Name: AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 배우세요 점오점 분석법을 이용한 AAV 적정 측정 및 어셈블리 활성화 단백질(AAP)의 캡시드 조립 촉진 역할 평가 방법을. 이 기술은 유전자 치료 연구에 필수적인 바이러스학 실험 기법입니다.

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아오 아오 채 플 힐에서 북캐롤라이나의 대학에는 pEMBL-CMV-GFP 플라스 미드와 함께 우리를 제공 하는 감사 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 크리스토퍼 쳉과 사무엘 제이 황 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 공중 보건 서비스 부여 (NIH R01 NS088399 T32 EY232113).

<ol><li>Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+assembly+factor+promotes+AAV2+capsid+formation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).</li>
<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
<li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li>
<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+Virus+%28AAV%29+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4%2C+5%2C+and+11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li>
<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Fagone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+errors+in+quantitative+polymerase+chain+reaction+titration+of+self-complementary+adeno-associated+viral+vectors+and+improved+alternative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).</li>
<li>Farkas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parvovirus+isolated+from+royal+python+%28Python+regius%29+is+a+member+of+the+genus+Dependovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).</li>
<li>NEB, <a target="_blank" href="http://www.neb-online.de/neuerkatalog/">2017-2018 Catalog & Technical Reference</a>. , New England Biolabs. 302-368 (2017).</li>
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<li>Burton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+factor+VIII+heavy+and+light+chain+adeno-associated+viral+vectors+produces+biologically+active+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).</li>
<li>Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+for+short+hairpin+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression.</a> Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).</li>
<li>Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+preparation+of+adeno-associated+viral+vectors+by+using+high+hydrostatic+pressure+to+selectively+inactivate+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus.</a> Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 보고서에서 AAPs AAV capsid 어셈블리에서 그들의 역할을 공부 하 고 양적 점 오 점 분석 실험의 유틸리티를 설명 합니다. 이러한 연구에서 얻은 지식을 AAV capsid 어셈블리 과정에서 타고 난 차이 다른 serotypes 사이 AAPs의 기능적인 역할에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 점에서 AAV VP3 AAP 상호 보완성 점 얼룩 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 그것의 동족 AAP의 공동 식에 엄격한 종속성 표시 그리고 뱀 AAP의 분리 serotypes capsid 어셈블리를 홍보 하지 않습니다 분석 결과 . 이 관측은 흥미로운 AAP 종속 AAV serotypes에 있기 때문에 이전 조사 되었다 (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 12)는 모두 분리 압6을 이용 하 여 어느 정도 이상 어셈블리를 처리할 수.
양적 점 또는 슬롯 오 점 교 잡의 편리한 방식으로<sup cla...

Adeno 관련 바이러스 (AAV) 작은, 비 싸여, 단일 가닥 DNA 바이러스 게놈의 약 4.7 kilobases (kb)입니다. AAV 게놈 오픈-독서 프레임 (ORFs) 담당자 와 모자 유전자에 대 한 포함 되어 있습니다. 2010 년 이전 미확인된 nonstructural 단백질 AAV2 모자 유전자 내에서 + 1 프레임 이동 ORF 의해 월요일 외 에 의해 발견 되었고 발견 바이러스에 AAV2 capsid 부사장 단위체 단백질의 조립에 중요 한 역할을 capsid1. 이 비 발한 단백질은 capsid 어셈블리1을 추진에서 역할 그것 후 어셈블리 활성화 단백질 (AAP) 선정 되었습니다.
ORFs AAP에 대 한 모든 parvoviruses 속 Dependoparvovirus, 내만 내 parvovirus 가족1,2의 다른 속의 바이러스의 게놈의 유전자 확인 된 bioinformatically 되었습니다. 이 비 발한 단백질의 기능 연구는 AAP AAV2 프로토 타입에서 (AAP2), AAP2의 필수적인 역할에 완전히 그들의 축적과 형성에 대 한 핵소체 unassembled 부사장 단백질을 대상으로 설립에 초점을 처음 했다 조립 capsids1,,34. 압 식의 부재에 조립 하는 AAV2 capsids의 무 능력은 독립적으로 되어1,2,,34,5 우리를 포함 한 여러 그룹에 의해 확인 . AAV serotypes 1, 8, 및 9에 대 한 후속 연구 capsid 어셈블리, AAV1, 8의 VP3 단위체 단백질에에서 AAPs의 중요 한 역할을 뒷받침 9 AAP2의 공동 식의 부재에서 완벽 하 게 조립된 capsid를 형성 하지 못했습니다.
최근, 양적 점의 사용을 포함 하는 접근 방법을 통해 분석 실험을 오 점, 우리 조사 수 AAV1의 12 VP3 단위체에서 VP3 단위체의 홍보 12 capsids 압 식의 부재와 AAP1의 능력으로 조립 분리 serotypes입니다. 이 연구는 밝혔다 그 AAV4, 5, 및 11 VP3 단위체 AAP 없이 어셈블할 수 있습니다. 또한, 그것은 8 12 AAP serotypes 우리가 검사에서 발견 되었다 (즉, 모든 AAP4, 하지만 5, 11 및 12) AAP4, 5, 11 및 12에 표시 하는 동안 분리 AAV serotype capsids capsid 집합을 지원 하기 위해 광범위 한 능력을 표시는 실질적으로 이 관계6제한 된 능력입니다. 이 4 개의 serotypes phylogenetically 먼 다른 AAP serotypes2,3에서 있습니다. 또한, 연구는 다른 AAPs6의 subcellular 지 방화에서 중요 한이 발견 했다. 또한, 연구는 조립된 capsids과 핵소체, AAV2 capsid 어셈블리의 특징 AAP의 단단한 협회 AAV5를 포함 하 여 다른 serotypes에 반드시 확장할 수 없습니다 제안 했다 8, 및 9의 nucleolar 제외 표시 조립된 capsids6. 따라서, 어떤 특정 serotype AAP의 연구 로부터 얻은 정보는 모든 AAP 생물학에 광범위 하 게 적용 되지 않습니다. 압 하 고 생물학의 수수께끼 같은 자연 밑줄 정규 및 비정규 AAV serotypes에서 각 AAP의 기능과 역할을 조사 하는 필요.
Capsid 어셈블리에서 AAP의 생물학 역할 완전 포장 AAV 바이러스 성 입자 titers에서에서 생산 인간 미 발달 신장 (HEK) 293 세포, AAV 벡터 생산, 또는 AAP 단백질 없이 가장 일반적으로 사용 되 셀 라인을 확인 하 여 평가 될 수 있다 식입니다. AAV 정량의 표준 방법으로는 정량적 PCR (정량)-근거한 분석 실험7,8 및 양적 점 오 점 기반 분석 실험9. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과10,11 등 광학 밀도 측정12 AAV 바이러스 성 입자 정량에 대 한 다른 방법 많은 다른 AAV serotypes에서 파생 된 시료에 적합 하지 않습니다. 불순물 (원유 lysates 또는 문화 미디어), AAV 연구에 사용 되는 예제는으로 오염. 현재, 정량은 가장 널리 사용 되 AAV 정량; 그러나, 그것은 잠재적인 주의 정량 기반 분석 결과, 분석 결과로 체계적 오류 및 중요 한 titer 유사13,14귀 착될 수 있다 인정 하는 데 필요한. PCR 기반 분석 실험은 잠재적으로 혼동 요인, 증폭13을 억제 하는 PCR 서식 파일에서 covalently 닫힌된 터미널 헤어핀의 존재 등의 숫자에 의해 영향을 받습니다. 심지어 경험이 개인 잠재력을 소개 수 정량 기반으로 혼동 요인 시험13의 무의식적으로. 반면, 양적 점 오 점 분석은 게놈 증폭을 포함 하지 않는 매우 간단한 원리를 사용 하 여 정량 기반 분석 실험에 비해 오류의 위험을 최소화 하는 고전 분자 생물학 기술. 방법은 덜 기술적으로 도전; 따라서, 시험 결과 미숙한 개인에 의해 합리적으로 재현.
이 보고서에서 우리는 양적 점 오 점 분석 결과 우리가 일상적으로 AAV 벡터 정량에 대 한 사용 하 고 어떻게 공통 AAPs의 어셈블리 홍보 역할 연구 분석 결과 적용 하려면 serotypes (AAV5 및 AAV9) 및의 예를 제공의 방법론 세부 설명 뱀 AAV14에서 이전 새롭거나 AAP 자연, AAV 부사장 단백질 및 AAP 단백질 단일 유전자 (즉, 부사장-AAP cis-보완성), 동안 여기서 설명 하는 분석 결과에서에서 cis에서 표현 됩니다, 그리고 부사장 및 AAP 단백질 (즉, 부사장-압 하 고 두 개의 별도 플라스 미드에서 트랜스에서 공급 된다 트랜스-보완성)입니다. 이후 다른 serotypes에서 각 부사장 또는 AAP 단백질 각 독립적인 플라스 미드에서 표현 될 수 있다, 그것은 capsid 어셈블리 (즉, 부사장-AAP 크로스-보완성) 분리 부사장 AAP 조합을 테스트할 수 된다. 간단히, 다양 한 serotypes에서 AAV VP3 HEK 293 세포 존재 또는 부재의 동족 serotype AAP, 또는 분리 serotype AAP의 존재는 AAV 벡터 게놈을 포장 하는 플라스 미드 DNA transfection에 의해 표현 된다. 생산, 다음 문화 미디어와 세포 lysates capsid 셸 내 바이러스 성 게놈을 계량 점 오 점 분석 결과를 받게 됩니다. 점 오 점 분석 결과의 첫 번째 단계 샘플 샘플에 오염 플라스 미드 DNAs 및 비포장된 AAV 게놈을 제거 하는 nuclease 치료 하는 것입니다. 이렇게 하지 않으면 것 증가 배경 신호 특히 unpurified 샘플 분석. 이것 다음 바이러스 성 capsids 휴식과 샘플 솔루션으로 nuclease 내성 바이러스 성 게놈을 풀어 효소 처리에 의해 선행 된다. 다음, 바이러스 성 게놈 변성, 막에 얼룩이 고 정량에 대 한 바이러스 성 게놈 관련 DNA 프로브 때 교배. 여기 보고 예제 분석 결과 보여 줍니다 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 뱀 AAP를 요구 하 고 뱀 압 달리의 홍보 또한 수 AAP 종속 serotypes에서 파생 된 AAPs의 많은 AAV9 capsids 어셈블리를 홍보 하지 않습니다. 분리 serotype capsids입니다. 마지막으로, 우리 정량 하는 중요 한 경고를 보고 또는 점 오 점 기반 AAV 정량 분석 실험 nuclease의 크게 시험 결과 영향을.

<table><tbody><tr><td>벤조나제</td><td>밀리포어시그마</td><td>1016970001</td><td>본문에서 Serratia marcescen endonuclease로 언급됩니다.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>본문에서 DNase I Enzyme A로 지칭된다.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>본문에서 DNase I Enzyme B라고 합니다.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>본문에서는 DNase I Enzyme C라고 합니다.</td></tr><tr><td>1.5mL 부착 O-링 나사 캡 미세 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15mL 폴리프로필렌 원추형 튜브</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3m 아세트산나트륨</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>50mL 폴리프로필렌 원추형 튜브</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>AAV-293 세포</td><td>애질런</td>트 <td>240073</td><td>HEK-293 세포주는 AAV 비리온의 패키징에 최적화되어 있습니다.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0.5 M EDTA 용액</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE 버퍼</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>MilliporeSigma 372978</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 추출기 키트</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>이것은 정제된 바이러스의 정량적 점 얼룩에 사용됩니다. 당사는 제조업체가 제공한 설명서에서 Protocol Scheme 2에 대해 권장되는 각 단계에서 모든 시약의 절반 부피만 사용합니다.</td></tr><tr><td>둘베코' s DMEM(Modified Eagle Medium)-고포도당(4.5g/L)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B</td><td>Cells Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>폴리수크로스 400이라고 합니다.</td></tr>형<tr><td>광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Herring Sperm DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>혼성관</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>미니 퀵 스핀 DNA 컬럼</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vector</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>인광 노출 카세트</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>인광 이미징 스크린</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 맥시 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 PFX DNA 중합효소</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II 랜덤 프라이머 라벨링 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 AAP Forward (N25 AAP ORF의 4번째 뉴클레오타이드, RE1은 클로닝을 위한 제한 효소 부위임): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Reverse (N25는 AAP ORF의 마지막 25개 뉴클레오티드이며, RE2는 클로닝을 위한 제한 효소 부위입니다): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>커스텀 프라이머</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Forward (N25 VP3 ORF의 처음 25개 뉴클레오티드, RE1은 클로닝을 위한 제한 효소 부위임): CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer Primer</td><td></td></tr><tr><td>VP3 Reverse (N25는 AAP ORF의 마지막 25개 뉴클레오티드입니다. RE2는 클로닝을 위한 제한 효소 부위입니다): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Restriction Enzymes</td><td>New England Biolabs</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipettes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 이수화물</td><td>MilliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Culture Treated 6-well Plate</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Optimal Crosslink 모드를 사용하여 120mJ/cm2</sup의 UV 에너지 용량을 제공합니다.>.</td></tr><tr><td>Zeta-Probe 멤브레인</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

aav 적정 및 adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Adeno 관련 바이러스 (AAV)은 유전자 치료를 위한 매력적인 벡터로 널리 허용 된다, 그러나 그것은 또한 바이러스 생물학을 이해 하기 위한 모델 바이러스 역할. 후자의 점에서 어셈블리 활성화 단백질 (AAP), 불리는 비 구조 AAV 단백질의 최근 발견은 capsid에 바이러스 성 capsid 부사장 단백질의 조립에 관련 된 프로세스에 새로운 빛을 발산 하 고. 많은 AAV serotypes 어셈블리에 대 한 AAP를 필요, 우리는 최근 보고는 AAV4, 5, 11는이 규칙에 예외. 또한, 우리는 AAPs 및 다른 serotypes의 조립된 capsids 다른 subcellular 구획을 지역화 설명 했다. 생물 학적 속성 및 다른 AAV 중 AAPs의 기능적인 역할에이 예기치 않은 serotypes 밑줄 다양 한 serotypes에서 파생 된 AAPs에 대 한 연구의 중요성 이 원고는 AAV 정량 및 capsid 어셈블리에서 AAP 종속성 및 serotype 특이성을 평가 하는 응용 프로그램에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 자세히 설명 합니다. 이 점 오 점 분석 결과의 유틸리티를 보여, 우리가 밖으로 설정 capsid 어셈블리 및 AAP 종속성 뱀 AAV 이전 새롭거나 파충류 AAV로 AAV5, AAV9, AAP 독립 및 AAP 종속 이전에 표시의 특성 serotypes, 각각. 분석 결과 뱀 AAV capsid 어셈블리 뱀 AAP를 요구 한다 AAV5와 AAV9에서 AAPs에 의해 승진 될 수 없습니다 밝혔다. 분석 결과 또한, 많은 일반적인 serotype AAPs 상호 보완성으로 분리 capsid 어셈블리를 홍보 하는, 달리 뱀 AAP 홍보 하지 않습니다 AAV9 capsids의 다는 것을 보여주었다. 또한, 우리 nuclease의 선택은 크게 점 오 점 분석 결과의 판독에 영향을 하 고 따라서, 최적의 효소를 선택 하는 것은 AAV titers의 성공적인 평가 위해 매우 중요 표시.

순화 AAV 벡터 주식 대규모 생산의 정량에 대 한 양적 도트도 말의 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 이 점 오 점 분석 결과 함께 더블-좌초 AAV2G9-CMV-GFP 벡터 재고 titer 결정 했다. 벡터는 세 슘 염화 물 (CsCl) 밀도 그라데이션 ultracentrifugation 다음 앞에서 설명한20으로 투 석의 두 라운드 순화 되었다. 일반적으로, 순화 AAV 벡터 주식에 대 한 각 AAV 벡터 주식 (예를 들어, 0.3 µ L, 0.1 µ L, 그리고 0.03 µ L)의 3 개의 다른 볼륨 중복 수정에 위에서 설명한 점 오 점 절차를 받게 됩니다. DNase I 효소 A 단계 3.2, S. marcescens endonuclease 대신 사용 되 고 추출 하 고 바이러스 성 DNA를 정화 상용 키트 단계 3.4 ( <st...

이 원고 내용을 adeno 관련 바이러스 (AAV) titers 및 어셈블리 활성화의 역할을 연구의 응용의 정량에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 단백질 (AAPs), 모든 AAV에 구조 비 바이러스 성 단백질의 새로운 클래스 serotypes capsids 동족과 분리 AAV serotypes에서 파생 된의 어셈블리를 홍보에.

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

이 방법은 정제된 AV vac 역가와 정제되지 않은 AV vac 역가를 모두 측정할 수 있으며 AAV AAP가 동족 및 이종 AV 혈청형 캡시스의 조립을 촉진하는 능력을 평가할 수 있습니다. 이 기법의 주요 장점은 다른 AAV 적정 방법의 단점을 피할 수 있는 간단하고 저렴한 방법이라는 것입니다. 이 방법은 AAV 벡터 정량화에 일반적으로 사용되어 왔지만, 이 프로토콜에서 볼 수 있듯이 AAV 생물학에 대한 다양한 근본적인 질문을 해결하는 데에도 적용할 수 있습니다.0일차에 HEK 293 세포를 90% 농도로 배양한 후 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 칼슘 또는 마그네슘이 없는 96마이크로리터의 PBS에 있는 플라스미드를 혼합하여 트랜스펙션 시약을 준비합니다. 이 표에서 알 수 있듯이 DNA의 총량은 웰당 2마이크로그램입니다. PBS 플라스미드 DNA 혼합물에 4마이크로리터의 PEI 용액을 첨가합니다.최종 부피는 약 100 마이크로 리터 또는 배양 배지의 5 % 부피입니다. 튜브를 잠시 소용돌이치고 DNA PEI 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 마이크로 원심 분리기에서 튜브를 잠시 회전시켜 액체를 바닥으로 모읍니다.그리고 DNA PEI 혼합물을 HEK 293 배양 플레이트의 각 웰에 있는 배양 배지에 적가합니다. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 교반하고 5%CO2가 함유된 섭씨 37도의 인큐베이터로 되돌립니다. HEK 293 세포의 transfection은 고역가 바이러스 생산을 위한 이 프로토콜의 중요한 구성 요소입니다.건강하고 계대가 낮은 세포를 사용해야 하며 세포의 단층을 파괴하지 않도록 주의해야 합니다. 1일차와 2일차에는 도립 형광 현미경으로 PCMVGFP 플라스미드로 transfection된 세포를 관찰하여 transfection 효율을 평가합니다. 5일째에는 세포와 바이러스 함유 배지를 피펫으로 위아래로 또는 세포 스크레이퍼를 사용하여 모든 세포를 긁어냅니다.그런 다음 서스펜션을 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브로 옮깁니다. 샘플을 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 바이러스 입자를 회수하려면 섭씨 37도의 수조에서 얼어붙은 튜브를 빠르게 해동하십시오.그런 다음 세포에서 AAV의 회수를 최대화하기 위해 1분 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이칩니다. 세포 파편을 3, 700배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 그런 다음 각 튜브에서 2

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

작업을 산책 래더 안울렸으면는 숙련된 산책을 평가하고 forelimb과 hindlimb, 배치 스테핑 및 간 사지 공동 성직을 모두 측정할 수있는 새로운 테스트입니다.

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