Name: 2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 학습하세요 2차원 젤 전기영동과 질량분석법을 결합하여 인간 뇌하수체 선종 조직의 프로테옴을 분리하고 동정하는 방법입니다. 이 기술은 저발현 단백질까지 정밀하게 식별하여 암 단백질체 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 중국 (보조금 번호 81572278 및 81272798 XZ), 중국 "863" 계획 프로젝트 (XZ 부여 제 2014AA020610-1), 재능에 대 소개 (XZ) Xiangya 병원 기금과는 호남에서 보조금의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원 되었다 중국의 지방 자연 과학 재단 (XZ에 보조금 번호 14JJ7008). 저자는 또한 테네시 대학 건강 과학 센터에서 박사 도미 닉 M. Desiderio의 과학적 기여를 인정합니다. X.Z. 지속적으로 개발 2001 년부터 시작 하는 뇌 하 수 체 adenoma 프로테옴 분석 2DE MS 방법을 사용, 현재 원고에 대 한 개념을 잉태, 쓴 원고를 수정, 조정 관련 업무, 그리고에 대 한 책임은 금융 지원 및 해당 작업입니다. Y.L. 원고 개정에 참가 했다. Y.H 참조, 컬렉션 및 원고 개정에 참가 했다. 모든 저자는 최종 원고를 승인 했다.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

저자는 관심사의 충돌은 선언 합니다.

우리의 장기 프로그램-인간의 NFPA proteomic 변화와 분자 메커니즘의 해명에 대 한 분자 네트워크 변화를 연구 하는 proteomics의 사용에에서 2DE, 2DE MS PMF 등 2DE-MS/MS, MS 방법을 함께 성공적으로 사용 하 고 NFPAs에 대 한 효과적인 바이오 마커의 발견입니다. 좋은 재현성 2DE 기반 비교 proteomics NFPA proteomic 유사9,10,,1112,13, 의 식별에 중요 한 역 19, 그리고 2DE 항 체 메서드 함께 보여줍니다 주어진된 포스트 번역 상 수정 검출 및 티로신 nitration1...

PA 인간의 내 분 비 시스템에 중요 한 역할을 하는 시상 하 부-뇌 하 수 체-대상 기관 축 시스템에 인간의 뇌에서 발생 하는 일반적인 종양 이다. PA 임상 기능 및 작동 하지 않는 파 (FPA 및 NFPA)1,2포함 되어 있습니다. NFPA 어렵습니다 초기 단계 진단 및 치료에 크게 혈액3,4 해당 호르몬의 수준을 증가 FPA에 비해 혈액에만 약간 상승된 호르몬 수준 (예를 들어, LH 및 FSH) 때문에 ,5. 분자 메커니즘의 명확 하 고 효과적인 바이오 마커의 발견 진단, 치료, 및 NFPA의 예 후에 중요 한 임상적 의미가 있다. 우리의 장기 목표는 개발 하 고 proteomic 메서드를 사용 하 여 그것의 분자 메커니즘을 명확 하 게 믿을 수 있는 바이오 마커의 발견을 위한 NFPA를 공부 하 고 효과적인 치료 대상 진단 및 예 후 마커 인식입니다. 2-데 MS 방법으로 결합 된 인간 PA 프로테옴1,2,6,7, 프로테옴 참조의 설립을 포함 하 여에 대 한 장기 연구 프로그램에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 3,8, 차동 표현한 단백질 프로필9,10,11,,1213, 호르몬 변종14의 분석 지도 ,15, 인 산화14 티로신 nitration16,,1718같은 포스트 번역 상 수정, 상대적으로 침략의 proteomic 변형 비 침범 성 NFPAs19, 그리고 NFPA 하위13, 여러 중요 한 통로 네트워크 (미토 콘 드 리아 기능 장애, 세포 주기 dysregulation, 산화 스트레스와 MAPK 신호의 발견에 지도 proteomic이 시스템 이상)는 NFPA13,,1920에 변경 될 수 있습니다.
2DE 분리 단백질 그들의 전자 점 (pI) (전자 포커스, IEF) 및 분자량 (나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법, SDS 페이지)를 통해1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. 이것은 프로테옴 199524proteomics의 개념의 도입 이후, proteomics의 분야에서 일반적이 고 고전적인 분리 기술 이다. MS는 2DE 분리 단백질, PMF 및 MS/MS 전략 등의 정체성을 찾기 위한 중요 한 기술입니다. 검출 감도 및 해상도, 함께 LC 시스템의 개선의 측면에서 특히 MS 계기의 아주 급속 한 발전은 크게 향상 극대화 프로테옴에서 낮은 또는 매우 낮은 풍부한 단백질의 id는 프로테옴의 적용 범위입니다. 그것은 또한 유일한 한 우리의 전통적인 개념을 도전 또는 두 2D 젤 복잡 한 인간의 조직 프로테옴의 분석에서 자리에 단백질과 2D 젤 복잡 한 인간의 조직 분석에 자리에 있는 여러 단백질을 확인할 수 있는 기회를 제공 한다 프로테옴 NFPA 프로테옴의 범위를 극대화.
여기 우리 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS의 상세한 프로토콜 설명/MS, 그리고 2DE-LC-MS/MS 인간의 NFPA 프로테옴의 분석에서 성공적으로 사용 되었습니다. 프로토콜 포함 준비 샘플, 먼저 치수 (전자 포커스, IEF), 두 번째 차원 (SDS 페이지), 단백질 (실버 얼룩 및 Coomassie 파란 얼룩)의 시각화, 분석에서 젤 트립 신 소화, 2D 젤의 이미지 tryptic 펩 티 드, PMF, MS/MS, 및3,8,,2526타는 듯한 데이터베이스의 정화. 또한,이 프로토콜은 쉽게 다른 인체 조직 proteomes의 분석에 대 한 변환합니다.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGphor 3&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>등전체 포커싱 시스템.</td></tr><tr><td>Ettan DALTsix 멀티겔 캐스터</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALT II System</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>수직 전기영동 시스템</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 스트립 홀더</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix 멀티겔 캐스터</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>멀티겔 캐스터</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp;</td><td>ABI, 포스터 시티, 캘리포니아</td><td></td><td>MALDI-MS PMF</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td><td>MALDI-MS/MS 질량</td></tr>분석기 <tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>ESI-MS/MS 질량</td></tr>분석기 <tr><td>EASY-nano LC 시스템&nbsp;</td><td>Proxeon Biosystems, 덴마크</td><td></td> 오덴세 <td>고성능 액체 크로마토그래피 시스템</td></tr><tr><td>PepMap C18 트랩 컬럼&nbsp;</td><td>300 &뮤; M ID &시간; 5mm 길이; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 칼럼</td><td>75 &mu; m i.d., 15cm 길이; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>김와이프</td><td>킴바이프&nbsp;</td><td></td> 불<td>용성 종이 타월</td></tr><tr><td>Watter</td><td>PURELAB flex instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron 모델 P710/35 호모게나이저</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp; Hercules, CA</td><td></td><td>2D 젤 이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (버전 번호 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DataExplore (버전 4.0.0.0) 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>MS 스펙트럼 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Mascot 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>PMF 기반 단백질 검색 소프트웨어&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>마스코트 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>MS/MS 기반 단백질 검색 소프트웨어</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 소프트웨어 v.1.3 베타</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 소프트웨어 v.2.1</td><td></td><td></td><td>MS/MS 데이터 수집 관리 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>Uniprot 버전 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>인간 단백질 데이터베이스</td></tr><tr><td>SEQUEST(버전 번호 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MS 기반 단백질 검색 소프트웨어 I</td></tr><tr><td>마스콧 (버전 2.3.02)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MS 기반 단백질 검색 소프트웨어 II</td></tr><tr><td>C18 ZipTip 마이크로컬럼</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass 표준 키트&nbsp;</td><td>퍼스펙티브 바이오시스템스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피어스 BCA 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>써모&nbsp; Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>2-D 퀀트 키트</td><td>GE 헬스케어</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-ACRYLAMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>ACRYLAMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>IPG 완충액 pH 3-10, NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>이모빌 드라이 스트립 pH 3-10NL, 18cm</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

인간의 뇌 adenoma (PA)는 시상 하 부-뇌 하 수 체-대상 기관 축 시스템에 인간의 뇌에서 발생 하 고 임상 기능 또는 작동 하지 않는 PA (FPA 및 NFPA)으로 분류 될 수 있습니다 일반적인 종양 이다. NFPA 초기 단계 진단 및 치료 때문에 간신히 FPA에 비해 혈액에 호르몬을 높이기 어렵습니다. 우리의 장기 목표 PA 분자 메커니즘의 명확 하 고 효과적인 진단, 예 후 마커 및 치료 대상의 인식에 대 한 신뢰할 수 있는 biomarkers를 proteomics 메서드를 사용 하는 것입니다. 여기에 제시 된 효과적인 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 방법으로 결합 했다에서 젤 이미지 분석, 단백질 시각화, 2 차원 젤 전기 이동 법, 샘플의 준비를 포함 하 여 인간의 PA proteomes를 분석 하 트립 신 소화, 펩 티 드 대량 지문 (PMF), 및 탠덤 질량 분석 (MS/MS). 2 차원 젤 전기 이동 법 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS, 그리고 2DE-액체 크로마토그래피 (LC) MS/MS 절차 성공적으로 적용 된 NFPA 프로테옴의 분석에서. 높은 감도 질량 분석기를 사용 하 여, 많은 단백질 각 2D 젤 인간의 PA 프로테옴의 범위를 최대화 하기 위해 복잡 한 PA 조직 분석에 자리에서 2DE-LC-MS/MS 방법으로 확인 했다.

1. 2DE MALDI MS PMF: 위에서 설명한 실험 절차, 150 µ g 단백질의 총 FSH 표현 NFPA 조직에서 추출 되었다 (여성, 50 세, ACTH (-), GH (-), PRL (-), (-) LH, FSH (+), 및 TSH (-))는 18 cm에 배열 하는 고 IPG 스트립 (pH 3-10 NL) 그리고 대형 SDS 페이지 젤, 다음은 얼룩과 시각. 우리가 얻은 1.98 ± IEF 방향으로 0.75 m m의 평균 위치 편차와 NFPA 조직 프로테옴 (그림 1), 및 1.62 ± 0.68 m m SDS 페이지 방향에 약 1200 단백질 반점의 재현성 및 좋은 2DE 젤 패턴 pH 4-8 및 대량 15-150 kDa3의 영역 내에 주로 배 부 되었다 2DE 젤 지도에서 발견. 총 337 젤 명소 excised 되었고 젤 d...

여기, 우리는 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 분리 하 고 좋고 재현할 2DE 패턴 선물 인간의 뇌 adenoma 조직 프로테옴 식별과 함께 제시. 많은 단백질은 고감도 석사의 사용과 복잡 한 암 프로테옴을 분석할 때 각 2DE 자리에 관찰 됩니다.

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

질량 분석 절차와 결합된 이 2차원 젤 전기 이동법의 전반적인 목표는 인간적인 뇌하수체 선종 조직 proteome를 분리하고 확인하기 위한 것입니다. 이 방법은 단백질체 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 프로테옴의 높이와 같은.그리고 단백질 상황, 단백질 4 및 단백질 넓은의 발견. 이 기술의 주요 장점은 2차원 겔 전기영동이 고감도 질량 분석법과 쉽게 결합되어 단백질체, 특히 저농도 단백질을 식별한다는 것입니다. 단백질 상황, 단백질 4, 단백질 넓은.이 기술의 구현은 동물 치료의 PQ itery로 향하는 경향이 있습니다. 단백질에 대한 핵심 단백질 때문에 넓거나 단백질 패턴은 환자 진단에 유용합니다. 우리는 2차원 겔 전기영동 단계가 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 몇 가지 실험적인 트릭이 있기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시연이 중요하다는 것을 보여줍니다.이 절차를 시작하려면 이전에 준비된 단백질 샘플 용액 250마이크로리터를 13cm IPG 스트립 홀더의 각 슬롯에 추가합니다. 18cm IPG 스트립을 젤 면이 아래로 향하게 하여 기포가 생기지 않도록 주의하면서 각 단백질 샘플 용액에 놓습니다. 그런 다음 각 IPG 스트립을 덮기 위해 3-4 밀리리터의 미네랄 오일을 추가합니다.다음으로, 각 IPG 스트립 홀더를 백 플레이트의 뾰족한 끝과 전면 플레이트의 사각형 끝이 있는 등전체 초점 시스템에 조립합니다. 실온에서 18시간 동안 IPG 스트립을 재수화한 후 총 실행 시간이 7.5시간 및 36, 875볼트시인 등전 초점 시스템에서 IEF 매개변수를 설정합니다. IEF 후 등전 초점 시스템에서 각 IPG 스트립을 꺼내고 불용성 종이 타월로 과도한 미네랄 오일을 제거합니다.그런 다음 각 스트립을 플라스틱 랩으로 싸서 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 12%PAGE 겔을 주조하려면 이중 증류수, 1.5몰 트리스-염산 완충액, 40%아크릴아미드, 비스-아크릴아미드 원액, 10%과황산이듐을 넣고 비커에 시간을 맞춥니다. 젤 용액을 부드럽게 섞고 거품이 생기지 않도록 주의하십시오.겔 용액을 예상 겔 높이인 19cm까지 멀티 캐스팅 챔버에 부드럽게 붓습니다. 즉시 약 3ml의 이중 증류수를 멀티 캐스팅 챔버에 추가하여 각 분해 겔을 덮고 각 겔이 약 1시간 동안 중합되도록 합니다. 이 단계는 고품질 SDS-PAGE 젤을 준비하는 데 매우 중요하며 물은 각 젤 상단에 즉시 첨가해야 합니다.2리터의 전기영동 완충액을 준비한 다음 완충액을 전기영동 분리 장치 완충 탱크에 추가합니다. 냉동실에서 집속이 맞춰진 IPG 스트립을 꺼낸 후 1ml의 환원 평형 완충액과 미량의 브로모페놀 블루가 들어 있는 플라스틱 용기에 넣고 부드럽게 흔들면서 10분 동안 평형을 이룹니다. 환원 평형 완충액을 제거한 후 IPG 스트립에 4ml의 excalation 평형 완충액과 미량의 브로모페놀 블루를 추가하고 부드러운 흔들림으로 10분 동안 평형을 이룹니다.겔 평형 상태에서 멀티 캐스팅 챔버를 분해하고 준비된 분해 겔 카세트를 제거합니다. 젤 카세트를 이중 증류수로 세 번 헹군 다음 불용성 종이 타월로 젤 카세트에서 접근 물을 제거하고 젤 스탠드에 놓습니다. 그런 다음 평형을 이룬 IPG 스트립을 전기영동 버퍼로 헹구고 불용성 종이 타월로 각 IPG 스트립 표면의 과도한 액체를 제거합니다.IPG 스트립을 리졸브 SDS-PAGE 젤에 올려 놓아 IPG 스트립의 플라스틱 면이 왼쪽의 뾰족한 끝과 더 긴 유리판에 닿도록 합니다. 이제 신속하게 3-4 밀리리터의 뜨거운 1 % 아가로 스 및 SDS 전기 영동 버퍼를 추가하여 각 SDS-PAGE 젤 상단의 IPG 스트립을 밀봉하고 IPG 스트립의 상단을 더 짧은 유리 플레이트의 상단에 놓고 거품을 피하도록주의하십시오. 이 단계는 IPG 스트립을 SDS-PAGE 젤에 밀봉하는 데 매우 중요합니다.뜨거운 아가로스 용액을 즉시 첨가해야 하며 IPG 스트립을 SDS 젤 상단에 즉시 삽입해야 합니다. 중합 후, 조립된 겔 카세트를 수직 전기영동 시스템의 플라스틱 개스킷 사이에 수직으로 삽입합니다. IPG 스트립이 있는 젤 상단을 음극 옆에 놓습니다.다음으로, 전기영동 시스템에 적절한 부피의 완충액을 추가하여 겔 카세트를 담그도록 전기영동 버퍼의 수준을 조정합니다. 전원 공급 장치를 일정한 볼륨으로 연결 및 설정하십시오.tage 모드를 선택하고 염료를 모니터링하면서 약 370분 동안 200볼트에서 실행합니다. 실행이 완료된 후 전기 영동 시스템에서 젤 카세트를 꺼내고 젤이 찢어지지 않도록 주의하면서 젤 카세트에서 젤을 부드럽게 제거합니다.250ml의 고정 용액이 들어 있는 트레이에 젤을 조심스럽게 옮기고 20분 동안 젤을 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 용액을 버리고 트레이에 250 밀리리터의 50 % 메탄올을 첨가하십시오. 그런 다음 젤을 10분 동안 부드럽게 흔듭니다.이중 증류수에 겔을 흔든 후 0.02%의 황산나트륨을 함유한 감작 완충액 250ml를 첨가합니다. 젤을 1분 동안 부드럽게 흔듭니다. 이중 증류수에 겔을 두 번 흔든 후 은 반응 용액 250ml를 넣고 겔을 20분 동안 부드럽게 흔듭니다.이중 증류수로 겔을 흔든 후 현상액 250ml를 넣고 원하는 염색이 얻어질 때까지 부드럽게 흔듭니다(일반적으로 1-3분). 이제 250ml의 5%산성을 첨가하여 염색을 종료하고 젤을 10분 동안 부드럽게 흔듭니다. 이중 증류수에 겔을 흔든 후 8.8% 글리세롤 250ml를 넣고 분석할 때까지 겔을 섭씨 4도에서 보관합니다.NFPA 조직 단백질체의 재현 가능하고 좋은 2차원 젤 패턴은 pH 4에서 8 및 질량 15에서 150 kilodaltons의 지역 내에서 주로 분포된 2차원 젤 맵에서 검출된 약 1, 200개의 단백질 반점을 가진 겔 전기영동에서 얻어졌습니다. MALDI-MS PMF 분석에서 분석된 337개의 겔 반점 중 141개의 겔 반점에서 총 192개의 중복 단백질이 확인되었으며 나머지 196개 반점에서는 단백질이 확인되지 않았습니다. commassie blue로 염색하면 침습성 NFPA 조직 단백질체의 재현 가능하고 고품질의 2차원 겔 패턴을 얻을 수 있었고 pH 4-8 및 질량 15-150 킬로달톤의 범위 내에서 주로 분포된 2차원 겔 맵에서 검출된 약 1, 100개의 단백질 반점을 얻을 수 있었습니다.반점당 평균 1개의 단백질이 MALDI tof tof MS 분석을 통해 확인되었습니다. 여기서 각 해당 지점의 많은 단백질이 LC-ESI-MS/MS 분석으로 식별되었습니다. 이 데이터는 각 2차원 겔 스폿이 복잡한 인간 암 조직 단백질체에 많은 단백질을 포함하고 있음을 명확하게 보여줍니다.일단 지배해, 이 기술은 제대로 실행되는 경우에 2차원 젤 전기 이동법을 위한 32 시간에서 끝날 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 특히 프로토콜에 따라 단계를 따르는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 단백질체의 단백질 코드화와 같은 추가 질문에 답하기 위해 안정적인 라벨링과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 단백질 믹스 분야의 연구자들이 모델 조건, 환자 및 장기 시스템에서 더 큰 규모의 저농도 단백질 포스트 번역 변형, 단백질 전문화, 단백질 공간 및 단백질 4를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 본 후에, 당신은 질량 분석법과 결합된 2차원 젤 전기 이동법을 실행하고, 좋은 재현 가능한 2차원 젤 전기 이동법 본을 달성하고, 각 반점에 있는 많은 단백질을 확인하는 방법의 좋은 이해가 있어야 합니다. SDS achreomy 및 TEMED로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 플라스틱 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

two-dimensional-gel-electrophoresis-coupled-with-mass-spectrometry

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 인간 비기능성 뇌하수체 선종(NFPA)의 종양 조직에서 얻은 복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 2차원 겔 전기영동 방법을 보여줍니다. 단백질은 1차원에서 전하를 기준으로 분리되고 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

출처: Wulf, M., et.al.  뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일에 대한 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세해부 기반 프로토콜. J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 인간의 사후 뇌 조직에서 분리한 뉴로멜라닌 과립(NMG)의 펩타이드 시료 분석을 보여줍니다. 펩타이드는 먼저 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분리한 다음 질량 분석법으로 분석하여 질량 대 전하 비율(m/z)을 측정합니다. 표적 펩타이드는 번역 후 변형을 식별하기 위해 단편화되고 결과 데이터는 NMG의 단백질체 프로파일을 결정하기 위해 참조 데이터베이스와 비교됩니다.

인간 뇌 조직에서 분리된 뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일에 대한 LC-MS/MS 분석

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

암세포 단백질체에 대한 심층 분석은 새로운 약물 표적 및 진단 바이오마커의 식별을 용이하게 합니다. 우리는 액체 및 고체 종양에서 유래한 암세포 하위 집단에서 (인) 단백질체의 정량 분석을 위한 실험적 워크플로우를 설명합니다. 이는 세포 농축 전략과 정량적 Super-SILAC 기반 질량 분석법을 결합하여 달성됩니다.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

이 프로토콜은 임상 샘플에서 단백질의 다중 반응 모니터링 (MRM)에 대한 트리플 쿼드러폴 질량 분광계의 사용을 소개하는 것을 목표로합니다. 우리는 샘플 준비에서 임상 샘플을 위한 데이터 분석에 이르기까지 필요한 모든 예방 조치를 취하도록 체계적인 워크플로우를 제공했습니다.

인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

이 방법은 히스톤 단백질형 특성화 및 조사를 위한 간단하고 빠른 전략을 설명합니다.

2D-TAU 젤 전기영동을 이용한 히스톤 프로테오폼 공개

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편에서 분리된 관심 영역을 사용하여 질량 분석 기반 단백질체학 방법을 확립합니다. 이 프로토콜은 보관된 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편의 특정 조직 영역에서 단백질체를 분석하는 데 사용됩니다.

선택된 조직 영역을 사용하는 질량 분석 기반 단백질체학을 위한 간소화된 접근법

이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 이용해 교모세포종 샘플로부터 충분한 고품질 신생혈관 조직을 성공적으로 준비하여 종양 혈관형성의 정량적 단백질체학 분석을 수행하여, 전통적으로 주로 혈관형성 인자에 초점을 맞춘 연구의 한계를 극복하고 교세포종 혈관신생의 대규모 단백질체학 프로파일을 제공하였습니다.

종양 혈관신생의 정량적 단백질체학 분석을 위한 인간 교모종 조직에서 신생혈관 조직 준비

학습하세요 2차원 젤 전기영동과 질량분석법을 결합하여 인간 뇌하수체 선종 조직의 프로테옴을 분리하고 동정하는 방법입니다. 이 기술은 저발현 단백질까지 정밀하게 식별하여 암 단백질체 연구에 활용됩니다.

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

더 많은 동영상 탐색