AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

이 방법은 정제된 AV vac 역가와 정제되지 않은 AV vac 역가를 모두 측정할 수 있으며 AAV AAP가 동족 및 이종 AV 혈청형 캡시스의 조립을 촉진하는 능력을 평가할 수 있습니다. 이 기법의 주요 장점은 다른 AAV 적정 방법의 단점을 피할 수 있는 간단하고 저렴한 방법이라는 것입니다. 이 방법은 AAV 벡터 정량화에 일반적으로 사용되어 왔지만, 이 프로토콜에서 볼 수 있듯이 AAV 생물학에 대한 다양한 근본적인 질문을 해결하는 데에도 적용할 수 있습니다.

0일차에 HEK 293 세포를 90% 농도로 배양한 후 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 칼슘 또는 마그네슘이 없는 96마이크로리터의 PBS에 있는 플라스미드를 혼합하여 트랜스펙션 시약을 준비합니다. 이 표에서 알 수 있듯이 DNA의 총량은 웰당 2마이크로그램입니다. PBS 플라스미드 DNA 혼합물에 4마이크로리터의 PEI 용액을 첨가합니다.

최종 부피는 약 100 마이크로 리터 또는 배양 배지의 5 % 부피입니다. 튜브를 잠시 소용돌이치고 DNA PEI 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 마이크로 원심 분리기에서 튜브를 잠시 회전시켜 액체를 바닥으로 모읍니다.

그리고 DNA PEI 혼합물을 HEK 293 배양 플레이트의 각 웰에 있는 배양 배지에 적가합니다. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 교반하고 5%CO2가 함유된 섭씨 37도의 인큐베이터로 되돌립니다. HEK 293 세포의 transfection은 고역가 바이러스 생산을 위한 이 프로토콜의 중요한 구성 요소입니다.

건강하고 계대가 낮은 세포를 사용해야 하며 세포의 단층을 파괴하지 않도록 주의해야 합니다. 1일차와 2일차에는 도립 형광 현미경으로 PCMVGFP 플라스미드로 transfection된 세포를 관찰하여 transfection 효율을 평가합니다. 5일째에는 세포와 바이러스 함유 배지를 피펫으로 위아래로 또는 세포 스크레이퍼를 사용하여 모든 세포를 긁어냅니다.

그런 다음 서스펜션을 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브로 옮깁니다. 샘플을 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 바이러스 입자를 회수하려면 섭씨 37도의 수조에서 얼어붙은 튜브를 빠르게 해동하십시오.

그런 다음 세포에서 AAV의 회수를 최대화하기 위해 1분 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이칩니다. 세포 파편을 3, 700배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 그런 다음 각 튜브에서 200마이크로리터의 상등액을 도트 블롯 분석을 위한 나사 캡이 있는 라벨이 부착된 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

샘플을 Serratia marcescens endonuclease로 처리하려면 mix A 및 mix B 시약을 준비합니다. 각 시료 튜브에 각 시약 10마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 5초 동안 소용돌이치고 짧게 회전시켜 액체를 튜브 바닥으로 모읍니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 샘플을 잠시 회전시킨 후 mix C 시약을 준비하고 각 튜브에 180마이크로리터를 추가하여 proteinase K 처리를 수행합니다. 그런 다음 튜브를 소용돌이치고 잠시 다시 회전시킨 후 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다.

샘플이 실온으로 돌아오면 200마이크로리터의 페놀-클로로포름을 넣고 1분 동안 튜브를 소용돌이칩니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기에서 16, 100배 G와 실온에서 최소 5분 동안 샘플을 회전시킵니다. 320마이크로리터의 수성층 또는 수성 유체 부피의 80%를 새로운 표준 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다.

이 전달 단계는 AAV 정량 분석의 정확도를 유지하기 위해 샘플에서 동일한 부피를 취해야 하기 때문에 매우 중요합니다. 수성층을 제거하는 동안 유기상을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다. mix D 시약을 준비하고 각 샘플 튜브에 833마이크로리터를 추가합니다.

튜브를 소용돌이친 후 섭씨 영하 80도에서 최소 20분 동안 배양합니다. 원심분리 후 상층액을 붓고 깨끗한 종이 타월로 튜브를 한 번 닦아냅니다. 약 500마이크로리터의 70% 에탄올을 각 튜브에 피펫팅하고 5초 동안 튜브를 와류로 회전시킵니다.

샘플을 다시 회전시킨 후 상층액을 붓고 깨끗한 종이 타월로 튜브를 한 번 닦아냅니다. 그런 다음 펠릿을 섭씨 65도에서 건조시킨 후 TE 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 도트 블롯 분석을 수행하려면 AAV 벡터화된 게놈 플라스미드 DNA를 물 또는 Tris-HCL 완충액에서 마이크로리터당 10나노그램으로 희석하여 플라스미드 DNA 표준물질을 준비합니다.

희석된 플라스미드 DNA의 25 μL 분취액을 새 튜브로 옮기고 50 μL 반응 부피에서 적절한 제한 효소로 1시간 동안 선형화합니다. 450마이크로리터의 물 또는 TE를 분해된 플라스미드 DNA 표준물질이 들어 있는 튜브에 넣고 완전히 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물 70마이크로리터를 1, 330마이크로리터의 물 또는 TE가 있는 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 희석된 플라스미드 표준물질을 만듭니다.

도트 블롯 장치를 설정하려면 가위를 사용하여 블로팅 멤브레인을 샘플 수와 표준물질에 적합한 크기로 자릅니다. 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓기 전에 멤브레인을 물에 10분 동안 담그십시오. 그런 다음 사용하지 않는 우물을 덮습니다.

샘플이 적재될 우물에 물을 추가합니다. 진공 청소기를 적용하고 우물을 통해 물을 끌어당기고 오류가 있는지 확인한 다음 나사를 다시 조입니다. 필요한 경우 다시 테스트하십시오.

웰에 400마이크로리터의 희석된 플라스미드 DNA 표준물질을 적용하고 4개의 표준 희석액을 실행합니다. 표준 다이제스트의 두 개의 개별 부분 표본을 사용하고 각각을 복제하여 로드합니다. 그런 다음 각 바이러스 DNA 샘플의 웰당 200마이크로리터를 적용합니다.

부드러운 진공 청소기를 적용하여 웰을 통해 DNA 용액을 끌어당깁니다. 그런 다음 모든 우물이 비워지면 3방향 밸브를 조정하여 진공을 해제합니다. 각 웰에 400마이크로리터의 X 알칼리 용액을 추가합니다.

그런 다음 우물을 비우기 위해 진공 청소기를 다시 적용하기 전에 5분 동안 기다립니다. 진공 청소기를 다시 적용하고 도트 블롯 장치를 분해합니다. 그런 다음 멤브레인을 제거하고 두 개의 X SSC로 헹굽니다.

깨끗한 종이 타월 위에 멤브레인을 올려 DNA 결합 면이 위를 향하도록 하여 여분의 완충액을 제거합니다. 적절한 UV 가교제를 사용하여 블로트된 DNA를 멤브레인에 UV 가교합니다. 이제 멤브레인이 혼성화할 준비가 되었습니다.

DNA가 결합된 면이 위로 향하게 하여 혼성화 병에 멤브레인을 넣습니다. 5-10 ml의 예열된 혼성화 완충액으로 멤브레인을 헹구고 완충액을 폐기합니다. 그런 다음 10ml의 사전 예열 된 혼성화 완충액을 추가하고 병을 섭씨 65도로 설정된 회전 혼성화 오븐에 넣습니다.

병을 최소 5분 동안 회전시킵니다. 변성된 정자 DNA와 방사성 프로브를 병의 혼성화 완충액에 빠르게 넣고 10초 동안 흔들어 혼합합니다. 병을 섭씨 65도의 오븐에 다시 넣고 섭씨 65도에서 최소 4시간 동안 회전하면서 배양합니다.

하이브리드화가 완료되면 회전을 중지합니다. 혼성화 병을 제거한 다음 방사성 프로브 용액을 누출 방지 플러그 밀봉 캡이 있는 50ml 원추형 튜브에 붓습니다. 멤브레인을 세척하려면 20-30 마이크로 리터의 예열 세척 버퍼를 혼성화 병에 추가하고 5 분 동안 회전시킵니다.

이 세척을 두 번 더 반복합니다. 세 번째 세척 후 혼성화 병에서 멤브레인을 제거하고 종이 타월로 멤브레인에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 멤브레인을 투명한 플라스틱 종이 홀더에 넣습니다.

가이거 계수기를 사용하여 멤브레인의 방사성 신호를 확인합니다. 지워진 형광체 이미징 스크린을 멤브레인에 노출시킨 후, 형광체 이미징 스캐닝 시스템을 사용하여 스크린을 스캔하고 각 점의 신호 강도에 대한 데이터를 얻습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행합니다.

AAV 2G9 벡터 적정을 위한 이 정량적 도트 블롯에는 두 세트의 표준물질과 0.3, 0.1 및 0.03 마이크로리터의 중복을 포함한 세 가지 양의 AAV 벡터 제제가 있습니다. 블롯에서 분석해야 할 양은 경험적으로 또는 예비 분석을 기반으로 결정됩니다. 보간법을 통해 AAV 2G9 벡터의 0.3, 0.1 및 0.03 마이크로리터 분취량은 평균 5.16, 0.27 나노그램 등가 마이크로리터의 역가를 갖는 것으로 확인되었습니다.

AAV5, AAV9 및 뱀 AAV의 VP3 cas-pid 및 AAP 단백질의 가능한 모든 동족 및 이종 혈청형 조합은 정량적 점 블롯 분석에 의해 캡시드 조립에 대해 평가되었습니다. 이 그래프의 결과는 AAP가 trans에서 제공되었는지 여부에 관계없이 AAV5 VP3가 어셈블됨을 보여줍니다. 또한 AAP5 및 AAP9는 AAP9 VP3 캡시드 어셈블리를 승격할 수 있지만 AAP5는 AAP9보다 덜 효과적으로 작동합니다.

AAP5와 AAP9 모두 뱀 AAV VP3에 대한 활동을 촉진하는 어셈블리를 나타내지 않으며, 뱀 AAP는 뱀 AAV VP3의 조립만 촉진합니다. 세포 및 배양 배지 유래 불순물을 포함하는 최적화되지 않은 조건에서 상업적으로 이용 가능한 3개의 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성을 평가하기 위해 점 블롯 분석이 적용되었습니다. 효소 A는 다른 두 효소만큼 활동적이지 않은 것으로 밝혀졌으며, 이는 뉴클레아제의 선택이 점 블롯 분석의 판독에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다.

이 기법은 AAV 벡터 정량화에 간단하며 동족 및 이종 혈청형에서 유래한 AAV capsid의 조립을 촉진하는 AAP의 역할을 평가하는 데 유용합니다. 이 기술은 일단 숙달되면 세포 배양 실험에서 분석 샘플을 얻은 후 적절하게 수행하면 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정량적 정확성을 보장하기 위해 올바른 액체량을 조심스럽게 피펫팅하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후, AAP 연구에 정량적 점 블롯 분석법을 적용함으로써 AAV 생물학 분야의 연구자들이 AAV 캡시드 어셈블리의 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있는 길을 열었습니다. 인간 세포, 바이러스 제제, 페놀 클로로포름 및 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 그리고 노출을 제한하기 위해 실험복, 장갑 및 고글을 사용해야 합니다.

이러한 물질은 승인된 지역에서만 취급해야 합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 AAV 정량 분석을 위한 도트 블롯 시료를 준비하고, 도트 블롯 장치를 설정하고, AAV 역가를 측정하고, AAV 생물학 연구에 절차를 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 배양 세포에서 AAV 벡터 형질 도입 분석과 같은 다른 분석을 수행하여 점 블롯 분석에 의해 결정된 물리적 입자 역가와 비교하여 벡터화된 기능적 역가와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.