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이 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 SNARE 단백질의 복잡한 형성을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 특정 소기관 이동 단계를 촉매하는 SNARE 단백질 세트를 식별하는 것과 같은 막 이동 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 SNARE가 복잡한 형성에 관여하는 세포 위치를 직접 시각화할 수 있다는 것입니다.

이 실험에서는 3개의 Eppendorf tube로 나뉘어진 900,000개의 HeLa cell이 transfection에 사용됩니다. text protocol에 설명된 대로 세포를 다음 구조로 transfection합니다. 1번 샘플은 syntaxinin-4 mCitrine 구문을, 2번 샘플은 syntaxinin-4 mCitrine 및 VAMP3-mCherry를 사용하고, 3번 샘플은 synsyninin-3을 mCitrine 및 mCherry 모두에 융합했습니다.

세포 배양 인큐베이터에서 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10%FCS 및 1% 항생제 항진균제가 공급되는 고포도당 DMEM에서 5%CO2로 형질주입된 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 흡인하고 2분 동안 살아있는 세포 이미징 배지로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 새로운 이미징 매체에 놓습니다.

이 절차를 시작하려면 섭씨 37도의 가열된 스테이지에서 공여체 형광단 및 시간 분해 데이터 수집에 대한 펄스 여기 소스가 있는 시간 도메인 형광 수명 이미징 컨포칼 현미경 아래에 샘플 번호 2를 놓습니다. 각 형광 수명 이미징 현미경 검사 또는 FLIM 측정 전에 mCitrine 및 mCherry 표지 SNARE 단백질의 가시적 발현을 가진 세포를 선택하고 두 형광단의 동시 여기와 함께 256 x 256 픽셀의 컨포칼 이미지를 기록합니다. 이전에 기록된 컨포칼 이미지와 동일한 치수 및 공간 해상도로 기록되는 FLIM 이미지로 FLIM 실행을 클릭하여 FLIM 이미지를 기록합니다.

전체 세포 FLIM 분석을 위해 최소 50, 000 광자 또는 픽셀당 최소 400 광자로 이미지를 기록합니다. 반사 시야를 피하기 위해 유리 표면에서 최소 1마이크로미터 떨어진 곳에 FLIM 측정값을 기록하는 것이 중요합니다. 샘플 번호 2의 여러 세포와 샘플 번호 1 및 샘플 번호 3의 세포에 대해 이미징을 반복합니다.

다음으로, 기기 응답 기능 또는 IRF를 기록하기 위해 현미경 스테이지에 깨끗한 유리 커버 슬립을 놓습니다. 방출 검출기의 모노크로메이터를 여기 파장에 맞추고 FLIM 실행 버튼을 클릭하여 유리 커버 슬립에서 후방 산란과 함께 FLIM 이미지를 기록합니다. 사진 녹음은 PT32ICS 변환 소프트웨어를 사용하여 FLIM 이미지로 변환됩니다.

소프트웨어를 구성합니다. FLIM 이미지를 생성하기 위해 output을 ImageJ로 설정합니다. 이미지 크기를 256 x 256 픽셀로 설정하고 채널을 2로 설정합니다.

convert를 누르고 하나 이상의 광자 추적을 로드합니다. Ctrl 키를 길게 눌러 여러 광자 추적을 선택합니다. FLIM 이미지는 광자 추적이 저장된 동일한 폴더에 생성되어야 합니다.

먼저 디콘볼루션에 맞출 수 있는 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 엽니다. 각 광자 추적에 대한 히스토그램이 포함된 텍스트 파일을 가져옵니다. IRF가 테이블의 두 번째 열, 열 A의 시간 값 옆에 있도록 테이블을 재구성합니다. 모든 열을 선택하여 기록된 광자 추적의 품질을 확인합니다.

반사 피크가 높은 광자 트레이스를 분석하지 마십시오. 예를 들면 다음과 같습니다. Ctrl 키를 사용하여 피팅할 품질 제어 수명 히스토그램이 포함된 모든 열과 B 열의 IRF를 선택하고 비선형 피팅을 로드합니다.

디콘벌루션 피팅 함수(deconvoluted fit function)를 해석 소프트웨어에 추가하여 불러옵니다. 피팅 함수 파일을 선택합니다. 이 함수는 IRF로 디콘볼루션된 mono exponential decay 함수를 사용하여 형광 수명 히스토그램을 맞춥니다.

적합된 곡선의 X축 배율 조정을 수행합니다. fit을 눌러 곡선을 맞춥니다. 이렇게 하면 피팅이 변환되고 형광 수명, 오프셋 및 진폭이 포함된 테이블이 있는 어레이에 보고서 시트가 생성됩니다.

또한 적합된 곡선과 적합치의 잔차가 포함된 데이터 시트를 생성합니다. 표시된 것은 4 mCitrine의 구문, VAMP3 mCherry가 있는 snytaxin 4 mCitrine 또는 3 mCitrine mCherry 탠덤 구조체의 구문만 발현하는 헬로셀의 대표적인 컨포칼 이미지입니다. 이러한 수반되는 형광 수명 이미지에서 색상은 평균 겉보기 형광 수명을 나타냅니다.

그런 다음 이미지를 mCitrine 공여체 형광단의 형광 강도로 뒤얽혔습니다. 다음은 bi-exponential decay 함수를 피팅한 동일한 이미지입니다. 픽셀 색상은 VAMP3와 복소수의 syntaxin 4의 추정된 분수를 나타냅니다.

설정의 기기 응답 기능은 glass water 인터페이스의 후방 산란을 사용하여 측정되었습니다. 전체 세포 수명 히스토그램은 4개의 mCitrine에서 구문만 발현하고, 4개의 mCitrine에서 VAMP3 mCherry와 구문을 함께 발현하고, 3개의 mCitrine mCherry 탠덤 구성물에서 구문을 발현하는 세포에 대해 표시됩니다. 패널 E는 패널 B, C 및 D의 감쇠 곡선 오버레이를 보여줍니다. 인레이는 동일한 그래프를 표시하지만 Y축의 로그 스케일링을 사용합니다.

현미경 커버 슬립의 표면에 너무 가깝게 기록된 형광 수명 히스토그램은 노란색 음영 영역으로 표시된 큰 반사 피크를 초래했습니다. 마지막으로, bi-exponential decay function을 가진 대표 적합치가 있는 수명 히스토그램이 표시됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 2-4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 donor와 interceptor SNARES의 발현 수준이 수명에 영향을 미칠 수 있는 동안 여러 세포를 기록하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 SNARE 매개 막 이동의 재발근과 관련된 세포 유형별 질문에 답하기 위해 세포를 활성화할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 멤브레인 트래픽 분야의 연구자들이 모든 진핵 세포에서 소기관 트래픽의 세포 간 경로를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 FLIM 데이터를 기록하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 유전자 변형 생물체와 고출력 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 시도하는 동안 항상 장갑 및 눈 보호와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.