절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

이 절차의 전반적인 목표는 골수 기질 세포(BMSC)를 분리하고 배양하는 것입니다. 이 방법은 전구 세포에 대한 뼈 및 지방 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 BMSC를 비교적 빠르고 반복 가능하며 저렴한 방식으로 분리할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 해부 단계를 텍스트만으로 설명하기 어려울 수 있으므로 유용합니다. 뼈 채취 절차를 시작하기 전에 뼈 3개를 채취할 때마다 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브 1개에 100마이크로리터의 골수 줄기세포 배양 배지를 추가합니다. 그리고 마이크로 원심분리기 튜브당 200마이크로리터 피펫 팁 1개의 끝을 잘라 각 팁이 뚜껑을 닫은 단일 튜브에 맞도록 합니다.

다음으로, 첫 번째 78주 된 안락사 마우스를 앙와위 자세로 해부판에 놓고 동물에 70% 에탄올을 뿌립니다. 집게를 사용하여 복부에 피부 텐트를 만들고 멸균 해부 가위를 사용하여 약 1cm 정도의 피부를 절개합니다. 피부를 벗겨내어 하복부와 다리를 노출시킵니다.

각 엉덩이의 장골능을 따라 절개하여 대퇴골두와 골반을 분리하고, 골반의 정중선을 절개하여 장골골을 분리하고, 발목 관절 아래를 절개하여 발을 제거합니다. 그런 다음 무릎 관절을 잘라 경골과 대퇴골을 분리합니다. 그런 다음 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 대퇴골, 경골 및 장골골에서 근육을 조심스럽게 제거합니다.

모든 뼈가 채취되면 PBS의 샘플을 얼음 위에 놓고 샘플을 멸균 배양 후드로 옮깁니다. 멸균 기술을 사용하여 각 뼈의 근위부 및 원위 끝을 1-2mm 절단한 후 미세 원심분리 튜브의 각 변형된 마이크로 피펫 팁에 세 개의 뼈를 넣습니다. 원심분리를 통해 뼈에서 골수를 채취하여 골수가 스핀이 끝날 때 각 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥으로 완전히 펠릿화되었는지 확인합니다.

골수를 모두 채취하면 뼈가 하얗게 나타납니다. 적절한 생물 안전성 폐기를 위해 수집 튜브에서 마이크로피펫 팁과 뼈를 제거합니다. 골수 세포를 플레이트하려면 먼저 25 게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 펠릿을 천천히 다시 매달아 덩어리를 분해한 다음 샘플을 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다.

시료 500마이크로리터당 골수 줄기세포 배양 배지 10ml를 추가하고 70미크론 필터를 통해 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브에 여과하여 뼈 조각을 제거합니다. 계산 후, 골수 세포를 섭씨 37도 및 5 % CO2에서 72 시간 배양 위해 신선한 배양 배지에서 평방 센티미터 당 6 번째 세포를 1 회 10 배로 파종합니다. 3일째에는 상층액을 새로운 배지로 교체하고 세포가 80%에서 100%농도에 도달할 때까지 이틀마다 배지를 교체합니다.

분할된 골수 세포 집단 배양을 플레이트링하려면 한 마우스에서 수확한 골수 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 신선한 배양 배지로 10cm 세포 배양 접시에 48시간 동안 플레이트링합니다. 배양 2일차에 비부착 조혈모세포가 함유된 상층액을 제거하고 부착성 골수 세포를 방해하지 않고 PBS로 플레이트를 조심스럽게 세척합니다. PBS를 0.25%트립신으로 교체합니다.

섭씨 37도에서 1-3분 후 신선한 세포 배양 배지로 반응을 소멸하고 생성된 세포 현탁액의 세포를 계수합니다. 도금을 위해 적절한 수의 세포를 원심분리하고, 원하는 도금 밀도에 대해 충분한 신선한 배양 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 융합될 때까지 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.

골수 줄기세포 조골세포 분화를 유도하려면 세포가 거시적으로 관찰할 수 있는 광물화의 흰색 결절을 생성하기 시작할 때까지 2일마다 세포 배양 배지를 분화 배지로 교체합니다. 골수 줄기세포 지방세포 분화를 유도하기 위해서는 융합 골수 세포 배양의 세포 배양 배지를 지방 세포 유도 배지로 교체합니다. 배양 2일 후, 상층액을 새로운 지방 세포 유도 배지로 교체하고 4일째에 지방 세포 기본 배지로 전환합니다.

7일째에 세포에 지질 방울이 축적되어 있고 성숙한 지방 세포와 유사한 표현형을 나타내는지 확인합니다. 조혈모세포를 파골세포로 분화시키기 위해, 전체 골수 세포 배양 또는 비부착 세포 배양이 부착될 때 세포 배양 배지를 파골세포 분화 배지로 교체합니다. 배지를 이틀에 한 번씩 교체하고, 파골세포가 융합하여 다핵 세포를 형성할 때까지 10배 배율로 광학 현미경으로 매일 파골세포 분화를 확인합니다(일반적으로 분화 기간 약 5-7일

BMSC의 융합 배양은 아스코르브산과 베타-글리세로포스페이트로 구성된 골형성 배지를 사용하여 파골세포로 분화할 수 있습니다. 며칠간의 분화 후, 조골세포는 알칼리성 인산가수분해효소를 발현하기 시작합니다. 그리고 추가적인 분화는 오스테오이드 매트릭스 생산을 촉발하고 궁극적으로 이 매트릭스의 광물화를 촉발할 것입니다.

흥미롭게도, 세포의 일부만이 체외에서 조골세포로 분화할 것이며, 이는 crystal violet staining에 의해 밝혀졌습니다. 혼합 집단 또는 분할 골수 세포 집단을 사용하든, 세포의 일부만이 지방 세포로 분화하며, 이는 오일 레드 O 염료로 염색될 수 있는 여러 지질 액포가 있는 원형 세포로 나타납니다. 쥐 세포 자극 인자와 RANKL이 보충된 인간 줄기세포 배양은 빠르게 융합되어 TRAP에 대해 양성으로 염색되는 다핵 세포를 형성합니다.

이 파골세포는 체외에서 미네랄 매트릭스를 재흡수할 수 있으며 파골세포 활성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 쥐의 수에 따라 적절하게 수행되면 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가능한 한 빠르고 무균 적으로 작업 할 수 있도록 도구를 멸균하고 미리 미디어를 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 골수 기질 세포를 분리하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.