Name: 절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 학습하세요 생쥐 뼈수 기질 세포(BMSCs) 분리 및 배양 방법을 통해 조골세포, 지방세포, 파골세포로 분화시키는 기술을. 이 시각적 프로토콜은 빠르고 재현 가능하며 비용 효율적인 줄기세포 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회 (R01 AR061164-01A1)에 의해 지원 되었다.

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 메인 의료 센터 연구소에 의해 승인 되었다.
1. 컬렉션 튜브 준비
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스의 최소 필수 매체 α (MEM α)을 보완 하 여 BMSC 문화 미디어를 확인 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에 BMSC 문화 미디어의 100 µ L를 배치 합니다. 3 뼈 보통 단일 튜브 그래서 그에 따라 준비 하나에 적합할 것 이다.</li>
	<li>그들은 원심 분리기 튜브에 들어가도록 충분히 200 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라. 튜브 내부 팁 넣고 뚜껑 얼음에 튜브를 배치 하기 전에 닫을 수 있도록 합니다. 참고: 또는, 0.75 mL microcentrifuge 튜브 끝 잘라 삽입할 수 있습니다 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에.</li>
</ol>2입니다. 쥐에서 뼈의 수확
<ol><li>CO2 뒤에 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 동물을 안락사 하 고 70% 에탄올으로 그들을 살포. 주: 동물 같은 섹스 그리고 가급적 이면 같은 나이에서 사용 하는 확인 하십시오. 우리는 정기적으로 동물 세 7 ~ 8 주를 사용 합니다. 더 나은 대표 및 재현성 세포 인구를 실험 그룹 당 적어도 3 동물에서 세포를 풀링 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>
해 보드에 그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓습니다. 집게를 사용 하 여 복 부에 피부의 텐트를 만들. 살 균 해가 위를 사용 하 여 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 더 낮은 복 부와 다리를 노출 하려면 다시 사지와 컷에서 발 피부 껍질.
	<ol>
<li>잘라 발목 아래 발 제거 공동. hipbone에서 대 퇴 골 머리를 분리 하는 엉덩이에 장 골의 크레스트 따라 자릅니다. 그것의 뒤에 아직도 마우스를 실행 하는 동안 2 개의 장 골 뼈 분리 hipbone 중간 절 개를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>보풀이 물티슈를 사용 하 여 조심 스럽게 화관, tibias, 장 골 뼈에서 근육을 제거. 참고: 절단 힘 줄과 뼈에서 근육의 가능한 게로 보풀 잎사귀 (예, kimwipes)와 함께 쉽고 빠르게 청소. 그들은 쉽게 휴식 하는 경향이 하 고 그들의 취약성 특정 genotypes 증가 될 수 있습니다 뼈를 조작 하는 때 주의 사용 합니다.</li>
	<li>일단 모든 샘플 해 부 되는, 얼음에 PBS에 넣어 고 절연의 나머지 단계에 대 한 살 균 문화 후드로 이동. 참고: aseptically 가능한 작업 문화에 오염에 대 한 가능성을 줄일 것입니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 내에서 sectioned 팁에 그들을 배치 하기 전에 뼈의 인접 하 고 원심 끝에 작은 상처 (약 1 ~ 2 m m)를 확인 합니다. 주: 골 수; centrifuged 수 있도록 충분 한 금액을 확인 그러나, 주의가 피하기 위해 골 수 공간에 근접에 따라 너무 많은 절단 세포 인구 변화 하는 경향이.</li>
	<li>15에 대 한 10000 x g에서 원심 분리기 실 온에서 s. 확인 한 모든 골 수는 플러시 1.5 mL 튜브의 하단에 삽입 (중 200 µ L 피펫으로 팁 또는 0.75 mL microcentrifuge 튜브) 안에 뼈는 일지도. 일단 모든 골 수 수집 컬렉션 튜브에서 뼈와 함께 삽입을 제거 합니다. 참고: 모든 골 수 플러시 뼈 나타납니다 흰색. 그러나, 골 수는 특정 뼈에 남아, 경우 절단 끝을 다시 시도 하 고 원심.</li>
</ol>3. 세포 현 탁 액
<ol><li>25g 바늘, 풀을 사용 하 여 셀 쥐 똥를 위아래로 천천히 대단히 짧은 시간을 휴식과 단일 15 mL 원뿔 튜브로 모든 샘플을 결합. 샘플의 500 µ L 당 BMSC 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>70 µ m 필터 50 mL 원뿔 튜브 위에 놓고 가능한 뼈 조각을 제거 세포 현 탁 액이이 필터를 통해 전달 합니다.</li>
</ol>4. 도금의 골 수 세포 (전체 Bmc)의 혼합된 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
<ol><li>셀의 수를 계산 하 고 x 106 셀/cm2 문화 미디어에서 1.0에서 접시. 연결할 셀에 대 한 혼합 문화의 72 h를 허용 합니다. 참고: 문화 미디어에 세포 현 탁 액 20 배 고 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하기 전에에서 다시 diluting diluting 것이 좋습니다. 7 주 된 남성 C57Bl6/J 쥐에 대 한 우리 정기적으로6 셀 약 50 x 10의 셀 번호를 생성 하지만 나이, 성별, 및 스트레인 수 영향을 셀 수 크게. 참고: 셀의 혼합 인구 연결 해야 문화의 하단에 잘 합니다.</li>
	<li>72 h 후 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어와 함께 그것을 대체 합니다. 계속 변화 하는 미디어 모든 다른 하루 confluency 확인 합니다. 셀 confluency 80-100%에 도달, 그들은 차별화에 대 한 준비가 되었습니다. 참고:이 문화 BMSCs와 HSCs, 혼합 때문에 그것은 사용할 수 있습니다 직접 osteoblastogenesis, 지질으로 osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. 도금의 BMSCs (부착 BMSCs)의 분할 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
<ol><li>10 cm 문화 요리 (55 c m2 의 문화 영역)으로 화관, tibias, 그리고 한 마우스의 장 골 뼈에서 수집 하는 모든 셀 접시 참고: 2-3 C57BL/6J 마우스를 풀링할 때 우리가 일반적으로 접시 150 c m2 플라스 크에서이 '총' 골 인구.</li>
	<li>혼합 문화 48 h 후 (비-부착 HSCs 포함) 문화 미디어를 제거 합니다. Osteoclastogenesis 실험을 수행할 수 있다면, 비 부착 한 세포 제쳐두고 (섹션 7 참조), 하지 않을 경우, aspirate이이 인구를 설정 하 고 이러한 셀을 삭제.</li>
	<li>연결 된 셀을 방해 하지로 신중 하 게 PBS 가진 접시/플라스 크를 씻으십시오.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 추가 0.25 %trypsin 및 세포 현 탁 액을 셀 미디어를 추가 하 여 1-3 분 끄다는 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 리프트. 이 시점에서, BMSCs, 지금 해제, 될 수 있는 (로 이전에 완료 단계 4.1) 미래 실험을 위한 도금.</li>
	<li>도금에 필요한 셀의 수를 계산 합니다. 필요한 양의 세포 현 탁 액 상 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 참고: 셀은 일반적으로 도금 끝점 실험에 따라. 예를 들어 단백질/RNA 격리 되어야 하는 경우 우리가 일반적으로 격판덮개 높은 밀도 (~1.0-2.0 x 106 셀/잘 6 잘 플레이트).</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 도금에 필요한 문화 미디어의 볼륨에서 셀 펠 릿 resuspend. 실험에 따르면 문화 미디어에 셀 접시 하 고 몇 일 동안 연결할 수 있도록. BMSCs confluency에 도달, 수행 차별화를 진행 합니다.</li>
</ol>6입니다. BMSCs의 차별화
<ol><li>
Osteoblasts
	<ol>
<li>게 osteoblast 차별화 미디어 1 M β-글리세롤의 800 µ L을 추가 하 여 인산 염 PBS에 PBS에 의약품 0.5 M의 200 µ L BMSC 문화 미디어의 99 mL (BMSC 문화 미디어의 구성에 대 한 단계 1.1 참조).<ol>
<li>BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 osteoblast 차별화 미디어 문화 미디어를 전환 하 여 그들을 osteoblasts로 차별화.</li>
		</ol>
</li>
		<li>매일 차별화 미디어를 교체 합니다. 셀 강화 작용의 백색 혹 생산 시작. 우물의 바닥에 맨 눈으로 그들을 시각화합니다 이 과정은 3 주 몇 일 이내에 발생할 수 있습니다.<ol>
<li>Osteoblastogenesis 평가, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 또는 폰 Kossa 섹션 8에에서 설명 된 대로 우물에 얼룩을 수행 합니다. 참고: 셀 단층의 파괴를 피하기 위해 약간의 각도에 접시를 기울이기에 의해 신중 하 게 미디어를 변경 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 높은 포도 당, 소 태아 혈 청, 페니실린/스의 1 mL, 100 µ L 20 mM Rosiglitazone 2mm 인슐린의 100 µ L의 10ml의 90 mL을 함께 혼합 하 여 체형 기본 미디어를 확인 합니다. 필요한 경우 차별화 실험 기간 동안 주 4 ° C에이 미디어를 저장 합니다.</li>
		<li>62.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 200 µ L을 추가 하 여 체형 유도 미디어 만들기와 체형 베이스 미디어의 25 ml 1 m m Dexamethasone의 25 µ L.</li>
		<li>BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 체형 유도 미디어를 미디어를 변경 합니다. 차별화의이 오늘을 0를 고려 하십시오.</li>
		<li>48 h 후 미디어를 제거 하 고 체형 유도 미디어 문화를 새로 고칩니다.</li>
		<li>4 일에 체형 기본 미디어로 전환. 참고: 지질 방울 주 2 또는 4 일 일찍 나타나는 것을 시작할 수 있습니다.</li>
		<li>7 일 셀 최대 지질 방울 축적 및 성숙한 체형과 유사한 표현 형을 표시를 준수 합니다. 그것은 세포 죽음/분리를 발생할 수 있습니다이 시점 과거 문화 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7입니다. Osteoclasts에 HSCs의 차별화
<ol><li>Osteoclast 차별화 미디어 25 ml BMSC 문화 미디어의 25 µ g/mL의 수용 체 활성의 NFKB Ligand (RANKL)와 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (mCSF)의 25 µ g/mL의 15 µ L의 50 µ L을 추가 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>일단 총 Bmc (4.3 단계)에서 나는 비 부착 한 세포 (5.2 단계)에서 우물에 연결 된, 문화 미디어 Osteoclast 차별화 미디어를 전환할 수 있습니다. 차별화 미디어 매일 보충.</li>
	<li>Osteoclast 문화에서 10 배 확대 현미경 매일 관찰 합니다. Osteoclasts 퓨즈와 차별화의 5-7 일의 주위에 일반적으로 multinucleated 세포 형성을 관찰 합니다.</li>
</ol>8. 얼룩
<ol><li>
Osteoblasts 참고: 사용 하는 우리는 종종 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 얼룩 얼룩 하는 AP 키트 ( 재료의 표참조) 지침에 따라.<ol>
<li>AP 얼룩 키트 제조 업체의 지침에 따라 수행 합니다.<ol>
<li>미디어를 발음 하 고 PBS로 세포를 씻어. 4% 셀 수정 Paraformaldehyde (PFA) 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에.</li>
			<li>한편, AP 500 µ L을 추가 하 여 키트를 얼룩이 지기에서 시 약을 사용 하 여 AP 솔루션을 만들어 500 µ L FRV 알카라인 솔루션을 부드럽게; 혼합 나트륨 아 질산염 하자 2 분 추가 22.5 mL dH2O와 500 µ L Naphthol AS BI 알칼리 성. 부드럽게 혼합. 주의: PFA 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다.</li>
			<li>일단 셀 고정, PBS로 씻어 고 각 잘 (우물 당 1 ~ 2 mL)을 AP 솔루션을 추가 합니다. 커버 알루미늄 호 일 및 빛에서 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 하자 얼룩. 솔루션을 발음 하 고, 증류수로 씻어 접시 건조를 허용.</li>
		</ol>
</li>
		<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 긍정적인 세포를 관찰 하기 위해 카메라를 사용 하 여 스테인드 식민지의 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 대신 폰 Kossa 수행 합니다. 이 위해, 모든 나머지 PBS로 증류수로 깨끗이 세척 웰 스 실버 질산염. 와 침전 것입니다.
		<ol>
<li>4% 셀 수정 PFA 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에. 그런 다음 충분 한 5% 실버 질산염 솔루션 잘 커버 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 강한 빛에 노출에 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실버 질산염 솔루션을 제거 하 고 증류수로 각 잘 린스. 셀에 5% 나트륨 thiosulfate 솔루션을 추가 하 고 3 분 서 보자.</li>
		<li>나트륨 thiosulfate 발음 하 고 증류수로 씻어. 접시 건조 미네랄 예금에서 맨 눈으로 어두운 갈색/검은색 얼룩이 관찰 하자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>기름 빨간 O (오로) 얼룩이 지기에 대 한 10%를 사용 하 여 셀 수정 중립 버퍼링 말린 실 온에서 1 h.</li>
		<li>한편, 0.035 g 소 프로 파 놀의 10 mL에 용 해 하 여 오로 재고 솔루션을 확인 합니다. 이것은 6 잘 플레이트에 대 한 충분 한입니다. 혼합 하 고 하나의 필터 종이 (기 공 크기 11 µ m)를 사용 하 여 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>6 mL 증류수의과 오로 재고 솔루션의 9 mL를 diluting 하 여 오로 작업 솔루션을 확인 합니다. 사용할 준비까지 로커에 솔루션을 둡니다.</li>
		<li>증류수에 60% 소 프로 파 놀 준비 (각을 커버 하기에 충분 하 게 잘).</li>
		<li>셀 고정, 증류수와 통 및 세척 한 번 제거. 1 분 60% 소 프로 파 놀 솔루션에 물을 바꿉니다. 참고: 추가 팁 접시; 하는 동안 액체도 천천히 adipocytes 매우 쉽게 분리 하십시오.</li>
		<li>소 프로 파 놀을 제거 하 고 모든 세포를 충당 하기 위해 충분 한 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 실 온에서 저속 로커에 15 분 동안 품 어. 오로 제거 하 고 증류수로 두 번 세척. 참고:이 시점에서 오로 얼룩진 지질 방울 수 구상 될 현미경.</li>
		<li>오로 계량, 각 음을 100% 소 프로 파 놀의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 천천히 흔들어는 오로 destain.</li>
		<li>한편, 오로 작업 솔루션을 사용 하 여 다음 8 표준에 따라 표준 곡선을 만드는 희석 시리즈를 준비 (2100 µ g/mL)와 소 프로 파 놀은 희석제로: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75, 및 0 µ g/mL.</li>
		<li>표준과 접시에 triplicates에서 destained 샘플의 200 µ L을 로드 하 고 490에서 흡 광도 읽고 nm.<ol>
<li>표준 곡선에 따라 각 샘플에 대 한 오로의 농도 결정 합니다. 참고: 셀 수 오로 농도 정상화 것이 좋습니다. 휴대폰 번호 크리스탈 바이올렛 얼룩 또는 DNA 양을 측정할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasts 참고: 경우 준비, 좋습니다 osteoclasts 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 트랩 얼룩을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩.<ol>
<li>트랩 얼룩, PBS에 2.5%도 함께 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 수정. 한편, 함께 빠른 가닛 기반 솔루션의 50 µ L, 나트륨 아 질산염, 증류수의 4.55 mL, Napthol AS Biphosphate 아세테이트 솔루션의 200 µ L, 100 µ L 주석산 솔루션의 50 µ L의 50 µ L를 혼합 하 여 트랩 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>정착 액에서 aspirate 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 트랩 솔루션을 추가 하기 전에 두 번 PBS 가진 세포를 씻어</li>
		<li>Osteoclasts 현미경 (10 배 확대) 아래를 계산 하기 전에 증류수로 세척. 트랩+ 셀 3 개 이상의 핵을 보라색 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li>
<li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li>
<li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li>
<li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9(2015).</li>
<li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60(2008).</li>
<li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li>
<li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li>
<li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li>
<li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40(2012).</li>
<li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li>
</ol>

저자 들은 관심사의 재정적인 충돌 공개.

이 문서에서는, BMSCs의 문화의 두 가지 방법은 자신의 장점과 한계 표시 됩니다. 세포는 골 수에서 오는 격리 상대적으로 어려움 없이 과정 이다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포 또는 osteoclastic 창시자의 대표적인 세포 인구를 얻기 때문에 골 수 구멍의 다양 한 세포 환경 전하실 수 있습니다.
골 수 내용의 전체를 경작 vivo에서 microenvironment의 가까운 표현을 제공 합니다. 그러나, 생체 외에서 실험의 처음에 BMSCs 또는 HSCs의 아주 다른 수 귀 착될 수 있다 쥐 (genotypes, 트리 트 먼 트, 나가, 등)의 다른 그룹에서 세포를 분리. 따라서, BMSCs 및 HSCs를 분리 하 고 다시 그들을 도금 차별화 실험의 시작에 휴대폰 번호를 통해 더 나은 제어를 허용 합니다. 그러나, 세포 배양의이 감소 수 있습니다 영향을 BMSCs 또는 HSCs의 결과 둘 다 분 엽 및 osteoclastic...

기본 murine BMSCs1초기 1980 년대 있는 그들의 발견부터 중간 엽 줄기 세포의 생체 외에서 모델으로 일반적으로 사용 됩니다. 긴 뼈의 골 수 구멍에서 플러시 플라스틱 부착 한 세포의 문화 osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, 또는 많은 연구2,3, adipocytes에 분화 될 수 있는 능력을 유지 하는 사실, 4 , 그러나 5., 골 수는 독특한 조직 HSCs, 내 피, 그리고 면역 세포 포함 하 되이 국한 되지 않음, BMSCs, 하지만 많은 다른 세포 인구의 구성. 따라서, 고립과 문화 기술을 다른 동질성과 세포 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 기술을 사용 하 여 셀에서 잠재적인 차별화 테스트 전하실 수 있습니다. 예를 들어 다른 genotypes와 쥐에서 셀을 비교할 때 데이터의 해석을 제한 혼합된 세포 인구로 시작 합니다. 반대로, BMSCs 및 HSCs의 균질 성 인구 기술적으로 어려울 수 있습니다 고로 대표 되지 않을 수 있습니다 ex vivo 모델의.
우리의 실험실에서 우리는 주로 BMSCs osteoblasts, osteoclasts, adipocytes에 분화 될 그들의 잠재력 활용에 관심이. 여기, 우리가 osteoclasts에 차별화를 HSCs의 문화 뿐만 아니라 BMSCs와 HSCs 격리와 문화 osteoblastogenesis 또는 지질에서 생체 외에서평가 하는 데 사용의 기법 제시. 한 가지 방법은 BMSCs 및 HSCs 지질, osteoblastogenesis, 및 osteoclastogenesis (총 Bmc 라고 함)에 대 한 직접 적합 한 골 수 세포 (Bmc)의 혼합된 인구를 사용 합니다. 이 방법은 골 microenvironment의 세포 사이 발견이 성분의 가까이 비보 전 표현입니다. 또 다른 방법은 BMSCs (점착 BMSCs 라는) HSCs의 문화 "순수한" 인구 하려고 비 부착 한 세포에서 점착을 구분 합니다. 이후 방법은 세포 배양 실험의 BMSCs 또는 HSCs의 더 정확한 숫자와 함께 시작 하 고 문화에 남아 있는 다른 세포 인구의 복잡 한 간접 효과의 가능성을 줄일 수 있습니다. 두 방법 모두는 이전 출판 되었고 다른 연구 질문6,7,,89를 해결 하는 데 사용.

<table><tbody><tr><td>200&뮤; L 피펫 팁&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 튜브&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 사이언</td>스 <td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>해부 도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 필터</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 티오 설페이</td>트 <td>시그마 -알드리치</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마 -알드리치</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마 알드리치</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10 % 중성 완충 포르말린</td><td>시그마 -알드리치</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 필터 등급 1</td><td>시그마 알드리치</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>주석산 내성 산 인산 가산 분해 효소 키트</td><td>시그마-알드리치</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>전자</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&알파;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>인비트로젠</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-글리세롤 포스페이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>로시글리타존</td><td>케이맨 화학</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>시그마-알드리치</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마-알드리치</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>페프로텍</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>페프로텍</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer 인버터 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 osteoclast 창시자의 차별화

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

중간 엽 줄기 세포의 표현으로 일상적으로 사용 되는 세포 인구를 구성 하는 골 수 기질 세포 (BMSCs) 생체 외에서. 그들은 캐비티 내에 골 수 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 적혈구, 면역 창시자, 및 osteoclasts 증가 줄 수 있는 함께 상주 합니다. 따라서, 다양 한 세포 인구, 실험 설계 과제를 제시 하 고 데이터 해석을 혼동 수 있는 매우 다른 유형의 혼합에 골 결과에서 세포 인구의 기사. 여러 격리 및 문화 기술 BMSCs 및 HSCs invitro의 더 많거나 적은 균질 인구를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기, 우리가 마우스 긴 뼈에서 BMSCs 및 HSCs의 격리에 대 한 두 가지 방법을 제시: 부착을 기반으로 BMSCs 및 HSCs의 혼합된 인구를 생성 한 방법 및 두 세포 인구를 분리 하는 한 방법. 두 방법 모두 제공 세포 적합 osteogenic 및 adipogenic 분화 실험 뿐만 아니라 기능적 분석 실험.

세포 배양의 개요 두 문화 기술 BMSCs 및 HSCs (총 Bmc, 그림 1A)로 구성 된 Bmc의 혼합된 인구 또는 BMSCs의 인구에 차별화의 평가 HSCs (부착 BMSCs, 그림 1B)에서 분리 수 있습니다. 48 시간 후에 골 수에서 세포 격리 및 도금 (그림 1C), 그들은 신속 하 게 플라스틱 문화 접시의 바닥에 연결 고는 단층을 형성 하는 경향이 있다. 셀 합류 (그림 1D)에 도달, 그들은 감 별 법 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.
BMSCs Osteoblasts로 분화</str...

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

이 절차의 전반적인 목표는 골수 기질 세포(BMSC)를 분리하고 배양하는 것입니다. 이 방법은 전구 세포에 대한 뼈 및 지방 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 BMSC를 비교적 빠르고 반복 가능하며 저렴한 방식으로 분리할 수 있다는 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 해부 단계를 텍스트만으로 설명하기 어려울 수 있으므로 유용합니다. 뼈 채취 절차를 시작하기 전에 뼈 3개를 채취할 때마다 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브 1개에 100마이크로리터의 골수 줄기세포 배양 배지를 추가합니다. 그리고 마이크로 원심분리기 튜브당 200마이크로리터 피펫 팁 1개의 끝을 잘라 각 팁이 뚜껑을 닫은 단일 튜브에 맞도록 합니다.다음으로, 첫 번째 78주 된 안락사 마우스를 앙와위 자세로 해부판에 놓고 동물에 70% 에탄올을 뿌립니다. 집게를 사용하여 복부에 피부 텐트를 만들고 멸균 해부 가위를 사용하여 약 1cm 정도의 피부를 절개합니다. 피부를 벗겨내어 하복부와 다리를 노출시킵니다.각 엉덩이의 장골능을 따라 절개하여 대퇴골두와 골반을 분리하고, 골반의 정중선을 절개하여 장골골을 분리하고, 발목 관절 아래를 절개하여 발을 제거합니다. 그런 다음 무릎 관절을 잘라 경골과 대퇴골을 분리합니다. 그런 다음 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 대퇴골, 경골 및 장골골에서 근육을 조심스럽게 제거합니다.모든 뼈가 채취되면 PBS의 샘플을 얼음 위에 놓고 샘플을 멸균 배양 후드로 옮깁니다. 멸균 기술을 사용하여 각 뼈의 근위부 및 원위 끝을 1-2mm 절단한 후 미세 원심분리 튜브의 각 변형된 마이크로 피펫 팁에 세 개의 뼈를 넣습니다. 원심분리를 통해 뼈에서 골수를 채취하여 골수가 스핀이 끝날 때 각 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥으로 완전히 펠릿화되었는지 확인합니다.골수를 모두 채취하면 뼈가 하얗게 나타납니다. 적절한 생물 안전성 폐기를 위해 수집 튜브에서 마이크로피펫 팁과 뼈를 제거합니다. 골수 세포를 플레이트하려면 먼저 25 게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 펠릿을 천천히 다시 매달아 덩어리를 분해한 다음 샘플을 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다.시료 500마이크로리터당 골수 줄기세포 배양 배지 10ml를 추가하고 70미크론 필터를 통해 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브에 여과하여 뼈 조각을 제거합니다. 계산 후, 골수 세포를 섭씨 37도 및 5 % CO2에서 72 시간 배양 위해 신선한 배양 배지에서 평방 센티미터 당 6 번째 세포를 1 회 10 배로 파종합니다. 3일째에는 상층액을 새로운 배지로 교체하고 세포가 80%에서 100%농도에 도달할 때까지 이틀마다 배지를 교체합니다.분할된 골수 세포 집단 배양을 플레이트링하려면 한 마우스에서 수확한 골수 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 신선한 배양 배지로 10cm 세포 배양 접시에 48시간 동안 플레이트링합니다. 배양 2일차에 비부착 조혈모세포가 함유된 상층액을 제거하고 부착성 골수 세포를 방해하지 않고 PBS로 플레이트를 조심스럽게 세척합니다. PBS를 0.25%트립신으로 교체합니다.섭씨 37도에서 1-3분 후 신선한 세포 배양 배지로 반응을 소멸하고 생성된 세포 현탁액의 세포를 계수합니다. 도금을 위해 적절한 수의 세포를 원심분리하고, 원하는 도금 밀도에 대해 충분한 신선한 배양 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 융합될 때까지 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.골수 줄기세포 조골세포 분화를 유도하려면 세포가 거시적으로 관찰할 수 있는 광물화의 흰색 결절을 생성하기 시작할 때까지 2일마다 세포 배양 배지를 분화 배지로 교체합니다. 골수 줄기세포 지방세포 분화를 유도하기 위해서는 융합 골수 세포 배양의 세포 배양 배지를 지방 세포 유도 배지로 교체합니다. 배양 2일 후, 상층액을 새로운 지방 세포 유도 배지로 교체하고 4일째에 지방 세포 기본 배지로 전환합니다.7일째에 세포에 지질 방울이 축적되어 있고 성숙한 지방 세포와 유사한 표현형을 나타내는지 확인합니다. 조혈모세포를 파골세포로 분화시키기 위해, 전체 골수 세포 배양 또는 비부착 세포 배양이 부착될 때 세포 배양 배지를 파골세포 분화 배지로 교체합니다. 배지를 이틀에 한 번씩 교체하고, 파골세포가 융합하여 다핵 세포를 형성할 때까지 10배 배율로 광학 현미경으로 매일 파골세포 분화를 확인합니다(일반적으로 분화 기간 약 5-7일).BMSC의 융합 배양은 아스코르브산과 베타-글리세로포스페이트로 구성된 골형성 배지를 사용하여 파골세포로 분화할 수 있습니다. 며칠간의 분화 후, 조골세포는 알칼리성 인산가수분해효소를 발현하기 시작합니다. 그리고 추가적인 분화는 오스테오이드 매트릭스 생산을 촉발하고 궁극적으로 이 매트릭스의 광물화를 촉발할 것입니다.흥미롭게도, 세포의 일부만이 체외에서 조골세포로 분화할 것이며, 이는 crystal violet staining에 의해 밝혀졌습니다. 혼합 집단 또는 분할 골수 세포 집단을 사용하든, 세포의 일부만이 지방 세포로 분화하며, 이는 오일 레드 O 염료로 염색될 수 있는 여러 지질 액포가 있는 원형 세포로 나타납니다. 쥐 세포 자극 인자와 RANKL이 보충된 인간 줄기세포 배양은 빠르게 융합되어 TRAP에 대해 양성으로 염색되는 다핵 세포를 형성합니다.이 파골세포는 체외에서 미네랄 매트릭스를 재흡수할 수 있으며 파골세포 활성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 쥐의 수에 따라 적절하게 수행되면 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가능한 한 빠르고 무균 적으로 작업 할 수 있도록 도구를 멸균하고 미리 미디어를 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 동영상을 시청한 후에는 골수 기질 세포를 분리하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

이 비디오에서는 생쥐의 긴 뼈에서 골수 기질 세포의 분리 및 배양을 보여줍니다. 분리된 부착 BMSC는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

노치 신호는 세포 간의 직접 접촉에 의존하는 셀룰러 통신의 한 형태입니다. 체외에서 Notch 신호를 적절하게 유도하려면 Notch 리간드를 고정된 상태의 세포에 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 마우스 파골세포 전구체에서 Notch 신호의 체외 자극 방법을 설명합니다.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

학습하세요 생쥐 뼈수 기질 세포(BMSCs) 분리 및 배양 방법을 통해 조골세포, 지방세포, 파골세포로 분화시키는 기술을. 이 시각적 프로토콜은 빠르고 재현 가능하며 비용 효율적인 줄기세포 연구에 필수적입니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

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