 synapsis 및 DNA 복구 동종 염색체, 페어링 등 meiotic 이벤트 기간 동안 단백질 및 DNA 지역화 패턴의 시각화 하실 수 있습니다. 문학에서 몇 가지 프로토콜 설명 되었습니다, 포유류 의향 oocytes를 사용 하 여 일반 chromatin 확산 기술을 제한 하 고 태아 난소에서 감수 분열 개시의 타이밍 때문에 어려운 있습니다. 비교에서는, 의향 spermatocytes 기정을 위한 필요 없이 더 높은 수익률을 젊은 남성 쥐에서 수집할 수 있습니다. 그러나, 특정 단계 청소년 및 성인 고환에 meiotic 및 포스트 meiotic 생식 세포 인구의 때문에 셀의 순수한 동기화 된 인구를 어렵습니다. 감수 분열의 후기, oocytes 성숙한 oocytes의 그룹의 성인 여성 쥐에서 수집 하 고 문화 감수 분열 재개를 자극 수 있기 때문에 내가 (미) 또는 감수 분열 II (MII), 감수 분열을 겪고을 평가에 유리 하다. 여기, oocytes를 사용 하 여 확산 meiotic chromatin 준비 방법에서 태아, 신생아 해 부와 성인 난소 동반 비디오 데모와 함께 설명 되어 있습니다. 염색체 missegregation 이벤트 포유류 oocytes에는 자주, 특히 미 중입니다. 이러한 기술 평가 oogenesis의 다양 한 단계 다른 돌연변이 또는 환경 노출의 효과 특성을 사용할 수 있습니다. 내 설명은 감수 분열 동안 염색체 단백질 역학의 성적으로 동종이 형 기능과 포유류 oogenesis의 우리의 이해를 증가 하는 귀중 한 oogenesis spermatogenesis 사이 뚜렷한 차이가 있기 때문에, .

우리는 시각화 및 oocytes meiotic 염색체를 평가 대 한 두 가지 기법을 설명 했습니다. 첫 번째 기술은 배아 및 신생아 난소에 의향 진행 평가 쪽으로 음식을 제공 했었죠. 의향 chromatin 확산 준비 중 감수 분열, 페어링, synapsis 염색체를 포함 하 여 수많은 동적 프로세스를 시각화에 대 한 매우 귀중 한 하 고 desynapsis, 동종 재결합 하 고 개장 하는 epigenetic 염색체. 여기, 우리는 증명 하고있다 강력한 시각화에 대 한이 메서드의 유틸리티 및 oocytes C57BL/6J 배아에서 수확에 크로스 오버의 정량 분석 (그림 3B 및 3c). 셀 pachytene substage에 풍부 하 게 마우스 배아 18.5 dpc (그림 1)에서 검색 했다. 두 가지 ...

포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

이 염색질 확산 준비의 전반적인 목표는 포유류 난자 형성 전반에 걸쳐 염색질 결합 단백질의 동적 국소화 패턴과 난모세포의 염색체 형태를 연대순으로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 상동 염색체 쌍, 시냅스, DNA 복구 및 감수분열 염색체 분리와 같은 여성 생식 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 염색체와 관련된 단백질의 명확한 면역 표지 및 시각화와 난모 세포 ploidy의 평가를 가능하게 한다는 것입니다.난자형성(Oogenesis)은 오류가 발생하기 쉬우며, 염색체 분리는 종종 유전적 질병을 초래합니다. 이 방법은 이수성 및 불임의 산모 원인에 대한 이해를 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 성교 후 14일에서 19일 사이에 암컷 쥐를 안락사시킨 후 복부 골반강에 V자 모양의 구멍을 만듭니다.그런 다음 모계의 자궁 뿔을 제거합니다. 다음으로 태반에서 배아를 분리하고 참수하여 배아를 희생합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 3밀리리터의 PBS가 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.그런 다음 강아지 한 마리를 따뜻한 PBS가 가득 찬 별도의 접시로 옮깁니다. 태아를 안락사시킨 후, 뒤쪽 절반의 복부 정중선을 따라, 앞다리 아래의 앞쪽 절반을 따라, 뒷다리와 꼬리 바로 위를 절단합니다. 그런 다음 3.5인치 가위를 사용하여 배아의 복부를 엽니다.끝이 가는 집게를 사용하여 간과 장 고리를 옮기거나 제거하여 생식선을 노출시킵니다. 이제 생식선이 남성 생식선인지 암컷 생식선인지 확인하십시오. 난소는 신장 바로 아래와 뒤, 복막강의 후벽을 향해 있습니다.끝이 가는 집게를 사용하여 양쪽 난소를 모두 제거하고 섭씨 37도로 유지되는 PBS가 들어 있는 작은 용기에 넣습니다. 모든 태아에서 난소를 채취하기 위해 신속하게 진행하십시오. 다음으로, 새로운 작은 용기에 각각의 개별 난소 세트를 갓 만든 하이포엑치 완충액 반 밀리리터에 완전히 담그십시오.섭씨 25도에서 최소 15분 동안 배양하되 30분을 넘지 않도록 합니다. 배양하는 동안 소수성 장벽 PAP 펜을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 22 x 22mm 정사각형 두 개를 그립니다. 각 난소 세트에 대해 하나의 슬라이드를 준비합니다.배양이 완료되면 100 밀리몰 자당을 50마이크로리터 방울 떨어뜨려 깨끗한 슬라이드에 넣고 난소 한 쌍을 방울로 옮깁니다. 이제 두 개의 27 게이지 바늘을 사용하여 난소를 자극하고 그 안의 세포를 풀어냅니다. 집게로 큰 난소 조각을 제거하고 버립니다.그런 다음 자당 용액을 조심스럽게 피펫으로 피펫하여 방출된 세포를 분산시킵니다. 다음으로, 0.2%Triton X-100과 함께 40마이크로리터의 1%PFA가 있는 슬라이드의 각 사각형을 로드합니다. 피펫 팁을 사용하거나 슬라이드를 앞뒤로 흔들어 용액을 사각형 주위에 펴 놓습니다.그런 다음 세포가 있는 자당 용액의 각 풀에 대해 20마이크로리터의 부유 세포가 있는 두 개의 고정 웅덩이를 로드하여 각 슬라이드에 한 세트의 난소에서 나온 세포가 있도록 합니다. MI 또는 MII 난모세포 채취의 경우 먼저 기증자 마우스를 준비하고 안락사시킵니다. 그런 다음 복부 골반강에 큰 V자 모양의 구멍을 만들고 집게를 사용하여 장을 옮겨 각 자궁 뿔을 찾습니다.흉곽 근위부에 있는 난소를 찾습니다. 가는 집게로 난관을 잡고 절제 가위를 사용하여 난소보다 높은 지방을 자릅니다. 난관을 잡고 있는 동안 가는 집게를 사용하여 윤활낭에서 난소를 분리하고 난소를 섭씨 37도로 유지되는 배지가 들어 있는 채취 접시로 옮깁니다.GV 단계 난모세포를 수집하려면 27게이지 바늘이 있는 1ml 주사기를 사용하여 큰 전방 난포를 수동으로 뚫어 적운-난모세포 복합체를 방출합니다. MII 단계 난모세포를 채취하려면 단순히 구멍을 뚫는 것이 아니라 난관의 앰풀라에 구멍을 뚫어 풀어줍니다. 이제 입으로 작동되는 유리 피펫 또는 모세관을 사용하거나 수동 마이크로미터 주사기를 사용하여 난모세포를 수집합니다.일부 난모세포는 적운 세포로 둘러싸여 있을 수 있지만 다른 난모세포는 그렇지 않을 수 있습니다. MI 난모세포의 경우, 주변 적운 세포의 난모세포를 탈락시키기 위해 MEM-alpha/BSA에 신선한 히알루로니다아제를 준비합니다. 각 난모세포 채취에 대해 2.5ml의 준비된 히알루로니다아제와 함께 인큐베이터에서 3분 동안 처리합니다.그런 다음 MI 난모세포를 갓 만든 따뜻한 MEM-alpha/BSA 배지로 옮깁니다. 거기에서 입으로 작동되는 유리 피펫을 사용하여 적운 세포를 완전히 분리하는 데 필요한 전단력을 제공합니다. 일반적으로 이 절차의 성공을 위해서는 입으로 작동되는 유리 피펫 또는 모세혈관을 사용하여 난모세포 수집 및 조작을 숙달해야 합니다.난모세포가 인큐베이터에서 회복할 수 있도록 합니다. 한편, 가열된 9웰 유리판에 300마이크로리터의 따뜻한 Tyrode 용액을 로드합니다. 두 개의 웰에 300마이크로리터의 따뜻한 MEM-알파/BSA를 로드하고 한 웰에 300마이크로리터의 따뜻한 Waymouth's 배지를 로드합니다.투명대를 제거하려면 5-10 MI 또는 MII 단계 난모세포를 해부 현미경으로 관찰하면서 30-45초 동안 Tyrode 용액의 수조로 옮깁니다. 투명대(zona pellucida)가 눈에 띄게 용해되면, 즉시 MEM-alpha/BSA 배지로 미리 적신 피펫을 사용하여 난모세포를 배지로 옮깁니다. 그런 다음 난모세포를 데워진 배지의 두 번째 욕조로 옮깁니다.두 번째 목욕 후, 난모세포를 Waymouth의 따뜻한 배지로 옮기고 인큐베이터에서 30분 동안 회복시킵니다. 염색질 확산을 준비하려면 PAP 펜을 사용하여 유리 슬라이드에 11 x 44mm 직사각형을 그립니다. 다음으로 물에 0.2%Triton X-100을 1% PFA의 얇은 층으로 슬라이드를 코팅한 다음 슬라이드를 앞뒤로 흔들어 용액을 퍼뜨립니다.그런 다음 슬라이드를 탭하여 초과분을 제거합니다. 이제 최소한의 배지로 5개에서 10개 사이의 난모세포를 빨아들입니다. 그런 다음 고착 용액을 통해 피펫 팁을 드래그하는 동시에 약 1cm 위에서 난모세포를 슬라이드에 떨어뜨려 난모세포를 준비된 슬라이드로 이동합니다.난모세포는 즉시 파열되어 슬라이드에 염색질을 퍼뜨려야 합니다. 이제 밀폐된 가습실에서 실온의 슬라이드를 배양합니다. 염색질이 슬라이드에 부착되도록 하룻밤 동안 가라앉히십시오.설명된 배아 염색질 수집은 C57 black/6J 배아에서 수확한 난모세포의 교차 형성을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. Prophase 염색질 확산 제제는 SYCP3, SYCP1 및 MLH1을 검출하기 위해 면역 표지되고 DAPI로 염색되었습니다. Pachytene-stage 염색체는 20개의 완전히 조립된 SC 구조를 따라 분포된 27개의 MLH1 병소를 가졌습니다.확산 제제가 차선책이고 개별 염색체를 구별할 수 없는 경우, 제제는 평가에 포함되지 않았습니다. 양호한 제제에서, SMC6는 중심주위 헤테로크로마틴 영역과 염색체팔을 따라 농축되었고, MLH1 병소는 파키텐 단계에서 SC를 따라 분포되었습니다. 15개의 양호한 야생형 제제에서 MLH1 양성 교차의 수는 약 24개였습니다.난모세포 수집 방법은 감수분열 재개 후 난모세포의 염색질 형태를 평가하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화(protein localization)와 배수성(ploidy)을 쉽게 평가할 수 있어 염색체 분리 오류의 잠재적 원인을 드러낼 수 있었습니다. 토포이소머라제 II-알파는 염색체팔과 중심주위 이염색질을 따라 볼 수 있습니다.MII 난모세포에서 쌍을 이루는 자매 염색체는 염색체와 중심체 형태에 의해 구별될 수 있습니다. 일단 숙달되면 배양 없이 또는 배양 후에 이러한 기술을 마우스당 1-2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 전체 세포 난모세포 면역 표지 및 라이브 셀 이미징과 같은 다른 보완 방법을 수행하여 세포의 맥락 내에서 상동 염색체와 자매 염색체를 평가할 수 있습니다.총체적으로, 여기에 설명된 염색질 확산 방법은 포유류의 난자 형성과 감수분열 중 염색체 및 단백질 역학의 성적으로 이형성된 특징을 평가하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

chromatin-spread-preparations-for-analysis-mouse-oocyte-progression

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

우리는 성숙한 초파리 난모세포의 수집, 준비 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 방법을 사용하면 염색체 거동과 방추체 조립 및 감수분열 중 기능을 시각화할 수 있습니다.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다.

말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

학습하세요 마우스 난모세포에서 염색질 확산 준비법을 통해 염색질 결합 단백질과 염색체 형태를 시각화하는 방법을. 이 기술은 감수분열 염색체 분리 메커니즘과 여성 생식 건강 연구에 활용됩니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

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