Name: 화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 화학적 교차결합과 네이티브 질량 분석을 결합하여 다중 소단위 단백질 복합체의 구조를 규명하는 방법을. RvB1/B2 및 CPS 복합체 분석에 적용 가능한 이 기법은 구조 생물학 연구에 필수적인 상보적 정보를 제공합니다.

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우리는 유용한 논의 위해 우리의 동료를 감사합니다. 우리 또한 단백질 복합물을 제공 하기 위한 Ilme Schlichting 그리고 칼 피터 Hopfner을 감사 합니다. 우리는 교육 및 연구를 위한 연방 내각에서 자금을 인정 (BMBF, ZIK 프로그램, 03Z22HN22), 유럽 지역 개발 기금 (EFRE, ZS/2016/04/78115)와 MLU C.S. 및 Wellcome 트러스트 (109854/658에서에서 자금 할레 비 텐 베르크 Z/15/Z) 하 되

저자는 공개 없다.

프로토콜은 다 소 단위 단백질 복합물의 질량 분석 기반 구조 분석을 위해 제공 됩니다. 프로토콜에 설명 된 두 가지 기술을 대부분 보완 결과 제공 하 고 단백질에서 구조적 배열에 대 한 통찰력을 얻을 수 있다 (-ligand) 단지 기존의 구조 기술을 하 여 공부 하기 어려운. 네이티브 질량 분석 subcomplexes 및 안정적인 상호 작용 모듈을 분석 하 여 상호 작용 단백질으로 서 단백질 stoichiometries에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 교차 연결, 다른 한편으로, 직접 접촉 사이트에 대 한 정보를 얻을 수 있습니다. 사용 cross-linker 따라 특정 유연성 수 또는 분석에 포함 되어야 합니다.
제공 된 프로토콜 수행 하기 쉽고 하지 시간이 일반에 있습니다. 전체 프로토콜 일주일 내에서 실행 될 수 있습니다 하 고 있지만, 복잡 한 단백질의 일정 금액은 성공적인 분석에 필요한 거의 모든 단백질 복합물에 적용할 수 있습니다. 샘플 준비 간단 하 고 구체적으로 순화 된 단백질 복합물을 필요 하지 않습니다. 그러나, 하나의 범하기 오염 샘플의 질량 분석 기반 단백질 식별에 대 한 샘플 준비 중입니다. 대부분의 경우에서 이러한 오염 먼지, 피부, 또는 머리에서 기인 하는 keratins를 포함 합니다. 따라서, 장갑 및 실험실 외 투를 입고 같은 여분 배려, 수성 버퍼도 고 순도 용 매를 사용 하 여 취해야 한다 질량 분석 기반 단백질 식별에 대 한 샘플 준비 중. 선호도 태그를 사용 하는 경우 보호자 등 다른 오염 단백질은 일반적으로 단백질 정화, 예를 들면, 동안 소개 합니다. 이러한 경우에 단백질 정화 개선 되어야 합니다, 예를 들어 세척 단계를 증가 시켜. 어떤 경우에, 단백질 오염 샘플에는 쉽게 식별 데이터베이스 검색 동안 분류 필터를 생략 하 여 (즉, 모든 종에서 단백질에 대 한 검색). 경우에 몇 가지 펩 티 드 관찰 된다 (즉, 낮은 단백질 범위 얻어질 수), 비록 충분 한 샘플을 사용할 수 있는 그것은 다른 성분을 사용 하 여 소화 하는 동안 해야 할 수도 있습니다. 트립 신 펩 티 드;의 충분 한 번호를 생성 하는 일반적 그러나, 경우에 따라 막 단백질 또는 단백질의 막 도메인 등 tryptic 분열 사이트의 수는 감소 하 고 소수 성 아미노산을 대상으로 하는 다른 효소는 더 나은 선택 키를 누릅니다.
계측, 측면에서 특히 수정 된 악기는 가스 상으로 전송 하는 동안 공유 비 상호 작용을 유지 하는 기본 질량 분석에 대 한 필요 합니다. 여러 악기 종류, Q ToF orbitrap 악기를 포함 하 여 도입 되었습니다. 수정된 Q ToF 질량 분석기를 상업적으로 사용할 수 있는 기본 질량 분석에 대 한 몇 년 이후 후자 최근에 소개한 고 대부분의 경우에서 특수 수정45필요. 그러나, 고해상도 악기의 응용 프로그램 공부 하는 여러 개의 ligands 및 그들의 부 량46,47 바인딩을 허용 하 고 미래의 어플리케이션을 위해 유망.
액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 상호 연결 된 디 펩 티 드를 식별 하기 위해 몇 가지 수정 된 표준 절차를 적용할 수 있습니다. 그러나, 데이터베이스 검색 제한 하는 요인이 전문된 소프트웨어는 거의 큰 데이터베이스를 다룰 수 있는 그리고 감소 된 데이터베이스는 복합물의 단백질 소 단위를 포함 하는 필요 이다. 최근 연구 질량 분석 쪼갤 cross-linkers 사용 전체 세포 lysates48,49상호 작용 단백질을 대상으로. 탠덤 질량 분석 실험에서 주로 조각 화학 cross-linkers 사용 하 여 선형 펩 티 드 (는 cross-linker에 의해 수정), 추가 조각화로 식별 될 수 및 데이터베이스 검색 선형 펩 티 드, 그리고이 감소 검색 시간과 전산 검색 공간입니다. 그러나, 이러한 실험을 수행 하는 이온 트랩 질량 분석기 또는 이온 함정으로 하이브리드 질량 분석기가 필요 합니다. 일반적으로, 거짓인 중요 한 문제는, 교차 결합 된 펩 티 드의 질량 스펙트럼 종종 유효성이 검사 됩니다 수동으로 데이터 분석 시간을 엄청나게 확장 그들의 조각 스펙트럼의 품질에 의해. 추가 유효성 검사 단계는 그러므로 잠재적인 미래의 응용 프로그램 없이 적용 될 수 있는 강력한 득점 시스템을 개발. 데이터 분석을 개선 하 고 가양성의 수를 줄이는 한 가지 방법은 틀린 발견 비율 계산 및 그들의 응용 프로그램 데이터 세트50cross-linking를 소개 했다.
일반적으로, 여기서 설명 질량 분석 기술을 더 보충 될 수 있다 (예를 들어, 공유 라벨) 분석에서 출력을 높일. 다른 수정 및 프로토콜의 개선 쉽게 구현할 수 있습니다. 같은 비교 가교34 단백질 조립에 구조적 변화를 unravels. 네이티브 질량 분석에서 더 개발 요즘 막 단백질51,52 의 분석 및 지질28,,5253,54 와 그들의 상호 작용 허용 . 기본 질량 분석에 대 한 고해상도 질량 분석기의 새로운 개발 응용 프로그램 및 ligand 바인딩 예, 지질 막 단백질의 바인딩 확장, 지금 분석45, 에 포함 될 수 있습니다. 46. 전산 모델링 접근법과 함께, 이러한 기술을 다양 한 해상도55의 구조 모델을 제공할 수 있습니다. 없는 크리스탈 구조 그대로 복잡 한 또는 단일 하위 단위에 사용할 수 있는 경우에, 질량 분석 단백질 상호 작용 및 알 수 없는 복잡 한 토폴로지에 첫 번째 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사용 하는 기법에 따라 얻은 결과, 알 수 없는 복잡 한 저해상도 모델56,,5758얻어질 수 있다. 크리스탈 구조 또는 상 동 모델을 사용할 수 경우 질량 분석에서 받은 구조 정보도 근처 기본 모델59를 얻을 수 있습니다.
다른 구조 기법을 비교 하 여 질량 분석 장점이 낮은 샘플 금액 필요, 그것은 이기종 샘플을 취급할 수 있다 하 고 무제한 크기의 단백질 복합물에 적용 됩니다. 또한, 질량 분석 동적인 단백질 시스템의 조사 수 있습니다. 솔루션에 존재 하는 단백질 또는 단백질 복합물의 다른 인구 일반적으로 함께 분석 하 고 따라서 달리 특정 집단의 선택이 필요한 다른 구조 기술로 모든 conformations 유지 됩니다 동안 분석 하 고 한 실험에서 평가할 수 있는 있습니다. 정량적 상호 접근 최근에 소개 된34,,6061 고 다른 조건 하에서 구조적 변화를 설명 하는 미래의 응용 프로그램에 대 한 약속.

단백질 어셈블리의 구조 조사 세포질 과정의 이해에 대 한 특히 중요 되고있다. 따라서, 많은 기술을 개발 하 고 되었습니다 구조 생물학1에 향상. 그러나, 이러한 기술은 때로는 크기, 유연성, 또는 조사를 받고 단백질 복합물의이 그들의 응용 프로그램에 제한 됩니다. 질량 분석 이러한 문제를 해결할 수 있습니다 그리고, 따라서, 구조 생물학2,3,,45에 강력한 도구로 등장. 그러나 질량 분석의 가장 큰 장점은, 복잡 하 고 이질적인 혼합물6에 단백질을 명확 하 게 식별 하는 기능입니다. 이 위해 단백질은 일반적으로 endoproteinases로 소화 하 고 결과 펩 티 드 혼합물은 액체 크로마토그래피에 의해 분리 및 질량 분 서 계에 직접 eluted. 펩 티 드 질량 결정 이후에 고 선구자 이온은 펩 티 드의 추가 조각화에 대 한 선택 됩니다. 단백질 다음 검색 펩 티 드 및 알려진된 데이터베이스에 대해 해당 조각 대 중에 의해 식별 됩니다. 이 절차는 뿐만 아니라 전조 펩 티 드 및 수정7운반 조각 이온의 질량 변화를 일으킬 그들의 포스트 번역 상 수정 단백질/펩 티 드의 id를 허용 한다. 구조 질량 분석에 많은 기술 중 일부는이 원리4,8을 기반으로 합니다. 예를 들어, 수소 중수소 교환9,10등 기법 라벨, 화학 라벨 전략11,12또는 수 산 기 과격 한 발 인쇄13,14 , 특정 조건 하에서 단백질의 표면 접근에 통찰력을 제공.
또 다른 기술은 이다 (화학) 그들의 기능 그룹을 통해 가까운 근접에서 아미노산의 공유 결합을 포함 하는 교차 연결. 이 위해, 화학 시 약, UV 활성화 시 약, 또는 아미노산 고용된15,16이다. Cross-linking, 후 단백질은 프로 테아 제와 분해 일반적으로 하 고 상호 연결 된 디 펩 티 드 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 분석 된다. 그러나 데이터베이스 검색, 상호 상품의 식별은, 전문된 소프트웨어는 다양 한 단백질과 이질적인 지역17,,1819의 펩 티 드 시퀀스를 연결 하 여 사용을 해야 합니다. 화학 cross-linkers 사용 하 여 장점이 그것의 거의 모든 단백질 복합물을 채택 될 수 있다 하 고 호스트 세포의 단백질을 표현 하는 때에 달성 될 수 있는 UV 가능한 아미노산의 결합을 필요로 하지 않습니다. 이와 같이, cross-linking는 다양 한 도구 및 대형 단백질 어셈블리20의 많은 구조 연구에 성공적으로 고용 되었다.
그대로 단백질 복합물 ('기본' 질량 분석), 다른 한편으로의 질량 분석 펩 티 드에 그대로 단백질이 수 분해 없이 단백질 복합물의 분석을 포함 한다. 그것은 구성,이 질, 산출할, 토폴로지 및 소 단위 단백질 단지21,22의 상호 작용을 보여준다. 함께 이온 이동성, 네이티브 질량 분석 추가 그들의 구조23,24의 결정을 허용 한다. 이것은 기존의 구조적 기법으로 평가 하기 어려운 단백질 복합물의 구조상 조사를 위한 강력한 도구. 그러나, 네이티브 질량 분석 분석 버퍼를 분무 이온화 동안 비 공유 단백질 상호 작용을 유지 하는 필요 합니다. 이것은 일반적으로 암모늄 아세테이트25같은 수성, 휘발성 버퍼를 사용 하 여 달성 된다. 또한, 악기 수정 질량 분 서 계26의 가스 단계에 전송 하는 동안 분리를 방지 하기 위해 필요 하다. 이 방법으로 적용, 많은 (큰) 단백질 복합물 분석 되었다. 인상적인 그대로 리보솜27, ATP synthases28또는 바이러스29의 연구는 있습니다.
네이티브 질량 분석 그리고 cross-linking의 조합 이전 연구에서 특히 성공적 이었다. 예를 들어, 예기치 않은 Hsp70 이합체를 포함 한 보호자 단지의 stoichiometries 얻을 수 그대로 단백질 복합물의 질량 분석 실험에서 화학 cross-linking 공개에 단백질의 준비 하는 동안은 어셈블리30,31 다른 연구에서의 복잡 한 그대로 ATP synthase에 포스트 번역 상 수정 결과 공부 했다. 네이티브 질량 분석 인 산화 또는 acetylation32,33의 유무에서 단백질 복잡 한 안정성에 대 한 통찰력을 제공합니다. 비교 상호 전략34 는 다음 다른 조건 하에서 복잡 한 단백질의 구조적 변화를 밝혔다.
여기, 우리가 질량 분석, (화학) cross-linking 및 네이티브 질량 분석, 데이터 분석 및 해석 (그림 1)를 포함 하 여 단백질 식별 프로토콜 제공 합니다. 두 잘 특징이 단백질 복합물의 도움으로이 방법에서 얻은 보완 결과의 조합은 시연된35입니다. 우리의 프로토콜 특정 순도 농도에 순화 될 수 있는 어떤 단백질 어셈블리에 적용할 수 있습니다. 접근은 데이터 분석의 cross-linking 데이터, 즉, 데이터베이스의 크기에 의해 제한 하는 어떤 경우에 고용, 필요한 검색 공간 및 시간을 결정 하. 또한, 확인된 상호 링크의 수동 유효성 검사 자주 필수 이며 출력 줄어듭니다. 네이티브 질량 분석 샘플 품질, 예를 들어, 버퍼에 의해 주로 제한 됩니다 및 adducts 수성 및 휘발성 버퍼에 의해 교환 하 정화 가능성 중에 사용 된. 그러나, 일반적으로 구조 분석을 위해 순화 하는 단백질 복합물은 우리의 프로토콜 성공적인 분석에 필요한 품질을가지고.

<table><tbody><tr><td><강>화학, 시약, 소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>buffer</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>용매</td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrifugal 장치(다른 MWCO)</td><td>Millipore</td><td>, 즉 UFC500396</td><td>완충액 교환, 농도</td></tr><tr><td>아세트산 암모늄 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>네이티브 MS</td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>겔 내 분해</td></tr><tr><td>암모늄 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>가교제</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>가교제</td></tr><tr><td>요오드화 세슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>203033</td><td>보정</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>C5670</td><td>인젤 소화</td></tr><tr><td>모세혈관 (1.0 OD &times; 0.78 ID &times; 100 L mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>네이티브 MS</td></tr><tr><td>디숙시니미딜 수산염(DSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21655</td><td>cross-linker</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>in-gel digestion</td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>용매</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td>용매</td></tr><tr><td>포름산 Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>솔벤트 보충제</td></tr><tr><td>인스턴트 블루 Coomassie 염색 용액</td><td>expedeon</td><td>ISB1L</td><td>염색 용액 겔 전기 영동</td></tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE 4-12 % Bis-Tris 젤 (1mm, 10 well)</td> <td>생명 기술</td><td>NP0323BOX</td><td>젤 전기 영동</td></tr><tr><td>요오도 아세트 아</td>미드 <td>시그마 Aldrich</td><td>I1149</td><td>인 젤 소화</td></tr><tr><td>이소 프로필 알코올, HPLC 등급</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>용매</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 화학 물질</td><td>A456-212</td><td>용매</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6 열</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>버퍼 교환</td></tr><tr><td>NuPAGE 산화 방지</td>제 <td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td>실행 버퍼, 겔 전기 영동</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (4 &times;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>겔 전기영동용 시료 로딩 버퍼(비환원)</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td><td>life technologies</td><td>NP0001</td><td>gel 전기영동</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>life technologies</td><td>NP0001</td><td>gel 전기영</td></tr>동 <tr><td>NuPAGE 시료 환원제 (10 &times;)</td><td>겔 전기영동용</td> <td>인비트로겐</td><td>NP0004</td> 환원제</tr><tr><td>PBS - 인산염 완충 식염수</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4417</td><td>완충제</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 사전 염색 표준 단백질 마커</td><td>겔 전기영동용 인</td><td>비트로젠</td><td>LC5925</td> 사전 염색 단백질 마커</tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S2889</td><td>에탄올 침전</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노 메탄 (트리스)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>252859</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마 알드리치</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td> <td>인 젤 분해</td></tr><tr><td>비바스핀 원심 장치 (다른 MWCO)</td> <td>Sartorius</td><td>즉 VS0101</td><td>버퍼 교환, 농축</td></tr><tr><td>HPLC 용 물</td><td>시그마 알드리치</td><td>270733-2.5L-M</td><td>용매</td></tr> <tr><td>< 강> 이름 < / 강></td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, 벤치탑 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>겔전기영동 챔버 Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold Coater Quorum Q150R S</td><td>Quorum Technologies Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>수평 겔 쉐이커 Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Q-TOF Ultima 질량 분석기, MS Vision 고질량 업그레이드</td><td>Waters(마이크로매스)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>역상 C18 분석 컬럼 Acclaim PepMap(C18, 75mm I.D., 50cm, 3mm 공극 크기)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>역상 C18 프리 컬럼 (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm 공극 크기)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164213</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac SPD121P 진공 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기 USC-TH, 초음파 처리 수조</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate Dionex 3000 나노-LC 시스템, Q-Exactive plus 하이브리드 질량 분석기 (nano-ESI 소스)</td><td>에 결합Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software, Software Tools, Database search</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pXtract 변환 도구</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr op struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

화학 cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

단백질은 다양 한 세포 기능을 수행 하는 형태로 활성 및 동적 어셈블리에 그들의 ligands와 상호 작용. 이러한 상호 작용을 elucidating 따라서 세포질 과정의 이해에 대 한 근본 이다. 그러나, 많은 단백질 복합물 동적 어셈블리 이며 기존의 구조적 기법에 의해 액세스할 수 있습니다. 이러한 어셈블리의 구조 조사에 기여 하는 질량 분석 그리고 특히 다양 한 대량 spectrometric 기술의 조합 그들의 구조 배열에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공 합니다.
이 문서에서는, 우리는 응용 프로그램 및 두 개의 상호 보완적인 대량 spectrometric 기술의 조합 설명, 즉 화학 cross-linking 및 결합 된 질량 분석 기본 질량 분석. 화학 cross-linking 화학 시 약을 사용 하 여 근접에서 아미노산의 공유 결합을 포함 한다. 프로 테아 제, 소화 후 복사해올된 디 펩 티 드 질량 분석에 의해 식별 하 고 단백질 상호 작용 사이트 적용 되지 않습니다. 네이티브 질량 분석은 다른 한편으로 질량 분석기의 가스 단계에서 그대로 단백질 어셈블리의 분석 이다. 그것은 단백질과 리간드 상호 작용으로 단백질 stoichiometries를 보여준다. 두 기술을 따라서 단백질-리간드 어셈블리 및 그들의 조합 이전 연구에서 강력한 입증의 구조에 대 한 보완 정보를 제공 합니다.

단백질 및 그들은 단지의 구조 분석은 그들의 기능을 이해 하기 위한 기본적 이다. 질량 분석에 그것의 크기에 관계 없이 거의 모든 단지에 적용 될 수 또는 샘플 구조 조사에 상당히 기여 합니다. 우리 두 잘 특징이 단백질 복합물;를 사용 하 여 프로토콜을 예증 첫째, C. thermophilum 및 두 번째, 대장균에서 복잡 한 이종 octameric CPS hetero-dodecamer RvB1/B2.
첫째, 우리는 두 단지의 단백질 구성 요소 식별. 이 단백질은 SDS 페이지 (그림 2) 구분 및 젤 밴드는 젤에서 삭감. 젤 소화 단백질의, 후에 펩 티 드 혼합물은 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 분석 하 고 펩 티 드 및 조각 대 중 데이터베이스 검색 대상이 됐다. 이 워크플로 따라 우리는 자신감과 높은, 즉, 두 단지의 모든 단백질 소 단위 식별 합리적인 펩 티 드와 펩 티 드의 높은 수 저조한 모든 단백질 소 단위 (표 1에 대 한 높은 시퀀스 범위 관찰 되었다 ).
우리는 다음 기본 질량 분석 (그림 3A)으로 그대로 RvB1/b 2 복잡 한 분석. 질량 스펙트럼 밝혀 두 종, 약 8000 m/z 에 한 약 11000-12000 m/z에서 또 다른 종. 이 종족에 대 한 계산된 대 중 hexameric (RvB1)3(RvB2)3 링 (약 310 kDa)와 dodecameric 더블 반지 (RvB1)6(RvB2)6 (약 620 kDa)에 해당합니다. 두 피크 시리즈 보기 두 인구; 이 단지에서 그의 태그 및 태그 RvB2 subunits의 혼합물에서 유래. RvB1/B2 복잡 한에 대 한 결정 구조36 얻은 이전 하 고 더블 반지 (그림 3B)의 배치를 보여줍니다. 네이티브 질량 스펙트럼 따라서 그대로 dodecamer의 산출할 확인 하 고 또한 안정적인 하위 복잡 한을 계시 한다. 또한, 공동 기존의 인구 식별 됩니다.
RvB1/b 2의 복잡 한 단백질 상호 작용 사이트를 식별 하려면 우리는 화학적 BS3 cross-linker와 순화 된 복잡 한 십자가. 우리는 먼저 가교 반응 최적 농도 결정 하는 동안 BS3 양의 적정. BS3은 아민 전용 및 covalently 링크 리 사이드 체인으로 단백질의 N termini. 가교 반응 SDS 페이지 (그림 2A)으로 뒤를 이었다. 교차 연결 된 복잡 한 RvB1 및 RvB2 소 단위를 보였다. 높은 분자량에서 단백질 밴드의 결과로 단백질의 공유 결합을 발생 BS3 반응 혼합물에 추가 합니다. SDS 젤 크로스 연결 비 단백질 소 단위는 감소 하는 동안 증가 양의 BS3 복사해올 종의 더 높은 금액을 얻을 보여줍니다. 우리는 다음 젤에서 단백질 밴드를 잘라 고 단백질 상호 작용 사이트를 식별 하려면 위에 제공 된 프로토콜을 따 랐 다. 교차 연결 된 디 펩타이드의 예제 스펙트럼 (그림 3C) 표시 됩니다. 스펙트럼 표시 두 펩 티 드를 확인 하는이 단백질 상호 작용의 y 이온 시리즈 합니다. 전체에서 우리가 얻은 subunits RvB1 및 RvB2 및 RvB2의 두 복사본 간의 두 크로스 링크 사이 4 개의 크로스 링크를 포함 하 여 14 단백질 상호 작용, (표 2). Cross-linking BS3에서 결과 다른 소 단위 사이 상호 작용 분자 내 상호 작용을 보여주는 상호 작용 네트워크 (그림 3D)에서 시각화 됩니다. 내부 분자 상호 링크 RvB1 및 RvB2 소 단위 N와 C 맨끝 도메인 가까이 있는 방식으로 이동 것이 좋습니다. 참고, 그 내부 분자 상호 작용 수 없습니다 구분할 수 같은 소 단위의 간 분자 상호 작용에서이 경우에. 2 개의 소 단위 사이 분자 간의 상호 링크 또한 관찰 되었다. 이들의 RvB1와 RvB2 사이 두 분자 간의 상호 링크 상호 접근의 유효성을 검사 하는 구조에서 구상 될 수 있습니다. 다른 간 분자 상호 링크는 결정 구조에 포함 되지 않은 유연한 루프에 있습니다. 우리는 또한 포함 하는 동일한 펩 티 드 순서 RvB2에 두 상호 링크 확인. 이 크로스 링크 명확 하 게 분류할 수 있습니다으로 간 분자 같은 단백질 (그림 3D)의 두 복사본에서 발생 해야 합니다. 우리의 상호 실험 또한 기존 결정 구조 (그림 3B)에 의해 확인 될 수 있는 그들의 구조 배열에 대 한 통찰력을 제공 하는 단백질 소 단위 내에서 뿐만 아니라 단지 내에 단백질 상호 작용 사이트 공개.
우리가 공부 하는 두 번째 단백질 복잡 한 CPS를 했다. 네이티브 질량 스펙트럼 (그림 4A) 6000 그리고 12000 m/z사이 3 개의 단백질 복합물을 계시 했다. 640 kDa의 가장 큰 복잡 한 그대로 hetero octamer에 해당합니다. 작은 단지 대표 두 하위 복합물; 크고 작은 CPS subunits (160 kDa) 및 각 소 단위 (320 kDa)의 두 복사본을 포함 하는 이종 tetramer 이합체. 이 하위 단지 단백질 어셈블리;에 대 한 첫 번째 통찰력 제공 즉, 크고 작은 소 단위에 직접 접촉 (로 hetero-이합체에 의해 밝혀) 있고는 tetramer 두 이합체의 제품일 수도 있습니다. 복잡 한 그대로 CPS에 구조 배열에 대 한 더 많은 정보를 얻으려면, 우리는 이종 octamer와 이종 tetramer 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 수행. 두 경우, 작은 소 단위 어셈블리 (그림 4B)의 주변에 위치 하 고 전조 제안에서 해리 작은 소 단위. 실제로, 작은 소 단위는 사용 가능한 크리스탈 구조 (그림 4C)44에서 주변.
화학 cross-linking BS3 cross-linker를 사용 하 여 또한 수행 되었다. 금액 증가 사용 하 여 CPS subunits의 공유 결합 향상 되었습니다. 소화 단백질의 펩 티 드 위에서 설명한 대로의 분석 후에, 큰 소 단위와 작은 소 단위에 1 개의 상호 많은 단백질 상호 작용 (표 2)을 획득 했다. 또한, RvB1/B2 복잡 한 마찬가지로 우리가 큰 CPS 소 단위의 2 개의 사본 사이 2 분자 간의 상호 링크 발견. 이 크로스 링크 그들의 C-터미널 측면에서 서로 마주보 고 두 큰 소 단위를 놓습니다. 이전 연구에서 우리는 가장 가능성이 큰 소 단위에 의해 확인의 2 개의 사본의 인터페이스에서 발생 한 큰 소 단위에서 3 개의 추가 상호 작용을 식별 구조 질량 분석 및 전산 모델링35, 결합 크리스탈 구조와 얻은 모델 (그림 4C 와 표 2). 이러한 상호 작용 CPS 코어의 배열은 4 개의 큰 소 단위 구성 된 복잡 한 수 있습니다. 그러나, 작고 큰 소 단위 사이 아무 간 소 단위 상호 링크 관찰 되었다. 사용 가능한 결정 구조 (그림 4C)를 검사 하 여 큰 소 단위와 주변 작은 소 단위 구성 된 복잡 한의 tetrameric 코어 사이 상호 작용 표면은 매우 작은 어떤 설명할 수 있습니다 명백한 된다 간 소 단위 상호 작용의 부재입니다. 이 작은 소 단위 쉽게 가장 작은 바인딩 인터페이스 때문일 그대로 단지에서 dissociates 보여준 기본 질량 분석에 의해 확인 된다. 그럼에도 불구 하 고, CPS 복잡 한 결합 화학 cross-linking를 기본 질량 분석 상호 작용 단백질 그들의 구조 배열 (그림 4D) 추론 수 있습니다.
함께 찍은, 네이티브 질량 분석 및 화학 cross-linking 복사해올된 펩 티 드 대량 spectrometric 식별과 결합의 조합의 두 예 단지의 구조 배열 재구성을 수 있습니다. 화학 cross-linking 공개 단백질 소 단위, 예를 들어 상호 작용 RvB1와 RvB2 사이 또는 CPS의 tetrameric 코어 내에서 배열 하는 동안 네이티브 질량 분석 전달 단백질 stoichiometries 그대로 단지의 고 유행 subcomplexes입니다. CPS는 두 개의 소 단위 사이 아무 상호 분자 상호 작용은 화학 cross-linking에 의해 관찰 될 수 있었다 경우 네이티브 질량 분석 각 큰 소 단위 하나의 작은 소 단위 (그림 4D)와 상호 작용 하 나왔다. 탠덤 질량 분석 복잡 한에 두 소 단위 사이 작은 인터페이스 작은 소 단위의 주변 위치를 제안 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> 그림 1: 기본 질량 분석 및 교차 연결의 워크플로. 두 기술을 보완 결과 제공합니다. 네이티브 질량 분석 보여준다 stoichiometries 및 상호 작용 모듈, 동안 복합물 내의 단백질 상호 작용 사이트에 대 한 통찰력 제공 교차 연결 합니다. Note는 바이너리 상호 작용을 보여 화학 cross-linking만. (A) 네이티브 질량 분석의 첫 번째 단계는 필터 또는 젤 여과 열을 사용 하 여 휘발성과 수성 버퍼를 버퍼 교환. 그대로 단백질 복합물의 질량 분석에는 다음 그들의 산출할을 보여준다. 탠덤 질량 분석 실험에서 주변 소 단위는 해리 했다. (B) 화학 cross-linking에 대 한 복잡 한 단백질 incubated 가교 시 약으로. 교차 결합 된 단백질은 액체 착 색 인쇄기 결합 질량 분석에 의해 연속적으로 분석 하는 펩 티 드로 다음 소화 된다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> 그림 2: SDS-페이지의 RvB1/b 2 (A) 및 CPS (B) 단지 십자가. (A) 2.5 µ M RvB1/B2 젤 레인 당 로드 했다. BS3의 농도 변화 했다. 비 크로스 연결 RvB1/b 2는 약 50 kDa에 두 개의 단백질 소 단위를 보여줍니다. BS3의 추가 단백질 소 단위 단백질 밴드 더 높은 분자량에서 결과의 공유 결합을 발생 합니다. 교차 연결 된 종 양의 높은 BS3 농도 함께 증가 된다. 최적의 상호 조건은 강조 표시 (빨간색)입니다. (B) 10 µ M CPS 젤 레인 당 로드 되었습니다. 대형 (90 kDa)과 소형 (40 kDa) CPS subunits 얻을 수 있습니다. BS3의 추가 단백질 소 단위 단백질 밴드 더 높은 분자량에서 결과의 공유 결합을 발생 합니다. 최적의 상호 조건은 강조 표시 (빨간색)입니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> 그림 3: 기본 질량 분석 및 복잡 한 RvB1/b 2의 cross-linking 화학. (A) 네이티브 질량 스펙트럼 밝혀 두 종의 RvB1/B2; 약 11000 ~ 12, 000 m/z 와 hexameric에 그대로 dodecamer (즉, (RvB1)6(RvB2)6) 반지 (RvB1)3(RvB2)3 약 8000 m/z. 두 종의 그의 태그 및 태그 RvB2에서 유래 하는 두 개의 인구를 보여줍니다. 스펙트럼은35에서 수정 되었습니다. RvB1/b 2의 (B) 결정 구조 (PDB ID 4WVY) 표시 됩니다. RvB1 그리고 RvB2 소 단위 2 hexameric 반지를 형성 한다. (C)는 상호 연결 된 디 펩 티 드의 조각화 스펙트럼. RvB1의 N terminus는 상호 연결 된 RvB1. K23과 y 이온 시리즈 (빨강과 녹청) 두 펩 티 드에 대 한 가져온. (D) 내부 및 남북 protein 상호 작용 RvB1/b 2 단지에서 얻은. Intra 교차 링크 inter-cross-links 파란색에서 표시는 빨간색으로 표시 됩니다. 삽입 결정 구조 (녹색, 삽입)에 구상 될 수 있는 RvB1 및 RvB2 소 단위 사이 두 분자 간의 상호 링크를 보여 줍니다. 두 개의 RvB2 복사본에서 발생 하는 상호 작용은 파란색 점선으로 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> 그림 4: 기본 질량 분석 및 CPS의 cross-linking 화학. (A) CPS 쇼의 네이티브 질량 스펙트럼 3 단지. Hetero-이합체 (160 kDa), 이종 tetramer (320 kDa)와 이종 octamer (640 kDa). 스펙트럼은35에서 수정 되었습니다. (B) 협동 tetrameric 및 octameric CPS 복잡 한 계시 분리의 작은 CPS 소 단위의 질량 분석. CPS의 (C) 결정 구조 (PDB ID 1BXR) 표시 됩니다. 큰 소 단위 tetrameric 코어를 형성 하 고 작은 소 단위 복합물의 주변에 있습니다. 큰 소 단위의 두 복사본 간의 간 분자 상호 링크 (녹색)이 표시 됩니다. 크고 작은 CPS subunits의의 (D) 상호 네이티브 질량 분석 subcomplexes 그리고 작은 소 단위의 주변 위치를 건의 한다. 화학 상호 링크는 CPS의 tetrameric 코어에서 준비를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
표 1: 데이터베이스 검색 결과. 단백질은 액체 착 색 인쇄기 결합 질량 분석 및 데이터베이스 검색에 의해 발견 됐다. 단백질 이름, 가입 수, 설명 뿐만 아니라 단백질 질량 주어진 다. 단백질 점수, 단백질, 당 관찰 된 스펙트럼의 수와 관찰 된 펩 티 드 순서의 수 나열 됩니다. 최고의 마스코트 펩 티 드와 5 개의 펩 티 드 각 단백질 소 단위에 대 한 나열 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
표 2: 상호 링크 RvB1/b 2와 CPS에서 관찰. 단지와 상호 연결 된 잔류물의 소 단위를 받는다. 상호 연결의 유형 (내부-또는 간 분자) 겹치는 펩 티 드 순서 또는35이전 연구 밝혀졌다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.

화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

가교결합과 네이티브 질량분석법을 결합하는 전반적인 목표는 3차원 배열을 밝히는 데 도움이 되는 다중 소단위 단백질 어셈블리에 대한 보완적인 구조 정보를 얻는 것입니다. 화학적 가교 및 네이티브 질량 분석법은 조성, 연결성 및 화학량론과 같은 구조 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 여러 기술을 결합하는 주요 이점은 한 가지 기술만으로는 사용할 수 없는 보완 정보를 얻을 수 있다는 것입니다.당사의 워크플로우는 다른 모든 단백질 복합체에 적용할 수 있습니다. 염 또는 조직에서 정제하거나 정제된 단백질에서 재구성할 수 있습니다. 먼저, 7.5마이크로리터의 4배 단순 완충액과 3마이크로리터의 10배 환원제를 원하는 단백질 복합체에 도포합니다.중력의 16배, 200배에서 1분 동안 샘플을 스핀다운합니다. 원심분리 후 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 가열합니다. 전기영동을 위해 4-12% gradient gel을 준비하고 gel을 전기영동 챔버에 넣습니다.이전에 준비된 러닝 버퍼를 물로 20회 희석하고 전기영동 챔버를 채웁니다. 그런 다음 내부 챔버에 0.5ml의 항산소를 첨가합니다. 겔의 첫 번째 캐비티에 적절한 단백질 마커를 로드하고 단백질 샘플을 나머지 캐비티에 로드합니다.그런 다음 200볼트에서 적절한 시간 동안 단백질을 분리합니다. 단백질 밴드를 염색하려면 겔을 겔 염색 상자에 옮기고 수성 Coomassie 스탠딩 솔루션으로 겔을 덮습니다. 수평 젤 셰이커에서 실온에서 밤새 젤을 배양합니다.다음 날에는 염색 용액을 물로 교체하여 젤의 얼룩을 제거합니다. 젤 배경이 투명해질 때까지 이전 단계를 약 3-5회 반복합니다. 이제 메스를 사용하여 젤에서 파란색 Coomassie 얼룩으로 시각화된 단백질 띠를 자릅니다.단백질 띠를 약 1x1밀리리터의 작은 조각으로 조심스럽게 자릅니다. 그런 다음 물과 아세토니트릴로 단백질 밴드를 씻습니다. DTT로 이황화 결합을 줄인 다음 요오도아세트아미드로 시스테인 잔기를 알킬화합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 트립신으로 단백질을 분해합니다. 펩타이드를 추출하려면 겔 조각을 중탄산암모늄과 아세토니트릴로 배양하고 펩타이드 함유 상등액을 수집합니다. 그런 다음 겔 조각을 5% 포름산과 아세토니트릴로 배양하고 펩타이드 함유 상등액을 수집합니다.펩타이드 함유 상등액을 채취한 후, 두 상층액을 결합하고 추출된 펩타이드를 진공 원심분리기에서 용매를 증발시켜 건조시킵니다. 펩타이드가 건조되면 20마이크로리터의 2%아세토니트릴 및 0.1%포름산 용액과 혼합합니다. 펩타이드를 초음파 처리법으로 2-3분 동안 용해시킵니다.그런 다음 30분 동안 중력의 16배, 200배로 원심분리기에서 샘플을 회전시킵니다. 샘플을 자동 시료 주입기 바이알로 옮긴 후 5마이크로리터를 나노 LC-MS/MS 시스템에 주입하고 펩타이드 혼합물을 역상 C18 프리 컬럼에 로드하여 펩타이드를 온라인으로 탈염 및 농축합니다. 크기 제외 스핀 컬럼에서 1분 동안 중력 1배, 섭씨 4도의 원심분리로 저장 버퍼를 제거합니다.플로우 스루(flow-through)를 버린 후 500마이크로리터의 200밀리몰 암모늄 아세테이트를 첨가한 후 원심분리하여 컬럼을 세 번 세척합니다. 원심분리 후 20마이크로리터의 단백질 샘플을 컬럼에 로드하고 중력의 1,000배와 섭씨 4도에서 4분 동안 원심분리합니다. 이제 미리 준비된 금으로 코팅된 모세관을 모세관 홀더에 넣습니다.바늘 끝을 열고 1-4마이크로리터의 단백질 샘플로 모세관을 채웁니다. 모세관 홀더를 질량 분석기의 나노 전기 분무 소스에 연결하고 모세관 끝을 원뿔 오리피스에 0.5-1.5cm 위치에 놓습니다. 시간당 80-150리터의 나노 흐름 가스를 사용하여 스프레이를 시작하고 가스 흐름을 조정하여 안정적인 스프레이를 유지합니다.Q-TOF 기기의 매개변수와 튜닝 페이지를 조정합니다. 그런 다음 Acquire 버튼을 클릭하여 획득을 시작하고 가능한 한 많은 스캔을 결합하여 좋은 질량 스펙트럼을 얻습니다. 1.43mg의 BS3와 100마이크로리터의 물을 용해시켜 25밀리몰의 원액을 준비합니다.다음으로, 단백질 복합체에 BS3를 첨가합니다. 최적의 cross-linker 농도를 식별하기 위해 다양한 양의 BS3를 사용합니다. 반응 혼합물을 온도 혼합기에서 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다.지금, 4에서 12%gradient 젤을 가진 교차 결합된 단백질의 SDS 페이지를 실행하십시오. 젤 밴드를 자르고 앞서 설명한 대로 젤 내 소화로 단백질을 소화합니다. 겔 내 분해에서 펩타이드를 얻은 후 앞에서 설명한 대로 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석법을 수행합니다.이종동물(heterododecamer) RvB1/B2 및 이종옥타메릭 CPS 복합체(heterooctameric CPS complex)의 모든 단백질 소단위(subunit)가 높은 신뢰도로 확인되었습니다. RvB1/RvB2의 질량 스펙트럼은 헥사메릭 이중고리와 도데카메릭 이중고리에 해당하는 두 종을 보여줍니다. RvB1/B2 복합체의 결정 구조는 이중 링의 배열을 보여줍니다.RvB1/RvB2 복합체에 BS3를 추가하면 단백질의 공유 결합이 발생하여 더 높은 분자량의 단백질 띠가 생성됩니다. 그리고 BS3의 양이 증가하면 더 많은 양의 가교 결합 종이 생성되는 반면 비가교 단백질 소단위는 감소합니다. 가교 결합된 디펩타이드 스펙트럼은 이러한 단백질 상호 작용을 확인하는 두 펩타이드의 Y 이온 시리즈를 보여줍니다.BS3 가교 결합의 결과는 상호 작용 네트워크에서 시각화되어 분자 내 상호 작용뿐만 아니라 서로 다른 소단위 간의 상호 작용을 보여줍니다. CPS의 네이티브 질량 스펙트럼은 헤테로다이머, 헤테로테트라머 및 헤테로옥타머를 보여줍니다. 사지체 및 팔타머 CPS의 탠덤 질량 분석법은 작은 CPS 소단위체의 해리를 보여줍니다.CPS와 BS3 가교제의 화학적 가교는 큰 CPS 소단위체의 두 사본 사이에 여러 분자 내 가교를 보여줍니다. 결정 구조는 테트라 코어 (tetramic core)와 주변의 작은 소단위 (subunit) 사이의 상호 작용 표면이 매우 작다는 것을 보여주며, 이는 소단위 간 상호 작용의 부재를 설명 할 수 있습니다. 일단 마스터하면 제대로 수행되면 작업 흐름을 일주일 동안 완료할 수 있습니다.단백질 어셈블리가 너무 복잡하기 때문에 데이터 분석에 추가 시간이 필요합니다. 이 절차에 따라, 단백질 복합체의 3차원 모델을 얻기 위해 컴퓨터 모델링을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 두 가지 상호 보완적인 기술이 단백질 어셈블리의 구조를 밝히는 데 도움이 될 때까지 화학적 가교 결합 및 네이티브 질량 분석 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

질량 분석계는 큰 단백질 단지를 분석하는 데 유용한 도구로 입증되었습니다. 이 방법은 멀티 - subunit 어셈블리의 구성, stoichiometry 및 전반적인 아키텍처에 대한 통찰력을 수 있습니다. 여기, 우리가 설명하는, 단계 단계의 구조 질량 분광법 분석을 수행하고, macromolecular 구조를 특성화하는 방법.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

이온 이동성 - 질량 분광법는 충돌 단면 및 질량에 따라 이온을 분리 신흥 가스 상 기술입니다. 방법은 단백질 단지의 전체 토폴로지와 모양에 대한 입체적인 정보를 제공합니다. 여기, 우리는 악기 설정 및 최적화, 드리프트 시대의 교정 및 데이터 해석을위한 기본 절차를 설명합니다.

T - 파 이온 모빌리티 분석법 - 질량 : 단백질 복잡한 분석을위한 기본 실험 절차

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

질량 분석 (MS)는 구조 조사와 고분자 어셈블리의 역학에 대 한 중요 한 도구로 떠오르고 있다. 여기, 우리는 단백질 복잡 한 형성과 ligand 바인딩이 MS 기반 접근을 통합 합니다.

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

여기, 우리는 어떻게 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS) 고분자 구조를 나타내는 저해상도 봉투에 대 한 정보를 활용할 수 있습니다 제시. 고해상도 구조 기술 엑스레이 결정학, 핵 자기 공명 등와 함께에서 사용 될 때 SAXS 다중 도메인 단백질 및 고분자 복합물 솔루션에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 고리에 의해 안정화 된 다중 이성질체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해 서 이다. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS 로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다.

비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

질량 분광 검출을 가진 영양 절이로카보네이트 기지를 둔 공유 라벨을 수행하기 위한 실험 절차가 설명됩니다. Diethylpyrocarbonate는 단순히 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 혼합되어 용매접근 가능한 아미노산 잔류물의 변형으로 이어집니다. 상기 변형된 잔류물은 프로테오리스틱 소화 및 액체 크로마토그래피/질량 분석 후 확인할 수 있다.

질량 분광법에 의한 단백질 고차 구조를 연구하기 위한 디틸피로카보네이트와 공유 라벨링

배우세요 화학적 교차결합과 네이티브 질량 분석을 결합하여 다중 소단위 단백질 복합체의 구조를 규명하는 방법을. RvB1/B2 및 CPS 복합체 분석에 적용 가능한 이 기법은 구조 생물학 연구에 필수적인 상보적 정보를 제공합니다.

화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

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