Name: 형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 형광 일생 화상 현미경법을 이용해 살아있는 HeLa 세포에서 SNARE 단백질 복합체 형성을 정량적으로 시각화하는 방법을. 이 기법은 막 소포 수송 메커니즘 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품 과학 연구 (NWO; Radboud 대학교 의료 센터, 인간 프론티어 과학 프로그램에서 경력 개발 상, 네덜란드 조직에서 인력 프로그램 2013 Hypatia 친교에 의해 지원 되었다 ICI-024.002.009), 한 VIDI NWO (ALW VIDI 864.14.001), 그리고 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (보조금 계약 번호 336479)에서 유럽 연구 회의 (ERC)에서 시작 부여에서 부여.

1입니다. 현미경 샘플의 준비
<ol>
	<li>MCitrine (syntaxin 4-mCitrine; 기증자 fluorophore)를 융합 하는 Qa-무 syntaxin 4의 표현 및 R 무 VAMP3 mCherry (VAMP3-mCherry)를 융합 참고: 다른 SNAREs 형광 단백질 그들의 C-터미널 막 횡단 나선 융합으로 사용할 수도 있습니다. MCitrine-mCherry, 대신 다른 기증자 수락자 쌍 spectrally 분리 fluorophores의 사용 (예를 들어, c f P-YFP) 될 수 있습니다.<ol>
		<li>헬러 세포를 성장 하 고 세 35 m m 직경 유리 하단 요리 현미경에 적합에 900000 HeLa 세포 분열. 참고: 원칙적으로,이 프로토콜 수 다른 진 핵 세포 유형 및 현미경 요리에 맞게.<ol>
			<li>유지 하는 높은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 5%와 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 1% 항생제 antimycotic (포함 암포 B, 페니실린, 스) 37 ° C에서 보충의 10 mL와 T75 플라스 크에서 헬러 세포 배양 공동 셀 문화 인큐베이터에 2 .</li>
			<li>일주일에 두 번 매체를 보충 하 고 일주일에 한 번 또는 세포에 도달 하면 85-90% 새로운 confluency T75 플라스 크 (500, 000 셀/플라스 크, 평균에) 셀 1시 10분 분할.</li>
			<li>된 DMEM을 제거 하 고 세척 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 3 분의 8 mL로 두 번 헬러 monolayers.</li>
			<li>PBS를 제거 하 고 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 PBS의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>셀 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 5 분 동안 품 어 하 고 그 후 가볍게 HeLa 세포는 플라스 크의 하단에서 별도로 플라스 크를 선동.</li>
			<li>매체의 10 mL로 세포 밖으로 플러시, 15 mL 튜브에 정지를 전송 하 고 카운팅을 위한 10 µ L 약 수를 제거 합니다.</li>
			<li>0.4 %trypan 푸른 얼룩과 1:1 약 수를 묽 게 하십시오 그리고 Bürker hemocytometer9셀. 참고: 셀/mL의 수에 대 한 10000 여 두 개의 4 x 4 사각형과 여러 셀 수를 계산 합니다.</li>
			<li>셀 계산, 15 mL 튜브에서 걸릴 900000 셀 3 유리 하단 요리 (1.1.1 단계 참조)를 통해 분한 후 transfection에 대 한 준비.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Electroporation10 셀 transfect ( 재료의 표참조) syntaxin 4 mCitrine 구문 (기증자만, 샘플 #1)와 함께 mCitrine 및 mCherry (VAMP3-mCherry (샘플 #2), 및 syntaxin 3 syntaxin 4 mCitrine 융합 샘플 #3). 참고: 다른 셀 transfection 방법 사용된11수도 있습니다. 샘플 # 3에서에서 탠덤 구조는 짧은 수명을 expectable (즉, 최대한 expectable 무서 워) 추정을 위한 긍정적인 컨트롤입니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>문화 셀 높은 포도 당 10 %FCS 1% 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 항생제 antimycotic와 함께 제공 된 DMEM에서에서 하룻밤.</li>
	<li>DMEM 발음 하 고 세척 한 번 라이브 셀 이미징 매체와 셀 (140 m NaCl m, 2.5 m m KCl, 1.8 m CaCl2m, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; 테이블의 자료를 참조) 2 분 이후 신선한 영상 셀 배치 중간입니다.</li>
</ol>
2. FLIM 데이터의 기록
<ol>
	<li>장소 시간-도메인 FLIM confocal 현미경 펄스 여기 소스와 기증자 fluorophore (즉, mCitrine) 및 시간 해결 데이터 수집에 대 한 아래 예제 # 2. 열띤 무대 37 ° C에서 세포를 유지. 참고:이 프로토콜에서 사용 하는 confocal 현미경은 63 X 1.20 나 물 침수 목표를, 펄스 흰 빛 레이저를 장착 합니다 (80 MHz 펄스, &#60; 100 ps 펄스 기간), 광자 승수 관 (PMT), 그리고는 Time-Correlated 단일 광자 계산 (TCSPC ) 시스템 (사용 하는 특정 설정에 대 한 재료의 표 참조). 다른 FLIM 현미경 사용 (예를 들어, Pmt, 백색 빛 펄스 레이저 대신 단일 파장 펄스 레이저 대신 단일 광자 눈사태 다이오드 (SPAD)) 될 수 있습니다.</li>
	<li>MCitrine 및 mCherry 라는 올 무 단백질의 보이는 표현으로 셀을 선택 하 고 각 FLIM 측정 전에 두 fluorophores의 동시 여기 256 × 256 픽셀의 공초점 이미지를 기록 합니다. 약 2-fold는 회절 제한 현미경의 공간 해상도 보다 작은 픽셀 단계 (~ 200 nm) 사용 해야 합니다. 516 및 521-565 nm;에서 수집 방출에 자극 하는 mCitrine에 대 한 에 mCherry, 613-668 nm에서 610 nm 및 수집 방출에 자극. 참고: 이미징 비행기 접시의 바닥에 너무 가까이 위치 하지 않습니다 (내 ~ 2 µ m 거리),이 형광 일생 히스토그램에 반영 피크 귀 착될 것 이다. 기증자 및 수락자 fluorophores의 동시 자극은 선호,이 샘플 운동의 잠재적인 문제를 해결할 수 있습니다. 하지만, 순차 여기 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>동일한 크기와 공간 해상도 confocal 이미지로 기록 되 고 FLIM 이미지로 FLIM 실행 를 클릭 하 여 이미지를 FLIM 단계 2.2에서 기록 하는 기록. 전체 셀 FLIM 분석, 또는 적어도 400 광자/픽셀 이미지 적어도 50000 광자를 기록 합니다. MCitrine 기증자 fluorophore 및 하지 mCherry 수락자 fluorophore만 자극 하 고 따라서 521-565 nm에서 516 및 수집 방출에 자극.</li>
	<li>여러 셀 및 다른 샘플 #1 (기증자에만) 및 샘플 #3 (mCitrine-mCherry 직렬 식 구조) 2.1-2.3 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>악기 응답 함수 (IRF)을 기록 합니다. (예를 들어, 510-550 nm에서 기록 방출) 여기 파장에 방출 검출기의 단색을 조정 하 고에 다시 뿌리는 깨끗 한 유리 커버 슬립에서 FLIM 실행버튼을 클릭 하 여 함께 FLIM 이미지를 기록. 동일한 여기 파장을 사용 하 여 (516 nm) 레이저 출력 단계 2.1-2.4에서 셀 데이터 기록에 사용 되 고. 참고: 여러 개의 봉우리는 IRF에서 볼 수 있습니다 또는 방출 monochromators 튜닝할 수 없는 경우는 IRF 또한 측정할 수 초고속 수명이 형광 염료의 솔루션으로 예를 들어 형광은 유기 염료를 포화에 수성의 냉각에 의해 요오드 화 칼륨의 솔루션입니다. 또한, 그것은 필요 하지 않습니다 엄격 하 게는 IRF 기록 하 때문에 형광 히스토그램의 감퇴 슬로프는 IRF deconvolution 없이 맞을 수 있다. 그러나,는 IRF 사용 광자 검출기의 타이밍 특성에 대 한 수정 수 있습니다 그리고 그로 인하여 평생 히스토그램의 맞는 더욱 정확해.</li>
</ol>
3입니다.FLIM 이미지 광자 녹음의 변환
<ol>
	<li>다운로드 및 설치 PT32ICS 변환 소프트웨어5. 참고: 수명 데이터 또한 여러 현미경 공급 업체에서 소프트웨어를 포함 한 다른 소프트웨어에서 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>PT32ICS 소프트웨어를 구성 합니다.<ol>
		<li>크기 설정을 통해 256 × 256 픽셀 이미지 크기를 설정 | 크기.</li>
		<li>설정을 통해 2 채널 설정 | 크기. 참고: mCitrine 방출의 채널 독점적으로 현미경의 구성에 따라 달라 집니다. 잘못 된 채널 FLIM 이미지 없는 광자 (즉, 검은 이미지)와 결과적으로 빈 'LifetimeTable.txt' 발생 합니다-파일. 재판 및 오류에 의해 올바른 채널을 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>ImageJ (xyz) 로 출력 을 설정 (또는 TRI2 (xyt)) FLIM 이미지 (3.4 단계) 생성.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>변환 누르고 하나 이상의 광자 추적 (.pt3 파일)를 로드 합니다. 여러 개의 광자 자취를 선택 하려면 Ctrl 키를 누른 상태를 유지 합니다. 참고: 최신 64 비트.ptu 형식을 변환할 수 있습니다 또한.</li>
	<li>PT32ICS 소프트웨어 pt3 파일 저장 되는 위치와 동일한 폴더에 다음 파일을 생성 하는 확인 하십시오:.pt3 광자 추적 이미지 cytometry 표준 형식 (.ics),.pt3 광자 추적 (.bmp) 당 하나의 비트맵 파일, 텍스트 파일 변환 당 당 하나의 광자 스택 (_Report.txt) 정보가 포함 된 광자 통계 (즉, 각.pt3 광자 추적, 시간 분해능의 검출기에에서 광자의 총 수), 변환 (_LifetimeTable.txt) 당 두 번째 텍스트 파일에 포함 된 총 형광 일생 히스토그램 탭-구분 된 형식 각.pt3 광자 추적에 대 한. 참고:.ics 파일 FLIM 이미지, 예를 들어 TRI2 소프트웨어12,13 또는 피지 ImageJ14,15라이브러리 피팅 슬림 커브를 생성 하려면 피팅 단일 픽셀에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 파일 또한 사용할 수 있습니다 Phasor 분석16, 예를 들어 Spechron에서 피지에 대 한 시간 문이 벡터 플러그인. 비트맵 파일 없음 수명 정보를 포함합니다. 두 번째 텍스트 파일 4 단계에서 전체 셀 FLIM 분석에 사용 됩니다.</li>
</ol>
4. 전체 셀 FLIM 분석용 형광 일생 히스토그램의 피팅
참고:이 단계 (deconvoluted 피팅은 IRF의) 필요 소프트웨어를 deconvoluted 피팅 가능 합니다. IRF deconvolution 없이 형광 히스토그램의 피팅 하는 것은 뿐만 아니라 다른 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.
<ol>
	<li>피팅과 deconvolution (자료 테이블)의 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 파일을 통해 각 광자 추적 (_LifetimeTable.txt)에 대 한 히스토그램을 포함 하는 텍스트 파일을 가져올 | 가져오기 | ASCII를 단일.</li>
	<li>IRF ( 복사 및 붙여넣기를 사용 하는) 테이블의 두 번째 열에는 테이블을 다시 구성 합니다. A. 첫 번째 열에 시간 값 옆 B 두 번째 열에는 IRF 배치</li>
	<li>Ctrl + A를 눌러 플롯을 선택 하 여 모든 열을 선택 하 여 기록 된 광자 추적의 품질을 결정 | 다중 패널 | 9 패널. 높은 반사 피크 (그림 4 층)와 광자 추적을 분석 하지 않습니다.</li>
	<li>Ctrl 키 를 사용 하 여 B 열에서 IRF 뿐만 아니라 장착 품질 제어 평생 히스토그램을 포함 하는 모든 열 키 및 분석을 통해 비선형 피팅 로드 선택 | 피팅 | 비선형 곡선 적합 | 대화 상자를 열고.</li>
	<li>분석 소프트웨어를이 기능을 추가 하 여 deconvoluted 적합된 함수 ( 보충 파일 1에서 사용 가능)를 로드 ( 카테고리를 통해 | 사용자 정의 | 함수 | 추가). 맞는 함수 파일 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'를 선택 합니다. 이 함수 맞는 모노 지 수 감퇴 기능 형광 일생 히스토그램 IRF (즉, B는 테이블에서 열 두 번째)와 deconvoluted (공식 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(식 1) 와 t 는 시간, τ 는 명백한 형광 수명, A 는 진폭 및 y0 오프셋. 참고: 다른 옵션은 양방향 지 수 맞추기 기능 (식 2) 평생 히스토그램에 맞게: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(식 2) 기증자 유일한 조건에 느린 구성 요소 (τ1)의 일생을 고정 하 여 (단계 1.1.2: 샘플 #1)와 빠른 컴포넌트 (τ2) 탠덤 구조 (샘플 #3)를,의이 추정의 분수의 수 SNARE 단백질 느린 (A1) 및 (A2; 참조 토론; 빠른 부품의 진폭에서 복잡 한 (F) 방정식 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(식 3) Deconvoluted 이중 지 수 피팅 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf'에 대 한 맞춤된 기능 파일은 추가 파일 2에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>선택 장착 곡선 | 데이터 형식 X 으로 입력된 데이터와 동일. 참고:이 귀 착될 것 이다 적절 한 x-축 장착된 곡선의 스케일링.</li>
	<li>맞는눌러 곡선에 맞게. 참고:이 맞는 변환 하 고 형광 수명, 오프셋, 진폭 포함 된 테이블 배열의 '보고서 시트'를 생성 합니다. 그것은 또한 장착 되어 커브와 맞는 오차 데이터 시트를 생성 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li>
<li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167488905000571">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li>
<li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li>
<li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).</li>
<li>Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dance+of+the+SNAREs%3A+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/en/filelibrary/cell-culture/neon-protocols.par.0780.file.dat/hela-cervix.pdf">NEON transfection system cell protocols HeLa</a>. , (2017).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.590510">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171(2005).</li>
<li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://rsif.royalsocietypublishing.org/content/6/Suppl_1/S93">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li>
<li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li>
<li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li>
<li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li>
<li>Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4%2FSNAP23+mediates+adhesion%2C+cell+spreading+and+persistent+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li>
<li>Gómez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 syntaxin 4와 라이브 HeLa 세포에서 VAMP3 사이 상호 작용 올 무의 시각화에 대 한 무서 워 FLIM의 사용을 보여줍니다. Syntaxin 4 주로 플라즈마 멤브레인에 찾는 그것 exocytosis1,2,20,21을 중재 하는 Qa 무 단백질 이다. VAMP3는 주로 endosomal 구획을 재활용에 설명 하 고 원형질 막1,2,20대 뿐만 아니라 다른 endosomes를 밀매 중재 연구-무. 그러나, 무서 워 FLIM 분석 결과 다른 SNARE 단백질 공부 쉽게 적용할 수 있습니다. 유일한 조건은 이러한 SNAREs C 터미널 막 횡단 나선까지1,2로 대부분 SNARE 단백질에 대 한 경우입니다. 또한, 여기에 설명 된 프로토콜 무 단지 모든 진 핵 세포 유형에서는, 식물, 효 모 등의 시각화에 대 한 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리 무서 워의 기증자 fluorophore의 형광 수명 단축을 사용. 상호 보완적인 접근 수락자 fluorophore의 수명 시험 될 수 있는, 민감하게 방출 뚜렷한 상승 단계 때문에 명확한 증거를 제공 하는 공명 에너지 전달 발생 합니다.
현재, 무서 워 FLIM 기법 수 없습니다 lysosomal 구획에서 올 무 단지 시각화 하. Syntaxin 3-mCitrine-mCherry 직렬 식 구문에 대 한 mCherry 형광 종종 찾을 수 있습니다 더 축적 가능성에 해당 하는 lysosomal 구획, 반면 mCitrine 신호는 세포에 더 풍부한 juxtanuclear 지역에서 주변5. 같은 작은 단백질이 형광 단백질을 융합 했다 공동 표현된5mCitrine에 비해 mCherry의 비슷한 juxtanuclear 축적 관찰 되었다. 매우 낮은 pH를 특징으로하는 리소좀 (&#60; 4) 분해 효소의 높은 활동. MCherry의 juxtanuclear 축적 가능성이 mCitrine fluorophore에 비해 lysosomal 저하 mCherry fluorophore의 높은 저항에 의해 발생 합니다. 그것은 하지 때문의 mCitrine, pH 냉각 juxtanuclear mCherry의 축적 또한 셀5의 고정 시 발생. 따라서, 무서 워 FLIM 기술 underestimates 양의 juxtanuclear (lysosomal) 지역에서 무서 워 하 고 이것은 리소좀의 루멘 내에서 가혹한 조건을 살아 나는 다른 형광 기자 단백질을 필요로.
무서 워-FLIM 원칙적에서를 (semi-) 양적 예측 복잡 한5SNAREs의 분수의를 얻을 수 있습니다. 우리는이 프로토콜에서 설명,이 필요 합니다 더블-지 수 감퇴 기능 (식 2), 형광 일생 히스토그램의 피팅을 빠른 구성 요소의 진폭은 복잡 한 (SNAREs의 분 율에 비례 방정식 3)입니다. 그러나, 같은 피팅 2 구성 요소 모델은 기술적으로 도전적 이다. 여러 무료 맞춤된 매개 변수 (2 개의 형광 수명 및 2 개의 진폭)과 매개 변수가 서로 영향을 미칠 것 이다 수명에 작은 오류 진폭 및 부에 영향을 미칠 것입니다 때문에 특히 광자의 매우 많은 수를 요구 한다. 반대. 이러한 피팅 문제를 해결 하려면 느린 구성의 형광 수명 기증자 유일한 조건 (즉, 아니 무서 워;만 mCitrine 현재)의 수명에 고쳐질 수 있다 고 그는 협동의 수명과 빠른 구성 요소 (구성 최대한 expectable 무서 워)입니다. 그러나,이 한다 또한 해석 될 주의 형광 수명 이러한 제어 상태와 동일 하지 않을 수 있습니다 (자동 냉각, 쌍 극 자 방향, 변화는 microenvironment에) 여러 이유로 이탈 수 있기 때문에. 내 여러 무 복합물 (&#60; 10 nm) 수 결과 거리 의존 무서 워, 무서 워 "분자 통치자"로 사용 될 수 있는 동일한 원리에에서 그러나이 경우에, 가린다 무 단지의 정량화. 또한, 양적 예상은 항상 의미가 없습니다, 레이블이 SNAREs 생 (레이블된) SNAREs와 경쟁 하기 때문에. 결과적으로, mCherry 라는 무의 식을 수준 비율 무서 워5에 대 한 주요 결정 이다. 이러한 모든 주의 때문에 모노 지 수 감퇴 기능 (방정식 1)와 형광 일생 히스토그램을 맞게 하는 것이 좋습니다. 이 이점이 그것은 평생의 선험적 지식이 필요로 하지 않습니다 및 결과 명백한 평균 형광 일생 무 complexing5고체 측정을 제공 합니다.
그럼에도 불구 하 고, 양적 무서 워 FLIM 영상 2 분 피팅 모델 강력한 미래의 응용 프로그램을 가질 것 이라고 예상 된다. 올 무 인코딩 유전자는 염색체 내에서 CRISPR/CAS9 여 형광 기자 단백질 예 융합 수 있습니다. 이 생 단백질 수준과 레이블이 SNAREs의 배경이 생 무 단백질의 형광 라벨에 결과 하 고 그로 인하여 무서 워 FLIM에 의해 무 단지의 분수의 의미 있는 양적 평가 허용 합니다. 식 생 SNAREs의 수도 있습니다 매우 낮은 수 및 제공 하는 동안 상대적으로 낮은 형광 신호, 그것은 광자의 충분 한 수 얻을 수 있습니다, 특히 전체 셀 (요구 하는 광자의 단지 몇 가지 1, 000s) FLIM에 대 한 예정 이다. 또한, 이러한 무서 워 FLIM 측정 또한 높은 형광 신호에 더 나은 광자 통계 될 더 민감한 눈사태 포토 다이오드 감지기와 함께 수행할 수 있습니다.

막 매매 진 핵 세포, 어디 막 소포 기증자 세포 기관이에서 떨어져 새싹을 이동 하 고 대상 세포 기관이1,2퓨즈의 중앙 특징 이다. 미토 콘 드리 아를 제외한 모든 막 융해 단계는 SNARE 단백질 가족1,2의 구성원에 의해 촉매. 약 36 포유류 세포에서 회원과 약 20 효 모2SNARE 단백질 가족에 의하여 이루어져 있다. SNARE 단백질 하나 또는 두 개의 ~ 52 잔류물-긴, 기본적으로 구조화 되지 않은 지역, 올 무-모티브 라는 포함 되어 있습니다. 종종 SNARE 단백질은 C 터미널 막 횡단 나선1,2막 곁에. SNAREs 중앙 잔류물은 아르기닌 (R)과 글루타민 (Q) SNAREs1,2로 복잡 한 올 무에 기여에 따라 분류 될 수 있습니다. 막 융해 함께 4 올 무-모티브를 기여 하 고 기증자 및 수락자 막1,2균등 동족 SNAREs 3 또는 4의 상호 작용에 의해 구동 됩니다. 무 복잡 한 R-올 무 주제 및 3 Q-올 무 모티브 (Qa, Qb, Qc 불리) 이루어져 있다. 올 무-모티브, 소위 트랜스형성의 N termini에 시작 하는 복잡 한 대형-올 무-복잡 한, C-테르미니, 꽉 α 나선형 코일 코일 뭉치 라는 cis형성 쪽으로 진행 하는 고-올 무-복잡 한. 심지어는 하나의 올 무 복잡 한 복잡 한 형성 함께 기증자 및 수락자 막 끌 고 막 퓨전3대 에너지 장벽을 극복.
세포 내에서 특정 전송 경로의 고유 무 단지 할당은 종종 기술적으로 도전 이다. SNAREs 명확 하 게 밀매 하는 막의 특이성에 기여, 비록 그들은 무차별, 기능 중복, 그리고 그들의 기능 중복1,2. 이 때문에, 섭 동 실험 유전자 녹아웃, RNA 간섭, 차단 항 체, 또는 소개 지배적인 네거티브, 역할 수용 성 무 조각 SNAREs와 같은 대상으로 자주 할 초래 하지 다른 분명 고기 올가미2,4보상. 또한, 그것 어렵다 업스트림 밀매 이벤트에서 특정 막 융해 단계 차별화 SNAREs 여러 전송 노선2에 포함 될 수 있기 때문에. Immunolabeling 또는 형광 기자 단백질, 유전자 융합을 사용 하 여 현미경 검사 법 방법으로 올가미의 현지화 연구 문제에서 고통 하:으로 그들은 종종 여러 인신매매 단계, 및 (ii) 중재 (i) SNAREs 여러 세포를 찾습니다 그들의 지역화는 자동으로 그들은 기능적으로 복잡 한 대형을 올 무에 종사 하는 의미 하지 않는다. 마지막으로, 작은 단지 immunoprecipitation 실험 대상으로 미끼 및 다른 올가미는 올가미 중 하나를 사용 하 여를 사용 하 여 확인할 수 있습니다 하지만이 특정 세포 또는 밀매 경로를이 단지의 지정을 허용 하지 않습니다. 따라서, 현재, organellar 해상도 올 무 단지 시각화 하 아니 대체 기술이입니다. 면역 형광 검사 무 상호 작용을 증명할 수만 존재 또는 공동 지역화의 부재만을 표시할 수 있습니다, immunoprecipitation만 보여줄 수 있는 하는 동안 전체 상호 작용 무 세포 인구는 세포를 할당 하지 어디이 상호 작용을 발생합니다.
이러한 한계를 극복 하기 위해 무 단지 organellar 해상도 라이브 셀 내에서 양적 시각화에 대 한 허용 소설 방법 최근 개발한 Verboogen 외. 5 이 메서드는 괴기 하 게 이동한 형광 단백질 C 말기의 막 횡단 나선 융합 SNAREs의 쌍의 표현에 기반. 막 융해 및 cis의 형성 완료 후-복잡 한 올 무, 막 횡단 나선 C 테르미니에서 이러한 fluorophores는 즉시 서로 juxtaposed. fluorophores Förster 거리 내에서 잘 있습니다 (일반적으로 &#60; 5 nm), 결과 무서 워에서 녹색 이동 기증자 fluorophore에서 레드 이동 수락자 fluorophore5,6. 기증자 fluorophore 및 기증자 및 수락자 방출 (비율 무서 워)의 비율에서 측정 될 수 있다 수락자 fluorophore의 증가 된 방출의 냉각에 결과 무서 워. 그러나, 비율 두 개의 다른 분자 사이 무서 워는 도전, 기증자 및 수락자 SNAREs 다른 세포와 세포7,8중의 형광 크로스 토크 및 다른 수준 때문에. 무서 워도 여기와 광자의 방출 사이 시간 이다 형광 일생에서 측정할 수 있습니다. 만약 기증자 fluorophore 여 그것의 에너지를 방출 수 있습니다 무서 워, 형광 일생의 명백한 단축에이 경쟁 과정 결과. 이 FLIM7,8에 의해 측정 될 수 있다. 평생 무서 워 형광 일생은 fluorophore의 본질적인 속성 이며 그것의 농도를 구분 하지 않습니다으로 두 개의 다른 분자 사이 상호 작용을 측정 하기 위한 비율 마세요 보다 훨씬 더 강력한입니다. 또한, 무서 워 근사 양적, 무서 워의 효율성은 기증자와 수락자 fluorophores (기본적으로 단계 기능) 사이의 거리의 여섯 번째 힘에 반비례 하기 때문에입니다. 그러므로, 더블-구성 요소 감퇴 모델 FLIM에 의해 기록 된 형광 일생 히스토그램 피팅,으로 무서 워 FLIM 무 복잡 한 형성5에 종사 하는 작은 분자의 분수의 (semi-) 양적 예측에 대 한 허용 합니다.
최근,이 무서 워 FLIM 방법은 Verboogen 그 외 여러분 에 의해 사용 되었다 하 무 복잡 한 형성 기본 수지상 세포에 면역 시스템5의 시각화. 그것은 그 병원 성 자극을 발생, 수지상 세포 경로 재정의 그들의 막 매매 특히 Qa-무 syntaxin 4와 R-무 소포 관련 막 단백질 (VAMP) 3의 증가 complexing 함께 표시 했다는 원형질 막입니다. 이 증가 올 무 복잡 한 형성 가능성이 인터 루 킨-65등 염증 성 cytokines의 분 비에 대 일 분 비 능력을 충족 하기 위해 필요 합니다. 이 프로토콜 무 단지의 시각화 및 (semi-) 양적 측정에 대 한 무서 워 FLIM 데이터 수집에 필요한 실험 단계를 설명 합니다.그것은 전체 세포 형광 일생 히스토그램 무 상호 작용 양적 견적으로 명백한 형광 수명에 따른 모노-및 bi-지 수 감퇴 기능에 맞게 방법을 설명. 이 프로토콜에서 널리 HeLa 세포 라인 예를 들어, 사용 하지만 다른 진 핵 세포에서 올 무 단지 공부를 메서드를 쉽게 확장할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine'</td><td>추가유전자</td><td>ID 92422</td><td>형광 단백질이 C-말단 막관통 나선에 융합된 다른 SNARE도 사용할 수 있습니다. mCitrine-mCherry 대신에, 스펙트럼으로 분리된 형광단의 다른 공여체-수용체 쌍도 사용될 수 있다(예: CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92423</td><td>C-말단 막관통 나선에 형광 단백질이 융합된 다른 SNARE도 사용할 수 있습니다. mCitrine-mCherry 대신에, 스펙트럼으로 분리된 형광단의 다른 공여체-수용체 쌍도 사용될 수 있다(예: CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92426</td> 최대 <td>달성 가능한 FRET를 위한 양성 대조군.</td></tr><tr><td>헬라 셀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시&nbsp;</td><td>Willco Wells</td><td>HBST-3522</td><td>기타 라이브 셀 이미징 챔버</td></tr>는 <tr><td>대체 Dulbecco의 Modified Eagle Medium</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Greiner Bio-one</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Pen/Strep</td></tr>은 <tr><td>대체 라이브 셀 이미징으로 작동합니다. medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14291DJ</td><td>매체로부터의 형광이 방지되는 한 다른 모든 라이브 셀 이미징 솔루션이 작동합니다</td></tr><tr><td>63x 1.20 NA 수침 대물렌즈가 있는 Leica SP8 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>시간 영역 FLIM이 가능한 다른 컨포칼 현미경도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>펄스 백색광 레이저</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>다른 펄스 레이저 소스도 사용할</td></tr> <tr>수 있습니다<td>TCSPC(Time-Correlated Single Photon Counting) 시스템</td><td>PicoQuant</td><td>PicoHarp 300</td><td></td></tr> PT32ICS 변환 소프트웨어 <tr><td></td><td></td><td></td> 디콘볼루션이 가능한 www.membranetrafficking.com 데이터 분석 소프트웨어 프로그램의 '소프트웨어' 섹션에서 사용 가능 Originlabs OriginPro 2016 <td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensity Fiji ImageJ를 사용한 FLIM 이미지 컨볼루션을 위한 맞춤형 Fiji ImageJ 매크로</td><td></td> B&uuml<td>의 '소프트웨어' 섹션에서 사용 가능 www.membranetrafficking.com</td><td></td></tr><tr><td> rker 헤모사이토미터</td><td>VWR</td><td>630-1541</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B 브라운 멜숭겐&nbsp; AG</td><td>362 3140</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2 mM</td><td>Merck</td><td>108417</td><td>CAS: 60-00-4</td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td>CAS: 72-57-1</td></tr><tr><td>NEON cell electroporation device</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

그들은 진 핵 세포 내의 막 융합 촉매 성 N-ethylmaleimide 중요 한 융해 단백질 (NSF) 첨부 파일 단백질 수용 체 (올 무) 단백질 막 밀매, 키 있습니다. 약 36 다른 회원 SNARE 단백질 가족에 의하여 이루어져 있다. 특정 세포내 수송 노선 함으로써 특이성에 기여 하는 3 또는 4 올 무 단백질의 특정 세트와 막 매매의 충실도 의해 촉매 된다. 그러나, SNARE 단백질의 정확한 기능을 공부 하 고는 기술적으로 도전적, SNAREs는 매우 풍부 하 고 기능적으로 중복 대부분 SNAREs 여러 있고 중복 기능 때문에. 이 프로토콜에서 라이브 셀에 올 무 복잡 한 대형의 시각화에 대 한 새로운 방법을 설명 합니다. 이 방법은 C 말기 형광 단백질을 융합 하는 작은 단백질을 표현에 근거 하 고 포스터 공명 에너지에 의해 그들의 상호 작용을 측정 전송 현미경 검사 법 (FLIM) 이미징 (무서 워) 고용 형광 일생. 형광 일생 히스토그램 multicomponent 감퇴 모델 피팅,으로 무서 워 FLIM 다른 소포에서 (semi-) 올 무 복잡 한 대형의 분수의 양적 평가 허용 합니다. 이 프로토콜 성공적으로 무 복잡 한 대형 플라즈마 멤브레인과 포유류 세포 라인에 기본 면역 세포, endosomal 구획을 시각화에 적용 되 고 올 무에 다른 세포 기능을 공부 하기 쉽게 확장 될 수 있습니다. 동물, 식물, 하 고 곰 팡이 세포입니다.

올 무 무서 워 FLIM에 의해 상호 작용을 측정 하기 위한 시험의 근거는 그림 1에 표시 됩니다. C-테르미니 동족 SNARE 단백질의 막 횡단 나선의 괴기 하 게 이동한 형광 성 단백질 (예를 들어, mCitrine 및 mCherry)의 쌍에 융합 된다. Cis의 형성-서로 juxtaposed 즉시 되 고 이러한 형광 단백질에서 막 융합 결과 복잡 한 올 무, 무서 워. 그림 2 는 붙일 레이블 SNARE 단백질을 표현 하는 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지. Syntaxin 4 mCitrine 구문 (기증자만; 아니 무서 워)와 syntaxin 3 두 mCitrine 융합 세포의 제어 조건 뿐만 아니라는 셀 표현 syntaxin 4 mCitrine (기증자 fluorophore) VAMP3-mCherry (수락자 fluorophore) 표시 그리고 mCherry (최대한 expectable 무서 워)에. 그림 3 은 동반 형광 수명 및 모노 지 수 감퇴 기능 (그림 3A-B)와 bi 지 수 감퇴 기능 (각 픽셀의 평생 히스토그램을 피팅 하 여 생성 된 FLIM 이미지 그림 3C - D). 그림 4A 우리의 설치 현미경 커버 글라스의 다시 산란에 의해 측정의 IRF 보여줍니다. 그림 4B-전자, 전체 셀 맞춤 동반 함께 FLIM 분석의 대표적인 형광 수명 히스토그램 모노 지 수 감퇴 기능에 대 한 곡선이 표시 됩니다. 그림 4 층 저명한 반사 피크 결과 현미경 커버 유리의 표면에 너무 가까이 몇 군데 실험의 형광 수명 히스토그램을 표시 됩니다. 그림 4G 대표 bi 지 수 감퇴 기능에 맞게 평생 히스토그램을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
그림 1: 무서 워 여 무 단지 시각화에 대 한 근거의 계획. (블루; 신경 올가미 (단백질 데이터베이스 3HD717) 소포 관련 막 단백질 (VAMP) 2의 (A) 구조 모델 R), syntaxin 1 (빨강; Qa-SNARE), 및 SNAP25 (그린, 둘 다 Qb와 Qc 무 모티브를 포함). Syntaxin-1의 막 횡단 나선의 C-말단은 mCitrine (기증자 fluorophore; 단백질 데이터베이스 3DQ118)에 활용 된. VAMP2의 막 횡단 나선의 C-말단 mCherry (수락자 fluorophore; 단백질 데이터베이스 2H5Q19)에 활용 됩니다. (B) 올 무 계획 막 퓨전 무서 워 결과 중재. Cis의 형성에 의해 막 융해 후-복잡 한 올 무는 올가미는 즉시 서로 인 무서 워 juxtaposed. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
그림 2: 형광 단백질을 융합 하는 SNARE 단백질의 표정. 첫 번째 열: 기증자 fluorophore, 516에 흥분된 nm. 두 번째 열: 수락자 fluorophore, 610에 흥분된 nm. (A) 기증자만 조건. Syntaxin 4-mCitrine (기증자 fluorophore; 병합에서 녹색) 표현 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지. 수락자 채널 (두 번째 열) 형광 크로스 토크를 보여줍니다. (B) 부정적인 컨트롤 (무서 워). 두 syntaxin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (수락자 fluorophore; 병합에서 마젠타색)와 표현 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지. (C) 긍정적인 컨트롤 (최대한 expectable 마세요). Syntaxin 3-mCitrine-mCherry 연동 표현 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지 생성 합니다. 참고는 mCitrine와 mCherry의 형광 신호 오버랩, mCherry에 비해 lysosomal 저하 mCitrine의 낮은 저항 때문에 가능성이 완전히 하지 않습니다 (토론 섹션 참조). BF: 밝은 필드. 스케일 바, 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
그림 3: 무 복잡 한 대형의 FLIM 이미지. (A) 그림 2에 표시 된 셀의 대표적인 형광 수명 이미지. 이미지는 이미지 cytometry 표준 (.ics) PT32ICS 소프트웨어를 사용 하 여 먼저 변환 TCSPC 시스템 (.pt3)에 의해 기록 된 광자 추적에 의해 생성 했다. 단일 픽셀 이미지 다음 15-100% 강도, 7 픽셀 원형 binning 및 monoexponential 맞춤 알고리즘 (Marquardt)에서 임계 처리와 TRI2 소프트웨어12,13 를 사용 하 여 생성 된 형광 일생 장착. 평균 명백한 형광등 수명을 나타냅니다. (B) FLIM 이미지 형광 일생 이미지 (A에 표시 된 패널) ( 그림 2참조) mCitrine 기증자 fluorophore의 형광 강렬과 복잡 했다. 회선은 피지 ImageJ 맞춤 매크로 사용 하 여 수행 ( 재료의 표참조). (C) 형광 수명 및 syntaxin 4-mCitrine와 VAMP3-mCherry을 표현 하는 패널 A-B에서에서 하지만 지금은 bi 지 수 감퇴 곡선으로 피팅 HeLa 세포의 FLIM 이미지 (수명 제어 조건;에 고정 볼 단계 4.4 프로토콜)입니다. 픽셀 색상 표시 VAMP3와 syntaxin 4 단지에서의 예상된 분수 F (식 3). (D) 동일 패널 B, 하지만 양방향-지 수에 대 한 적합. 회선은 피지 ImageJ 맞춤 매크로 사용 하 여 수행 ( 재료의 표참조). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
그림 4: 전체 셀 FLIM 분석. (A) 설정의 악기 응답 함수 (IRF). IRF (물을 포함 하는 깨끗 한 유리 현미경 접시를 사용 하 여) 유리-물 인터페이스에 다시 뿌리를 사용 하 여 측정 했다.(EB-) 전체 그림 2 및 그림 3에 표시 된 셀에 대 한 평생 히스토그램 셀. 이미지에 모든 광자 풀링된 했다. 커브는 IRF와 deconvoluted 되었고 모노 지 수 감퇴 기능 (방정식 1)를 장착. 이 셀에 대 한 형광 수명 2.82의 가져온 ns (셀만 syntaxin 4-mCitrine; 기증자만 패널 B 표현), 2.09 ns (공동 syntaxin 4-VAMP3-mCherry와 mCitrine을 표현 하는 셀, 패널 C), 그리고 2.08 ns (셀 syntaxin 3-표현 mCitrine-mCherry 연동 구성; 최대한 expectable 무서 워 제어; 패널 D)입니다. 상 하지만 지금은 y 축 로그 스케일링과 같은 그래프를 보여줍니다. 패널 전자 표시 패널 B.의 감퇴 곡선의 오버레이 (F) 예 형광 일생 히스토그램의 현미경 커버 슬립의 표면에 너무 가까이 기록 했다. 이 결과 큰 반사 피크 (노란색 음영된 지역으로 묘사). (G) 패널 C, 지금 수명 함께 bi 지 수 감퇴 곡선으로 피팅 하지만 동일 (프로토콜의 단계 4.4 참조) 제어 조건에 고정. 빠른(1)및 구성 요소(2)느린 진폭 되었고 14.42 0.01, 각각, SNAREs 0.99 (식 3)의 복잡 한 F 의 예상 보다 결과. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1입니다. 함수 파일 FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2입니다. 함수 파일 FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

이 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 SNARE 단백질의 복잡한 형성을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 특정 소기관 이동 단계를 촉매하는 SNARE 단백질 세트를 식별하는 것과 같은 막 이동 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 SNARE가 복잡한 형성에 관여하는 세포 위치를 직접 시각화할 수 있다는 것입니다.이 실험에서는 3개의 Eppendorf tube로 나뉘어진 900,000개의 HeLa cell이 transfection에 사용됩니다. text protocol에 설명된 대로 세포를 다음 구조로 transfection합니다. 1번 샘플은 syntaxinin-4 mCitrine 구문을, 2번 샘플은 syntaxinin-4 mCitrine 및 VAMP3-mCherry를 사용하고, 3번 샘플은 synsyninin-3을 mCitrine 및 mCherry 모두에 융합했습니다.세포 배양 인큐베이터에서 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10%FCS 및 1% 항생제 항진균제가 공급되는 고포도당 DMEM에서 5%CO2로 형질주입된 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 흡인하고 2분 동안 살아있는 세포 이미징 배지로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 새로운 이미징 매체에 놓습니다.이 절차를 시작하려면 섭씨 37도의 가열된 스테이지에서 공여체 형광단 및 시간 분해 데이터 수집에 대한 펄스 여기 소스가 있는 시간 도메인 형광 수명 이미징 컨포칼 현미경 아래에 샘플 번호 2를 놓습니다. 각 형광 수명 이미징 현미경 검사 또는 FLIM 측정 전에 mCitrine 및 mCherry 표지 SNARE 단백질의 가시적 발현을 가진 세포를 선택하고 두 형광단의 동시 여기와 함께 256 x 256 픽셀의 컨포칼 이미지를 기록합니다. 이전에 기록된 컨포칼 이미지와 동일한 치수 및 공간 해상도로 기록되는 FLIM 이미지로 FLIM 실행을 클릭하여 FLIM 이미지를 기록합니다.전체 세포 FLIM 분석을 위해 최소 50, 000 광자 또는 픽셀당 최소 400 광자로 이미지를 기록합니다. 반사 시야를 피하기 위해 유리 표면에서 최소 1마이크로미터 떨어진 곳에 FLIM 측정값을 기록하는 것이 중요합니다. 샘플 번호 2의 여러 세포와 샘플 번호 1 및 샘플 번호 3의 세포에 대해 이미징을 반복합니다.다음으로, 기기 응답 기능 또는 IRF를 기록하기 위해 현미경 스테이지에 깨끗한 유리 커버 슬립을 놓습니다. 방출 검출기의 모노크로메이터를 여기 파장에 맞추고 FLIM 실행 버튼을 클릭하여 유리 커버 슬립에서 후방 산란과 함께 FLIM 이미지를 기록합니다. 사진 녹음은 PT32ICS 변환 소프트웨어를 사용하여 FLIM 이미지로 변환됩니다.소프트웨어를 구성합니다. FLIM 이미지를 생성하기 위해 output을 ImageJ로 설정합니다. 이미지 크기를 256 x 256 픽셀로 설정하고 채널을 2로 설정합니다.convert를 누르고 하나 이상의 광자 추적을 로드합니다. Ctrl 키를 길게 눌러 여러 광자 추적을 선택합니다. FLIM 이미지는 광자 추적이 저장된 동일한 폴더에 생성되어야 합니다.먼저 디콘볼루션에 맞출 수 있는 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 엽니다. 각 광자 추적에 대한 히스토그램이 포함된 텍스트 파일을 가져옵니다. IRF가 테이블의 두 번째 열, 열 A의 시간 값 옆에 있도록 테이블을 재구성합니다. 모든 열을 선택하여 기록된 광자 추적의 품질을 확인합니다.반사 피크가 높은 광자 트레이스를 분석하지 마십시오. 예를 들면 다음과 같습니다. Ctrl 키를 사용하여 피팅할 품질 제어 수명 히스토그램이 포함된 모든 열과 B 열의 IRF를 선택하고 비선형 피팅을 로드합니다.디콘벌루션 피팅 함수(deconvoluted fit function)를 해석 소프트웨어에 추가하여 불러옵니다. 피팅 함수 파일을 선택합니다. 이 함수는 IRF로 디콘볼루션된 mono exponential decay 함수를 사용하여 형광 수명 히스토그램을 맞춥니다.적합된 곡선의 X축 배율 조정을 수행합니다. fit을 눌러 곡선을 맞춥니다. 이렇게 하면 피팅이 변환되고 형광 수명, 오프셋 및 진폭이 포함된 테이블이 있는 어레이에 보고서 시트가 생성됩니다.또한 적합된 곡선과 적합치의 잔차가 포함된 데이터 시트를 생성합니다. 표시된 것은 4 mCitrine의 구문, VAMP3 mCherry가 있는 snytaxin 4 mCitrine 또는 3 mCitrine mCherry 탠덤 구조체의 구문만 발현하는 헬로셀의 대표적인 컨포칼 이미지입니다. 이러한 수반되는 형광 수명 이미지에서 색상은 평균 겉보기 형광 수명을 나타냅니다.그런 다음 이미지를 mCitrine 공여체 형광단의 형광 강도로 뒤얽혔습니다. 다음은 bi-exponential decay 함수를 피팅한 동일한 이미지입니다. 픽셀 색상은 VAMP3와 복소수의 syntaxin 4의 추정된 분수를 나타냅니다.설정의 기기 응답 기능은 glass water 인터페이스의 후방 산란을 사용하여 측정되었습니다. 전체 세포 수명 히스토그램은 4개의 mCitrine에서 구문만 발현하고, 4개의 mCitrine에서 VAMP3 mCherry와 구문을 함께 발현하고, 3개의 mCitrine mCherry 탠덤 구성물에서 구문을 발현하는 세포에 대해 표시됩니다. 패널 E는 패널 B, C 및 D의 감쇠 곡선 오버레이를 보여줍니다. 인레이는 동일한 그래프를 표시하지만 Y축의 로그 스케일링을 사용합니다.현미경 커버 슬립의 표면에 너무 가깝게 기록된 형광 수명 히스토그램은 노란색 음영 영역으로 표시된 큰 반사 피크를 초래했습니다. 마지막으로, bi-exponential decay function을 가진 대표 적합치가 있는 수명 히스토그램이 표시됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 2-4시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 donor와 interceptor SNARES의 발현 수준이 수명에 영향을 미칠 수 있는 동안 여러 세포를 기록하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 SNARE 매개 막 이동의 재발근과 관련된 세포 유형별 질문에 답하기 위해 세포를 활성화할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 멤브레인 트래픽 분야의 연구자들이 모든 진핵 세포에서 소기관 트래픽의 세포 간 경로를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 FLIM 데이터를 기록하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 유전자 변형 생물체와 고출력 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 시도하는 동안 항상 장갑 및 눈 보호와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 통한 세포 내 SNARE 트래픽 시각화

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

출처: Pigazzini, M. L., et. al. 노화 시 아밀로이드 구조의 특성화 C. 엘레간스 형광 수명 이미징을 사용하여. J. Vis. Exp. (2020). 이 동영상은 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 사용하여 C. elegans 뉴런에서 polyQ 단백질 응집을 평가하고 대조군 및 샤페론 단백질 결핍 기생충을 비교하는 방법을 보여줍니다. 샤페론이 결핍된 웜의 응집이 증가하면 군집된 형광단 간의 에너지 전달이 촉진되어 형광 수명이 단축됩니다. FLIM에서 생성된 색상으로 구분된 지도는 이러한 차이를 묘사하여 실험 그룹 간의 집계 수준을 강조합니다.

Caenorhabditis elegans 뉴런에서 PolyQ 단백질 응집의 형광 수명 이미징

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

절차는 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나제 A 활동을 시각화하기 위해 제시된다. 향상된 A-키나아제 활동 리포터, tAKARα는 피질 뉴런으로 표현되고 두개골 창을 통해 이미징에 접근할 수 있게 된다. 2 광자 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법은 강제운동 도중 생체 내 PKA 활동을 구상하기 위하여 이용됩니다.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD) 분석은 구조 및 동적 특성 측면에서 고유 한 시간 진화 특성을 강조하기 위해 매크로 피노솜에 적용됩니다. 그런 다음 Macropinosomes는 시간 불변의 평균 구조 / 동적 특성을 가진 세포 하부 구조에 대한 참조로서 인슐린 분비 과립 (ISGs)과 비교됩니다.

시공간 변동 분광법에 의한 밀매된 세포하 나노구조체의 구조적 및 동적 특성 조사

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

배우세요 형광 일생 화상 현미경법을 이용해 살아있는 HeLa 세포에서 SNARE 단백질 복합체 형성을 정량적으로 시각화하는 방법을. 이 기법은 막 소포 수송 메커니즘 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

더 많은 동영상 탐색