Name: 효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 학습하세요 Sleeping Beauty 시스템을 사용하여 인간 원래 세포에 유전자를 안정적으로 통합하는 방법을 배우세요. 이 기술은 유전자 치료 연구에서 효율적인 유전자 전달을 가능하게 합니다.

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우리 교수 Zappavigna, 모 데 나 대학, 레지오 에밀리 아, 모 데 나, 이탈리아 pCCL PGKrtTA2S제공에 대 한 감사 합니다-m 2 플라스 미드. 우리 또한 pCMVSB100X 및 pT2/BH 플라스 미드에 대 한 교수 Z. Ivics (폴 Ehlrich 연구소, 랑겐, 독일)와 교수 Z. Izvak (Max Delbruck 센터 분자 의학, 베를린, 독일)를 인정합니다. 이 작품은 데 브라 국제 및 이탈리아어 정부 대학 및 연구에 의해 지원 되었다.

1입니다. 플라스 미드 고용
참고: 플라스 미드 pCCL-PGKrtTA2S-m 2는 친절 하 게 교수 Zappavigna (모 데 나 대학 및 레지오 에밀리 아, 모 데 나, 이탈리아)에 의해 제공. PCMVSB100X 플라스 미드 활동적인 transposase의 코딩 시퀀스를 들고와 pT2/BH transposon 플라스 미드 친절 하 게 제공한 교수 Z. Ivics (폴 Ehrlich 연구소, 랑겐, 독일)와 교수 Z. Izvak (Max Delbruck 센터 분자 의학, 베를린, 독일)입니다.
<ol><li>대장균 (대장균)에 모든 복제에 대 한 선택과 제한 효소 절차의 복제 전략 또는 복제할 파편의 PCR 증폭을 따릅니다. 주: 표 1 이 프로토콜에 플라스 미드의 모든 요약 합니다. 대 한 설명 및 각 플라스 미드에 대 한 참조가 제공 됩니다.</li>
</ol>2. 바이러스 성 벡터 생산
참고: 모든 바이러스 성 벡터는 기관 규칙 및 규정에 따라 BSL2 biosafety 견제 수준에서 생물 학적 후드에서 생산 됩니다.
<ol><li>Dulbecco의 수정이 글 중간에 문화 부착 HEK293T 세포 10 %HyClone 혈 청, 스-100 U/mL 페니실린와 2mm 글루타민 보충.</li>
	<li>하루 0: 5 15 cm 접시/바이러스 준비 및 매체의 30 mL에 씨앗 5.5x106 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>제 1 일: Transfection<ol>
<li>Transfection를 시작 하기 전에 2 x HEPES 버퍼 식 염 수 (HBS) 100 mL를 준비: NaCl (5m) 5.6 mL HEPES (1 M) 10.0 mL 나2HPO4 (0.5 M) 0.3 mL 살 균 84.1 mL 물 PH 7.1 37%에 조정 HCl. 참고: 2 x HBS는 4 ° c.에 저장 될 수 있다 정확한 pH 효율적인 transfection에 대 한 매우 중요 하다. 최적의 pH 범위는 7.10 7.12.</li>
		<li>매체를 제거 하 고 추가 transfection 전에 신선한 중간 4 h의 22.5 mL/접시.</li>
		<li>HEK293T 셀 전송 플라스 미드, pMD.Lg/pRRE.D64VInt 포장 플라스 미드, pMD2.G 봉투 인코딩 플라스 미드와 pRSV-레 브 (표 1) 다음 금액/접시에 transfect: 플라스 미드 25.00 µ g를 전송 pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µ g pMD2.G 8.75 µ g pRSV-레 브 6.25 µ g 참고: 플라스 미드 DNAs CsCl 프로토콜 Maniatis22 또는 내 무료 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 설명에 따라 준비 됩니다.<ol>
<li>Resuspend 살 균 물의 1.125 ml DNA (4 플라스 미드의 혼합)의 56.25 µ g을 2.5 M CaCl2 (솔루션)의 125 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>살 균 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 (솔루션 B)에 2 x HBS의 1.250 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>추가 솔루션 (1.250 mL) B (1.250 mL)에 dropwise 버블링 하는 동안 1 개 또는 2 mL 피 펫 (transfection 솔루션, 총 볼륨 2.500 mL).</li>
			<li>실 온 (RT)에서 20 분 동안 품 어.</li>
			<li>Dropwise 셀 단층 transfection 솔루션 (2.500 mL)의 모든 배포 P1000 micropipette를 사용 하 여.</li>
		</ol>
</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2에서 셀 문화 인큐베이터에서 밤새 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주 2: 매체를 제거 하 고 15 mL 신선한 매체의 추가 (단계 2.1 참조).</li>
	<li>제 3 일: 수집 하 고 집중 lentiviral 입자 포함 된 상쾌한.<ol>
<li>모든에서 상쾌한 (~ 70 mL)를 수집 (n = 5) transfected 세포 판, 0.45 μ m PESS 필터링 및 2 polyallomer 튜브 (1 인치 x 3.5 인치) 작성을 통해 필터 / 바이러스 준비.</li>
		<li>브레이크를 가진 15 ° C에서 2.5 h 106000 x g에서 ultracentrifugation에 의해 벡터 입자를 집중.</li>
		<li>즉시 부드럽게 ()을 피하기 위해 튜브에 펠 릿의 물의 resuspension ultracentrifugation를 중지 한 후 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에는 상쾌한을 부 어 및 1 x PBS의 100 µ L에 2 겨우 보이는 알갱이 일시 중단 (+ 1 %BSA). 이 펠 릿은 명확 하 고 매우 작은 정상입니다. 집중된 벡터 갓, 또는 aliquot를 사용 하 고 바이러스 준비-80 ° c.에 저장 주의:는 상쾌한 lentiviral 입자를 생물 학적 폐기물에서 폐기 하기 전에 철저 하 게 표백 해야 합니다 포함 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>바이러스 성 벡터 준비 적정, 에이즈-1 개 그 p24 immunocapture 키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 사용 합니다. 참고: 바이러스 성 벡터 생산 표준화, 리 기반 시 약 채택 될 수 있었다. 그럼에도 불구 하 고, 바이러스 성 벡터 titer는 transfection 효율 및 플라스 미드 DNA의 순도 매우 의존 합니다.</li>
</ol>3. 인간의 세포 라인 (예를 들어, HeLa 세포)의 변환
참고: HeLa 세포는 Dulbecco의 수정된 독수리의 매체와 10% 태아 종 아리 혈 청, 스-100 U/mL 페니실린, 2mm 글루타민 보충으로 경작 된 표 1 은이 프로토콜에서 사용 하는 벡터의 모든 요약 되어 있습니다. 각 벡터에 대 한 설명을 제공 합니다. 헬러 세포 변환 두 IDLV 벡터의 좋은 복용량 조합에 SB transposase의 transcriptional 규칙의 확인을 수 있습니다. IDLV 복용량의 벡터 입자 적정 및 대상 셀 형식을 관련이 있을 수 있습니다.
<ol><li>하루 0: 3 ml 6 잘 플레이트의 각 음에 대 한 매체의 씨앗 2 x 105 셀. 4 우물을 준비 합니다.</li>
	<li>HeLa 세포의 제 1 일: 변환입니다.<ol>
<li>각 조건에 대 한 희석 lentiviral 벡터 1 mL 매체의 마지막 볼륨 (위의 참고 참조) polybrene (최종 농도 8 μ g/mL)의 10 μ의 존재: 잘 # 1에 대 한 희석: 모의 불리고 셀 (부정적인 제어). 잘 # 2에 대 한 희석: IDLVTKSB 벡터 (2600 p24의 ng). 웰 스 #3, # 4에 대 한 희석: IDLVTKSB 벡터 (2600 p24의 ng) + IDLVrtTA2s-M2 벡터 (9600 p24의 ng).</li>
		<li>HeLa 세포 주 0에 도금 했다 각 우물에서 매체를 제거 하 고 해당 잘 lentiviral 벡터 희석을 추가 합니다.</li>
		<li>Spinoculate에서 20-25 ° C, 및 다음 이전 6 잘 플레이트 37 ° C, 5% CO2셀 문화 인큐베이터에서 45 분 754 x g 6 잘 플레이트.</li>
		<li>6 h 후 모든 우물에 신선한 매체와 매체 포함 벡터를 대체 하 고 추가 doxycycline 잘 # 4에 1 μ M. 48 h에 대 한 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 접시를 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주 3: RNA 추출에 대 한 셀 펠 릿의 준비.<ol>
<li>세포를 분리 하기 전에 트립 신 작업 솔루션 (1x) 준비: 2.5 %trypsin (10 배) 5.0 mL 500 mM EDTA (최종 농도 = 5 m m) 0.5 mL mL PBS 44.5 x 1</li>
		<li>사용 하기 전에 37 ° C에서 따뜻한 trypsin 작업 솔루션입니다. 4 ° c.에 트립 신 작업 솔루션 저장</li>
		<li>매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀. 각 우물을 미리 데워 진된 37 ° C의 트립 신 작업 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 (셀 문화 인큐베이터)에서 7 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>부 화 후 추가 포함 하는 혈 청 0.5 mL trypsin 및 원심 분리기 튜브에 수집 셀 비활성화를 각 잘 중간. 1 x PBS의 3 mL에 각 잘 한 번 헹 구 고 5 분 240 x g 세포 현 탁 액을 원심.</li>
		<li>1 x PBS, 240 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 하 고 상쾌한 삭제. 갓 수집된 셀 펠 릿을 사용 하 여 또는-80 ° c.에 저장 반 정량적 RT-PCR을 수행 하기 위해 펠 릿에서 총 RNA 추출 (6 단계 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 인간의 1 차 셀 (예를 들어, keratinocytes)의 변환
참고: 인간의 기본 keratinocytes 치명적 방사능된 3T3-J2 셀 (피더 레이어)23, 연의 Barrandon (EPFL, 로잔, 스위스)에서 종류 선물에 시드 있습니다.
<ol><li>Dulbecco의 수정이 글 중간 10% 기증자 소 혈 청, 스-50 U/mL 페니실린, 4mm 글루타민 (3T3 매체)와 보완에 스위스 마우스 J2 3T3 세포 성장.</li>
	<li>Keratinocytes 류 매체, Dulbecco의 수정이 글 중간에 햄의 F12 매체 혼합물 (3:1) 치명적 방사능된 3T3-J2 세포를 소 태아 혈 청 (10%), 페니실린-스 (1%), 글루타민 (2%), 인슐린 (5 µ g/mL), 아데닌 (를 포함 하는 도금을 성장합니다 0.18 m m), 하이드로 코 티 손 (0.4 µ g/mL), 콜레라 독 소 (0.1 nM), 및 triiodothyronine (2 nM).</li>
	<li>하루 0: 시드 3 x 105 치명적 3T3 J2 셀, 이전 1 X 105 셀/mL, 6 잘 플레이트의 각 우물에서의 최종 농도에 3T3 매체로 희석 반구. 9 웰 스를 준비 합니다.</li>
	<li>기본 keratinocytes의 제 1 일: 변환 참고: keratinocytes의 변환 (여 qRT-PCR) 두 IDLV 벡터의 좋은 복용량 조합에 SB transposase의 transcriptional 규칙의 부 량 수 (cytofluorimetric에 의해 통합의는 GOI (GFP) 대상 셀에서을 확인 하려면 분석)입니다.<ol>
<li>세포를 분리 하기 전에 트립 신 작업 솔루션을 준비: 0.5 트립 신-EDTA % (10 배) 5.0 mL 500 mM EDTA (최종 농도 = 5 m m) 0.5 mL mL PBS 44.5 x 1</li>
		<li>사용 하기 전에 37 ° C에서 따뜻한 trypsin 작업 솔루션입니다. 4 ° c.에 트립 신 작업 솔루션 저장</li>
		<li>문화에 subconfluent keratinocytes를 분리 하려면 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀 각 우물을 미리 데워 trypsin 작업 솔루션의 1 mL를 추가. 셀 문화 인큐베이터에서 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>Resuspend 우물의 세포는 부 화 후 철저 하 게 포함 하는 혈 청의 2 개 mL를 포함 하는 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 매체 (많은 세포는 여전히 연결 되어 있다면, 품 어 37 ° C에서 추가 분에 대 한). 3 mL PBS 또는 신선한 매체 x 1의 각 잘 한 번 헹 구 고 린스 솔루션 세포 현 탁 액을 원심 관에 추가.</li>
		<li>580 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>1 x PBS, 580 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 1.6x105 keratinocytes 류 매체, 각 조건에 대 한 희석의 1 mL에 희석.</li>
		<li>Polybrene (2 mL의 최종 볼륨에서 8 µ g/mL의 최종 농도)의 20 μ 존재 류 매체의 1 mL에 lentiviral 벡터 희석: 웰 스 #1, #2, # 3에 대 한 희석: 모의 불리고 셀 (부정적인 제어 벡터 없이). 웰 스 #4, # 5에 대 한 희석: IDLVTKSB 벡터 (13000 p24의 ng) + IDLVrtTA2s-M2 벡터 (48000 p24의 ng). 희석 우물 #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB 벡터 (13000 p24의 ng) + IDLVrtTA2s-M2 벡터 (48000 p24의 ng) + IDLVT2 벡터 (9,160 p24의 ng).</li>
		<li>해당 keratinocyte 정지 (1 ml에서 1.6x105 keratinocytes)에 각 lentiviral 벡터 희석 (1 mL)을 추가 하 여 셀에에서 transduce.</li>
		<li>치명적 방사능된 3T3-J2 셀 0 및 그들에 불리고 플레이트 keratinocytes (2 ml에서 1.6x105 keratinocytes)에 시드에서 매체를 제거 합니다. 시험 잘 후 다음으로 진행 합니다.</li>
		<li>30 분, 25 ° C에서 품 어 그리고 셀 6 h에 대 한 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에 전송. 참고: 생존 및 확산 강하게 영향을 받을 것으로 spinoculate 기본 keratinocytes를 하지 마십시오.</li>
		<li>6 h 후 각 잘 하 류 매체의 1 mL를 추가 합니다. #5, #8, #9 스에서 1 μ M doxycycline (최종 농도)를 추가 합니다. 37 ° c 셀 반환</li>
	</ol>
</li>
	<li>주 2: 10 ng/mL EGF와 KC 매체의 3 mL 류 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>제 3 일: Trypsinize 고 웰 스 #1, #4, # 5로 설명 (참조 4.4.1 4.4.6) 앞에서 세포를 씻어. QRT-PCR 분석에 대 한 총 RNA 추출-80 ° C에서 펠 릿 셀 고정 (7 단계 참조).</li>
	<li>4.4.1 4.4.5 단계에 설명 된 대로 잘 #2, #6, # 8에서 셀 trypsinize 및 GFP 식에 대 한 cytofluorimetric 분석 수행 (단계 5 참조).</li>
	<li>#3, #7 및 #9 우물 적어도 3-4 doublings, 유엔 통합된 IDLVT2 벡터 (인간의 기본 keratinocytes 급지대 레이어에 도금에 대 한 일)을 희석 하기에 충분 한에 대 한 문화를 유지.</li>
	<li>제 6 일: 약 5 일 변환 게시, #3, #7 및 #9 GFP 식에 대 한 cytofluorimetric 분석을 수행 하기 위해 우물에서 (보십시오 단계 4.4.1 4.4.5) 셀 trypsinize (단계 5 참조). 참고: 실험 타이밍 및 변환 효율은 높은 영향을 기본 셀 유형 및 수집 된 샘플의 다양성.</li>
</ol>5. Cytofluorimetric 분석 기본 keratinocytes 불리고
참고: 블루 레이저를 사용 하 여 구성 흐름 cytometer (488 nm), 빨간 레이저 (633 nm) GFP와 APC 형광의 탐지는 사용에 대 한 필터 ( 자료 표참조).
<ol><li>3T3 J2 급지대 레이어에서 keratinocytes를 차별, 레이블 불리고 keratinocytes 3 일과 하루 6 (단계 4.7 그리고 4.9 참조)에서 분리 된 단일 클로 널 APC 마우스-활용된 안티 피더 항 체.<ol>
<li>각 샘플에 대 한 버퍼를 얼룩이 지기의 4 mL를 준비: 5% FBS 200 Μ 500 mM EDTA (최종 농도 = 2.5 m m) 20 μ PBS 1 x 3780 μ</li>
		<li>워시 버퍼를 얼룩이 지기의 1 mL와 분리 된 세포. 580 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>교류 cytometry 인수에 대 한 튜브에 얼룩 버퍼의 100 μ에서 5 x 104 셀을 resuspend 하 고 안티 피더 항 체 (1:50)의 2 μ를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>30 분 후 버퍼를 얼룩이 지기의 2 mL로 씻으십시오. 580 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 버퍼를 얼룩이 지기의 200 μ에 resuspend.</li>
		<li>Cytofluorimetric 분석18에 의해 송출 및 GFP 신호를 취득 합니다. APC- 세포 인구의 GFP+ 셀 분수 불리고 keratinocytes를 나타냅니다. 참고: 원하는 경우, PBS 1에서에서 2 %paraformaldehyde cytometry 전에 스테인드 샘플 수정 x 및 실행까지 어둠 속에서 4 ° C에서 저장소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GFP+의 비율 사이 비율을 그려서 흐름 cytometry 데이터 분석끝점 (5 일)+GFP의 비율에서 셀셀 2 일 게시물 IDLVT2 불리고의 잔여 수준으로 정규화 변환 셀입니다.</li>
</ol>6. 반 정량적 RT-PCR
참고: PCR 열 cycler를 사용 합니다.
<ol><li>추출 총 RNA에서 불리고 또는 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 셀을 제어 합니다. 참고: 총 RNA는-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>100을 사용 하 여 20 µ L 반응에 cDNA 합성 총 RNA의 역전사 키트, 제조 업체의 프로토콜에 따라 ng. 참고: cDNA는-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>SB100X, rtTA2s에 대 한 특정 디자인 뇌관-m 2와 GAPDH (내부 관리 유전자). 제안 된 디자인: SB 전달 뇌관: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3' SB 반전 뇌관: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3' rtTAM2 전달 뇌관: 5'-GACGACAAGGAAACTCGCTC-3' rtTAM2 반전 뇌관: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3' GAPDH 전달 뇌관: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3' GAPDH 반전 뇌관: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'</li>
	<li>50 µ L의 최종 반응 볼륨에서 PCR을 수행 합니다. 특히, 각 PCR 튜브에 조립 다음 반응: (6.2 단계)에서 (1:5 희석) cDNA 1.00 µ L 뇌관 (10 µ M 주식) 전달 1.00 µ L 반전 뇌관 (10 µ M 주식) 1.00 µ L dNTPs (10 µ M 주식) 1.00 µ L 버퍼 (+ MgCl2) (배 재고) 5.00 µ L Taq 중 합 효소 (5 U / µ L 주식) 0.25 µ L 메 마른 물 40.75 µ L</li>
	<li>열 cycler의 다음 프로그램을 사용 하 여: 1 주기 95 ° C에서 5 분 동안 다음 진행 95 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30에 대 한 s, 및 72 ° C 30에 대 한 SB100X에 대 한 34 주기 위한 s, rtTA2s32 주기-M2 그리고 GAPDH 25 주기.</li>
	<li>1 %agarose 젤 준비. 비 커 나 플라스 크 (10 x 주식 살 균 물에 희석), x TBE 1의 100 ml에서 agarose의 1 g을 분해. 전자 레인지, 소용돌이 agarose는 완전히 용 해 될 때까지 매 순간에에서 녹아. 약 50 ° C를 도달할 때까지 녹 인된 agarose를 냉각 하 고 ethidium 평범한 사람 (10mg/mL 주식)의 5 µ L를 추가 합니다. 녹은 agarose 젤 캐스팅 빗 조립된 젤 트레이에 붓으십시오.</li>
	<li>Agarose 젤에 샘플 (10 µ L 각)를 로드 하 고 전기 영동을 수행.</li>
	<li>원하는 경우, 젤 그림을 취득 하 고 PCR 악대에 densitometric 분석을 수행.</li>
</ol>7. 양적 RT-PCR (qRT-PCR)
참고: 상업 시퀀스 검출 시스템 채택 된다. PCR 뇌관 및 6-carboxyfluorescein (FAM) 프로브 glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH)에 대 한 상업적으로 구매 된다.
<ol><li>복고풍-전사 단계 6.2 참조.</li>
	<li>소프트웨어를 사용 하 여 뇌관 디자인 및 SB100X에 대 한 특정 조사. 제안 된 디자인: SB.2 전달 뇌관: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3', SB.2 반전 뇌관: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3' SB 팸 프로브: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'</li>
	<li>PCR 주인 혼합으로 96 잘 접시에 실시간 PCR을 수행 하 고 프라이 머 + 프로브 믹스, 25 µ L의 최종 반응 볼륨에서. 특히, 각 잘 다음 반응을 고려 하십시오. cDNA (1시 10분 살 균 물에 희석) 1.00 µ L 마스터 믹스 12.50 µ L x 2 프라이 머 + 20 x 프로브 믹스 1.25 µ L 메 마른 물 10.25 µ L 참고: 3 중에서 모든 반응을 수행 합니다. Pipetting 오류를 방지 하려면 (cDNA) 없이 적어도 n + 3 반응에 대 한 혼합을 준비 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 약 수입니다.</li>
	<li>다음 프로그램을 사용 하 여 실시간 PCR 실행: 95 ° c 10 분, 다음 95 ° C의 40 주기 1 주기 15 s와 1 분 및 4 ° c.에 보류에 대 한 60 ° C</li>
	<li>2-ΔΔCT 정량화, 일반적인 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 동일한 cDNA 샘플의 GAPDH의 수준에 SB100X의 상대 식 (RQ 값)을 정상화 하 여 qRT-PCR 데이터를 분석.</li>
</ol>

<ol><li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+system+to+redirect+T-cell+specificity+for+human+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications.</a> J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li>
<li>Belay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hyperactive+transposons+for+genetic+modification+of+induced+pluripotent+and+adult+stem+cells%3A+a+nonviral+paradigm+for+coaxed+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation.</a> Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).</li>
<li>Grabundzija, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-based+system+for+cellular+reprogramming+and+targeted+gene+insertion+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).</li>
<li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+sleeping+beauty+transposon-mediated+porcine+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).</li>
<li>Turchiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Sleeping+Beauty+transposon+integration+in+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells.</a> PLoS One. 9 (11), e112712(2014).</li>
<li>Jin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).</li>
<li>Latella, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+Recessive+Dystrophic+Epidermolysis+Bullosa+by+Transposon-Mediated+Integration+of+COL7A1+in+Transplantable+Patient-Derived+Primary+Keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+and+safety+of+an+adenovirus+hybrid-vector+utilizing+hyperactive+sleeping+beauty+transposase+for+somatic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration.</a> PLoS One. 8 (10), e75344(2013).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+adeno-associated+viral+vectors+utilizing+transposase-mediated+somatic+integration+for+stable+transgene+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76771(2013).</li>
<li>Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty-baculovirus+hybrid+vectors+for+long-term+gene+expression+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye.</a> J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).</li>
<li>Galla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+cytotoxicity+of+transposases+by+dose-controlled+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).</li>
<li>Moldt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomic+integration+profiling+of+Sleeping+Beauty+transposons+mobilized+with+high+efficacy+from+integrase-defective+lentiviral+vectors+in+primary+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells.</a> Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).</li>
<li>Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+of+functional+transgenes+into+the+human+genome+by+adeno%2FAAV+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors.</a> Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).</li>
<li>Urlinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+sequence+space+for+tetracycline-dependent+transcriptional+activators%3A+novel+mutations+yield+expanded+range+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).</li>
<li>Cocchiarella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally+regulated+and+nontoxic+delivery+of+the+hyperactive+Sleeping+Beauty+Transposase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).</li>
<li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+DNA+transposable+elements+from+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mob+Genet+Elements%22%5BJournal%5D)">Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors.</a> Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A laboratory Manual</a>. , 4th edition, (2012).</li>
<li>Dellambra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrective+transduction+of+human+epidermal+stem+cells+in+laminin-5-dependent+junctional+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa.</a> Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 안정적으로 GOI 잠자는 미녀여 대상 세포의 게놈으로 통합 하는 광범위 하 게 액세스할 수 있는 방법론을 설명-이항 중재. SB 시스템 게놈 편집에 대 한 nonviral 방법을 제공 하기 위해 개발 되었습니다, 하지만 통합 기계 (transposase 및 T2 transposon)의 효율적인 제공은 필수입니다. 따라서, SB 시스템을 사용 하 여 거의 transfectable 1 차 셀에,에 SB 구성 요소의 바이러스 배달 최근 몇 년 동안10,,1215추구 되었다. 그러나,까지 고용 하는 바이러스 성 벡터의 아무도 지금 통제는 transposon의 rehopping의 위험에 발생할 수 있는 transposase의 구성 식의 문제를 해결.
Transcriptionally transp...

T2 기반 transposon에 결합 된 활동적인 SB100X transposase 전 임상 유전자 치료 응용 프로그램1,2,3, 게놈 수정4,5에 이미 사용 되 고 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 프로그래밍6,7. 일반적으로, SB 구성 요소 정도 플라스 미드 transfection에 의해 제공 됩니다 및 강한 제정 발기인 드라이브는 transposase의 표현. 그러나, transfection의 향상 된 새로운 방법에도 불구 하 고 배달 두 구성 요소 시스템의 많은 응용 프로그램에 대 한 도전 남아 있습니다. 따라서, 새로운 배달 프로토콜의 개발 증가 관심이 있다. 플라스 미드8 및 mRNA9transfection 방법, 외 바이러스 배달 adenoviral10,11, adeno 관련 바이러스 (AAV)12, 잠재13, gammaretroviral14에 따라 및 lentiviral 벡터15 과거에 제안 되었습니다. 특히, 선택의 시스템에 바이러스 성 벡터의 통합 없이 SB 부품의 과도 납품을 보장 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, transposase의 구성 식 안전 관심사는 transposon의 통제 rehopping의 위험으로 인해 발생 합니다.
따라서, 세련 된 Tet-켜 짐 시스템에 의해 SB100X의 transcriptional 규칙은 첫 번째 도전 이다. 포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1)16, Timidine 키 니 아 제 (TK) 유전자의 최소 발기인 (-81)과 함께 원래 개발 된 최소한의 세포 (CMV) 발기인을 대체 하 여 얻은 수정된 Tet 응답 발기인 복제의 상류는 SB100X cDNA (pTetOTKSB100X) 돌연변이 역-항생물질-transactivator rtTA2s-M217 다른 플라스 미드에 복제 강한 제정 발기인 (phosphoglycerate 발기인, PGK)의 통제 표현 된다 (pCCL-PGKrtTA2S-M2). 문화 매체에 추가, dox 바인딩합니다 rtTA2s-M2 변조기 tethers Tet 발기인 복잡 하거나, SB100X 식18단단히 규제 유도 결과 및.
두 번째 주요 과제는 여러 가지 물리적, 화학적 방법으로 인간의 1 차 셀의 비효율적인 transfection에서 발생합니다. 효율적으로 인간의 세포 transfection는 SB100X 및 rtTA2s에 transposase를 전달 하기 위해-M2 식 카세트 2 통합 결함이 lentiviral 벡터 (IDLVs)19으로 포장 된다: IDLVTKSB 및 IDLVrtTA2s- M2입니다. 바이러스 성 벡터는 HEK293T 셀20 에 Vescicular 구내 염 바이러스 (VSV-G), 광범위 한 감염을 수 여 하의 당단백질 G와 pseudotyped 제 3 세대 벡터로 정도 생산 된다. 벡터 입자 ultracentrifugation에 의해 집중 되며 p24 immunocapture V 1 개 그에 의해 적정. 셀 라인 및 1 차 셀 transduce를 벡터 입자 polybrene에 complexed 고 dox의 유무에서 대상 셀으로 알을 품. 불리고 셀에 SB100X 식의 약 의존 활성화 양적 RT-PCR (qRT-PCR)18에 의해 측정 됩니다.
Tet 규제 SB100X 식 시연, 일단 대상 세포 게놈으로 GOI (예를 들어, 녹색 형광 단백질, GFP)의 전위 명확 하 게 박 고 Mikkelsen21에 의해 도식화 분자 이벤트를 다음과 같습니다. 제 3 IDLV 벡터 GOI T2 transposon 국세청 (IDLVT2) 간의 복제에 대 한 식 카세트는 건설 하 고 위에서 언급 한 대로 포장 운반. 마지막으로, 3 개의 IDLV 벡터 효율적으로 인간의 세포 (예를 들어, 기본 keratinocytes) 시험관에 transduce doxycycline18존재 GOI 통합을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' L-글루타민이 없는 4.5g/L 포도당이 있는 배지</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>세포 배양 배지.</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (미국),</td><td>렌티바이러스 입자 생산을 위해 세포 배양HEK293T 사용된</td> <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.03</td> 특성화 혈청.</tr><tr><td>페니실린 10.000 UI/ml 스트렙토마이신 10.000 UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>세포 배양 배지용 시약.</td></tr><tr><td>세포 배양 배지용</td> <td>L-글루타민 200mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td> 시약.</tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>HBS 2X 준비용 시약.</td></tr><tr><td>HEPES 버퍼, HBS</td><td>2X 준비용</td> 일반 식염수 <td>Lonza</td><td>BE17-737E</td> 시약의 1M 재고.</tr><tr><td>인산수소이나트륨 이수화물 (Na2HPO4&middot; 2H2O), 99.5%</td><td>HBS 2X 준비용</td> <td>Merck</td><td>106580</td> 시약.</tr><tr><td>염산 - ACS 시약 37%(HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>HBS 2X 준비용 시약.</td></tr><tr><td>주사용 멸균수:</td> <td>HBS 2X 준비를 위한</td> <td>Fresenius Kabi</td><td>-</td>시약.</tr><tr><td>0.45 & 마이크로; m PESS 필터</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td>바이러스 상층액에서 세포 파편을 제거하는 데 사용되는 필터.</td></tr><tr><td>Polyallomer Beckman 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Tubes는 초원심분리를 통해 IDLV 벡터를 농축합니다.</td></tr><tr><td>PBS-1X w/o Ca, Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>세포 세척 및 렌티바이러스 입자 재현탁액용 버퍼.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2153</td><td>(옵션) 렌티바이러스 입자 재현탁액용 완충액.</td></tr><tr><td>HIV-1 Gag p24 면역 캡처 키트</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK50001KT</td><td>IDLV 입자 적정을 위한 키트.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich 107689</td><td></td><td>시약으로 형질 도입 효율을 향상시킵니다.</td></tr><tr><td>HBSS 중 트립신(10X) 2.5%(Ca, Mg</td><td>GIBCO</td><td>BE17-160E</td><td>제외) HeLa 세포 분리 시약(원액, 희석 예정).</td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산 디 소듐 염 (EDTA)</td> <td>100938B</td><td>트립신 작업 용액 준비를위한</td> <td>AnalaR BDH</td> 시약.</tr><tr><td>0.5% 트립신-EDTA, 페놀 레드 없음(10X)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>각질 세포를 분리하기 위한 시약(원액, 희석).</td></tr><tr><td>기증자 소 혈청, 뉴질랜드 원산지</td><td>GIBCO</td><td>16030-074</td><td>스위스 마우스 3T3-J2 세포 배양용 혈청(피더층).</td></tr><tr><td>햄' s F12 배지</td><td>GIBCO</td><td>21765</td><td>각질 세포용 배지.</td></tr><tr><td>HeLa 세포 배양 배지용</td> <td>소 태아 혈청</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td> 혈청.</tr><tr><td>태아 소 혈청, 자격, 호주 원산지</td><td>GIBCO</td><td>10099-141</td><td>인간 1차 각질 세포 배양 배지용 혈청.</td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 인슐린</td><td>각질 세포 성장을 위한</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td> 시약.</tr><tr><td>아데닌</td><td>VWR</td><td>1152-25</td><td>각질 세포 성장을위한 시약.</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>VWR</td><td>3867-1</td><td>각질 세포 성장을위한 시약.</td></tr><tr><td>Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td>의 콜레라 독소 <td>각질 세포 성장을 위한 시약.</td></tr><tr><td>각질 세포 성장을위한</td> <td>Triiodothyronine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td> 시약.</tr><tr><td>각질 세포 성장을 위한</td> <td>인간 EGF</td><td>Austral 생물학</td><td>GF-010-9</td> 시약.</tr><tr><td>마우스 단클론 APC-conjugated Anti-Feeder 항체</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-099</td><td>피더 층을 라벨링합니다.</td></tr><tr><td>RNeasy Plus 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA 정제 키트.</td></tr><tr><td>SuperScript III 역전사효소</td><td>Life Technologies</td><td>18080051</td><td>역전사효소 키트.</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)</td>반<td>정량 PCR용</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D7295</td> 시약.</tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>(임의)</td><td>-</td><td>반정량 PCR 및 qRT-PCR용 시약.</td></tr><tr><td>GoTaq G2 핫 스타트 중합효소</td><td>Promega</td><td>M740B</td><td>Taq 중합효소.</td></tr><tr><td>분자 생물학을 위한 아가로스,</td> 아<td>가로스 젤 전기 이동법을 위한</td> <td>시그마-알드리치</td><td>A9539</td> 시약.</tr><tr><td>UltraPure TBE Buffer,</td> 아가로스 겔 전기영동을 위한 10X <td>Invitrogen</td><td>15581028</td><td>시약, ddH2O에서 희석(1X)할 수 있습니다.</td></tr><tr>에<td>티듐 브로마이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>아가로스 젤 전기영동용 시약.</td></tr><tr><td>HeLa 세포 및 각질세포에서 트랜스포사제 발현을 유도하는</td> <td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9891</td> 약물</tr>, <tr>프라이머 및 프로브를 포함한<td>TaqMan Universal PCR Master</td><td>Mix Applied Biosystem</td><td>4304437</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix.</td></tr><tr><td>15mL 고선명도 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 돔 씰 나사 캡 포함,</td><td>세포 채취 및 벡터 희석 준비를 위한</td> 멸균 <td>팔콘 코닝</td><td>352096</td> 튜브.</tr><tr><td>20mm 그리드의 150mm TC 처리된 세포 배양 접시, 멸균</td><td>팔콘 코닝</td><td>353025</td><td>바이러스 생산을 위한 세포 배양 접시.</td></tr><tr><td>6웰 투명 평면 바닥 TC 처리된 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함, 개별 포장,</td><td>HeLa 및 인간 1차 각질 세포 형질주입을 위한</td> 멸균 <td>팔콘 코닝</td><td>353046</td> 세포 배양 플레이트.</tr><tr><td>Safe-Lock microcentrifuge tube, 용량 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>Tubes. 희석 준비용.</td></tr><tr><td>Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>희석 준비용 Tube.</td></tr><tr><td>플랫 캡이 있는 0.2ml PCR 튜브, RNase, DNase, DNA 및 PCR 억제제 없음</td><td>(임의)</td> <td>-</td> <td>반정량 PCR용 튜브.</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well 반응 플레이트(바코드 포함), 0.1 mL</td><td>Applied Biosystem</td><td>4346906</td><td>qRT-PCR용 96-well.</td></tr><tr><td>5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브, 캡 없음</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td>튜브 유세포 분석 수집용.</td></tr><tr><td>일회용 혈청학 피펫, 폴리스티렌, 개별 포장, 멸균(다양한 부피)(</td><td>모든)</td><td>-</td><td>멸균 조직 배양 응용 분야를 위한 피펫.</td></tr><tr><td>필터 팁, 멸균 및 RNase, DNase, DNA 및 발열원 없음(다양한 부피)(</td><td>모든)</td><td>-</td><td>멸균 조직 colture 및 분자 생물학 응용 분야를 위한 필터 팁.</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>(모든)</td><td>-</td><td>HBS 2X pH 측정용 장비.</td></tr><tr><td>PCR Thermal cycler</td><td>(any)</td><td>-</td><td>반정량 PCR용 장비.</td></tr><tr><td>아가로스 젤 전기영동 장비</td><td>(모든)</td> <td>-</td> <td>반정량 PCR의 아가로스 젤 전기영동을 위한 장비.</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II 2LSR 4/2</td><td>BD-</td><td></td><td>유세포 분석기.</td></tr><tr><td>7900HT 고속 Real-Time PCR 시스템</td><td>qRT-PCR용</td> <td>Biosystem</td><td>7900HT</td> 장비 적용.</tr><tr><td>세포 배양 응용 분야에서 효율적인 시료 처리를 위한 탁상용 원심분리기, 마이크로플레이트 버킷을 사용한 냉장.</td><td>(어떤)</td><td>-</td><td>세포 배양 처리 및 spinoculation을 위한 원심분리기.</td></tr><tr><td>렌티바이러스 입자 생산을 위한</td> SW32TI 로터 <td>Beckman Coulter-Ultracentrifuge</td><td></td><td>가 장착된 Optima L-90K 초원심분리기</td>.</tr><tr><td>세포 배양 및 분자 생물학 실험실용 장비(예: BSL2 재료, 세포 배양 인큐베이터, 냉장고 및 냉동고와 관련된 작업을 위해 설계된 Class II 층류 후드(+4 &deg; C, -20 &deg; C, -80 &deg; C), 마이크로피펫 및 피펫 에이드).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>보호용 실험실 코트, 장갑, 안면 보호구는 특히 렌티바이러스 입자 생산 및 형질도입을 위한 연구소 규칙 및 규정에 따라 사용됩니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 lentiviral 벡터에 포장 하 여

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

잠자는 미녀 (SB) transposon는 유전자 이동 및 기능 유전체학에 대 한 입증 된 효능 비 바이러스 성 통합 시스템입니다. SB transposon 기계를 최적화 하려면 transcriptionally 규제 활동적인 transposase (SB100X) 및 T2 기반 transposon 고용 됩니다. 일반적으로, transposase와 transposon 제공한 정도 플라스 미드 transfection 그리고 SB100X 식 제정 발기인에 의해 구동 됩니다. 여기, 우리는 여러 가지 물리적, 화학적 transfection 방법 SB100X 식 제어 통합 하 고 안정적으로 "잘라내기 및 붙여넣기" SB 통해 관심 (GOI)의 유전자에는 인간의 세포에 SB 구성 요소를 제공 하는 효율적인 방법 설명 메커니즘입니다. 활동적인 transposase의 식은 단단히 Tet에 시스템, 1992 년부터 유전자 발현 제어를 널리 의해 제어 됩니다. 관심사의 유전자는 T2 transposon의 거꾸로 반복 (IR)에 의해 측면 이다. 두 SB 부품 결함이 lentiviral 벡터 뚜렷이 HEK293T 세포에서 생산 하는 통합에 포장 됩니다. 인간 세포, 세포 선 또는 인간 직물에서 1 차 셀에 체 외에 바이러스 성 벡터와 정도 불리고 있습니다. 문화 매체에 doxycycline (dox, 항생물질 아날로그)의 추가, 시 transposase 식의 미세 조정 측정 되 고 긴-지속적인 통합 치료 세포의 게놈의 유전자의 결과. 이 방법은 효율적이 고 셀 라인 (예를 들어, HeLa 세포) 및 1 차 셀 (예를 들어, 인간의 기본 keratinocytes)에 적용 되 고 따라서 유전 공학 및 유전자 치료 이동에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다.

여기, 제시 된 절차를 사용 하 여 레 귤 레이트 된 SB 부품을 운반 하는 3 개의 IDLV 벡터 (SB100X, rtTA2S-m 2와 t 2-GFP transposon) 포장 하 고 효율적으로 제공 하 고 밀접 하 게 인간의 세포에서 SB 시스템을 조절 하는 데 사용 했다. 그림 1A 는 생체 외에서 변환 HeLa 세포 ( 표 2에 보고 된) 두 IDLV 벡터의 좋은 복용량 조합으로 SB transposase의 transcriptional 규칙을 평가 하기 위해 수행을 위한 계획을 보여 줍니다. SB100X의 transcriptional 규칙 qRT-PCR (그림 1B)에 의해 측정 되었고 오프 상태에 관하여 상대 양 (RQ) 값으로 플롯 (IDLVTKSB 혼자 RQ = 1). 불리고 HeLa 세...

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

이 방법의 전반적인 목표는 통합 결함 렌티바이러스 벡터로 패키징된 전사 조절된 잠자는 숲속의 미녀 시스템에 의해 관심 유전자를 일차 세포의 인간 게놈에 안정적으로 통합하는 것입니다. 이 방법은 잠자는 숲속의 미녀 시스템을 사용하여 관심 유전자를 1차 세포에 통합하는 것과 같은 유전자 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유도 가능한 과활성 잠자는 숲속의 미녀 시스템이 여러 형질주입 방법에 내성이 있는 일차 세포를 효율적으로 전달한다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Daniela Benati입니다. 형질도입 이전에, 인간 1차 각질세포는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 성장합니다. 배양에서 subconfluent keratinocyte를 분리하려면 배지를 제거하고 1X PBS로 세포를 세척한 다음 각 웰에 1ml의 예열 트립신 작업 용액을 추가합니다.세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 웰의 세포를 철저히 재현탁시키고 세포 현탁액을 2ml의 혈청 함유 배지가 들어 있는 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3mL의 1X PBS로 웰을 한 번 헹구고 헹궈낸 용액을 세포 현탁액이 있는 원심분리 튜브에 추가합니다.580회 g에서 5분간 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. 1X PBS 5ml로 세포를 세척하고 580회 g에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에서 1.6 배 10을 1 밀리리터의 CFAD 배지에 5 번째 각질 세포로 희석합니다.각 조건에 대해 하나의 희석액을 준비합니다. 3개의 Integration Defective Lentiviral 또는 IDLV 벡터는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이전에 준비되었습니다. IDLVTKSB는 TET 조절 과잉 활성 SB100X 전치를 수행합니다.조절제 및 IDLVT2에 대한 IDLVrtTA 코드는 관심 유전자를 운반합니다. 이 예에서 GFP는 transposon 역 반복에 의해 측면에 있습니다. 이 표에 표시된 대로 20마이크로리터의 폴리브레렌이 있는 상태에서 1ml의 CFAD 배지로 렌티바이러스 벡터를 희석합니다.1, 2, 3은 벡터가 없는 음수 제어입니다. 4개와 5개는 IDLVTKSB와 IDLVrtTA를 포함한다. 6, 7, 8, 9는 3개의 렌티바이러스 벡터를 모두 포함합니다.각 렌티바이러스 벡터 희석액을 해당 각질세포 현탁액에 첨가하여 현탁액 세포를 형질도입합니다. 하루 전에 퇴각한 치사량에 노출된 3T3-J2 영양세포에서 배지를 제거하고 형질전환된 각질세포를 플레이트에 부착합니다. 우물을 옮긴 후 다음 우물을 진행하십시오.25도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 6시간 동안 37도로 옮깁니다. 6시간 후 각 웰에 1ml의 CFAD 배지를 추가합니다.독시사이클린 1마이크로몰을 웰 5, 8, 9에 추가합니다. 셀을 섭씨 37도로 되돌립니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 웰의 셀을 처리합니다.세포형광 분석을 위해 3일차와 6일차에 분리된 형질도입된 1차 각질세포는 마우스 단클론 APC 접합 항공급체 항체로 세포를 표지하여 3T3-J2 공급층과 구별해야 합니다. 5% FBS, 500 millimolar EDTA 및 1X PBS를 결합하여 각 샘플에 대해 4ml의 염색 완충액을 준비합니다. 분리된 세포를 1ml의 염색 완충액으로 세척합니다.580회 g에서 5분간 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. 유세포 분석을 위한 튜브에서 100마이크로리터의 염색 완충액에서 네 번째 세포까지 5배 재현탁합니다. 2 마이크로 리터의 안티 피더 항체를 1에서 50의 희석액으로 첨가하고 잘 섞는다.어둠 속에서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 2ml의 염색 완충액으로 씻어냅니다. 580회 g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다.상층액을 버리고 200마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁합니다. GFP 및 APC 형광 검출을 위해 청색 레이저, 적색 레이저 및 필터로 구성된 유세포 분석기를 사용하여 APC 및 GFP 신호를 획득합니다. APC 음성 세포 집단의 GFP 양성 세포 분획은 형질주입된 각질세포를 나타냅니다.Real-Time PCR을 수행하려면 25마이크로리터의 최종 반응 부피로 96웰 플레이트에서 3회 반응을 설정합니다. 각 반응에는 1마이크로리터의 cDNA, 12.5마이크로리터의 2X 마스터 믹스, 1.25마이크로리터의 20X 프로브 믹스에 포함된 프라이머 및 10.25마이크로리터의 멸균수가 포함됩니다. 이 PCR 프로그램에 따라 Real-Time PCR을 실행하고, 섭씨 95도에서 10분 동안 한 사이클을 실행한 다음 섭씨 95도에서 15초 동안, 섭씨 60도씩 1분 동안 40사이클을 실행하고 섭씨 4도를 유지합니다.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Real-Time PCR 데이터를 분석합니다. 독시사이클린을 더하거나 뺀 조절제 벡터에서 전치(transpose)의 용량을 증가시켜 형질도입된 HeLa 세포의 발현 분석은 SB100X 발현을 강력하게 유도하기 위해 두 IDLV의 고용량이 필요한 것으로 나타났습니다. 조절제 벡터의 존재 유무에서 전치 벡터로 형질도입된 HeLa 세포에서 SB100X 발현을 정량적으로 분석한 결과, 독시사이클린(doxycycline)이 존재할 때 백그라운드에서 8배의 활성화가 나타났습니다.전사 조절되는 잠자는 숲속의 미녀 시스템은 일차 세포에서도 사용할 수 있습니다. transposes 및 modulator vector로 transduction된 각질세포에서 SB100X 발현은 off 상태에서 15배 활성화를 보였습니다. 독시사이클린을 더하거나 뺀 3개의 IDLV 벡터로 형질주입된 각질세포에서 수행된 전위 실험은 독시사이클린으로 처리된 세포의 12%가 게놈에 적어도 하나의 GFP 사본을 안정적으로 통합했음을 나타냈습니다.일단 숙달되면 일차 세포의 중요한 전달은 적절하게 수행될 경우 8시간, 세포형광 분석은 2시간, 발현 분석은 3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 일차 세포를 transduction하는 데 사용되는 벡터 용량 조합을 최적화하고 유도 가능한 Sleeping Beauty transposes의 더 높은 발현 수준을 달성하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포당 트랜스포손 복제 수 및 게놈 파일링을 위한 통합과 같은 추가 질문에 답하기 위해 정량적 PCR 및 링커 매개 PCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 유전자 치료 분야의 연구자가 임상 관련 세포 엔지니어링에 잠자는 숲속의 미녀 시스템의 적용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 동영상을 시청한 후에는 IDLV 벡터를 사용하여 원발성 각질세포를 먼저 transduction하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 둘째, 독시사이클린 조건에 따른 과활성 전치(hyperactive transposes)의 발현을 측정하고 마지막으로 유세포 분석으로 전치(transposition)를 따릅니다.바이러스 벡터를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이러한 절차를 수행하는 동안 수치 및 일회용 공급을 억제하기 위한 BCL과 같은 예방 조치를 항상 휴대해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

an-efficient-vitro-transposition-method-transcriptionally-regulated

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될...

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

이 비디오는 수정된 마우스 배아의 주위 공간에 렌티바이러스 벡터를 전핵 주입하는 방법을 설명합니다. 렌티바이러스는 변형유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 수정된 배아의 게놈에 통합되어 결국 형질전환 마우스를 생성한다.

렌티바이러스 벡터 기반 페리비텔린 주입: 관심 유전자를 수정된 단세포 마우스 난모세포로 transduction하는 방법

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

학습하세요 Sleeping Beauty 시스템을 사용하여 인간 원래 세포에 유전자를 안정적으로 통합하는 방법을 배우세요. 이 기술은 유전자 치료 연구에서 효율적인 유전자 전달을 가능하게 합니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

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