낮은 복용량 유독 배아 노출의 장기 행동 및 생식 결과

이러한 절차의 전반적인 목표는 초기 배발생에서 저선량 BPA 노출의 장기적인 영향을 조사하는 것입니다. 예쁜꼬마선충 배아는 제한된 기간 동안 BPA에 노출되고 성인이 되면 생식력 및 학습 행동에 대한 테스트를 받습니다. 이 방법은 비스페놀 및 기타 내분비 교란 화합물과 같은 독성 물질에 대한 노출의 장기적인 발달 영향에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 사용하기 쉬운 무척추 동물 실험실 모델에서 정량적 행동 분석을 통해 독성 물질이 발달에 미치는 장기적이고 미묘한 영향을 테스트 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 저용량에서도 독성 물질에 대한 노출로 인한 해로운 건강 영향의 발달 및 신경 기초를 이해하는 것으로 확장됩니다. 우리는 많은 복잡하거나 다요인적인 장애들이 일부 또는 다른 발달 요소를 가지고 있는 것처럼 보인다는 것을 깨달았을 때 이 실험에 대한 아이디어를 처음 떠올렸다.

이는 부분적으로 중요한 유전자의 변칙적 발현을 통해 영향을 미칠 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 내부 터치 습관화 단계가 텍스트 기반 지침만으로는 배우기 어려울 수 있으므로 매우 중요합니다. 동기화 전날, E.coli OP50이 퍼진 NGM 배지가 포함된 100mm 플레이트로 N2 웜을 옮깁니다.

약 1cm 정사각형의 슬래브를 청크하여 만듭니다. 지렁이가 섭씨 20도에서 3일 동안 자라도록 합니다. 3일 후, 눈에 보이는 배아를 포함하는 잘 먹고 성숙한 성체로 플레이트가 채워지면 먼저 5mm의 M9 버퍼로 각 플레이트를 세척하고 액체를 멸균 15ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮겨 동기화를 시작합니다.

3, 실온에서 4분 동안 중력 000배의 원심분리기. 인증서 분리 후 10 밀리리터 피펫을 사용하여 성인 벌레의 느슨한 각 펠릿에서 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 갓 준비한 차아염소산염 용액 5ml를 각 벌레 알갱이에 넣고 부드럽게 섞습니다.

3, 4 분 동안 실내 온도에 중력 000 시간에 분리기. 동기화된 모집단을 얻는 것이 중요합니다. 새로운 차아염소산염 용액을 준비하면 오염과 동기화되지 않은 동물을 피하는 데 도움이 됩니다.

다음으로, 10ml 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 7ml의 M9 완충액을 세척합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 마지막 세척 후 약 100마이크로리터의 M9 완충액을 계란에 추가합니다.

그런 다음 약 50마이크로리터의 계란을 S 완충액에 희석된 BPA가 함유된 2밀리리터 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 표와 같이 튜브당 BPA의 올바른 최종 농도를 보장하기 위해 S 버퍼의 양을 조정합니다. 튜브를 흔들림 또는 회전식 셰이커에 놓고 분당 25회 기울기 또는 25RPM으로 섭씨 20도에서 4시간 동안 움직입니다.

4시간 후 튜브를 튜브 홀더에 넣고 벌레가 가라앉도록 합니다. 상층액을 버리고 OP50 E.coli가 파종된 NGM 플레이트로 기생충을 옮깁니다. 벌레가 섭씨 20도에서 60시간 동안 자라도록 합니다.

매일 플레이트에 오염 여부를 검사하십시오. 오염된 NGM 플레이트는 일반적으로 변색되며 개별 콜로니를 동반합니다. 현미경으로 벌레가 과밀한지 확인하십시오.

먼저, 불에 멸균된 30 게이지 백금 와이어 픽을 사용하여 약 10마리의 동기화된 젊은 성충을 파종되지 않은 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다. 새 플레이트에 적응할 시간을 주기 위해 5분 동안 벌레를 방해하지 않고 그대로 두십시오. 그런 다음 나무 꼬치나 이쑤시개 끝에 붙어 있는 눈썹 털을 70% 에탄올에 담가 소독합니다.

깨끗하고 보푸라기가 없는 티슈로 닦고 에탄올이 증발할 때까지 1분 동안 기다립니다. 눈썹 털을 사용하여 머리에 있는 벌레를 부드럽게 만집니다. 터치를 반복하고 터치 사이에 10초 동안 웜이 회복할 수 있도록 합니다.

계속 터치하고 웜이 더 이상 뒤로 움직이지 않을 때까지 10초 동안 자극 간격을 둡니다. 이 습관화가 발생하기 위해 필요한 터치 횟수를 기록합니다. 접촉 사이에 10초의 간격을 두는 것은 동물의 회복 시간을 허용하고 일관된 습관 행동 분석을 얻는 데 도움이 되기 때문에 중요합니다.

1마이크로몰 또는 더 높은 농도의 BPA에 배아적으로 노출된 성체 동물은 수평선으로 표시된 대조군에 비해 훨씬 적은 알을 낳았습니다. 0.1 마이크로몰의 낮은 BPA 농도에 노출된 배아에서 유래한 성체 동물은 습관화에 필요한 전방 접촉의 증가에 따라 비연관성 결손을 나타냅니다. BPA 노출을 위해 배아를 준비하는 동안, 충분한 표본 크기를 갖기 위해 해부 현미경으로 볼 수 있는 성숙한 난자를 가진 잘 먹인 예쁜꼬마선충 성체가 있는 플레이트를 선택하는 것이 중요합니다.

이 기술은 환경 독성학 분야의 연구자들이 독소 및 기타 내분비 교란 화합물이 행동에 미치는 영향을 평가하고 기계론적 실험을 설계할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초기 단계의 예쁜꼬마선충 배아를 BPA에 노출시키는 방법과 BPA에 노출된 배아에서 파생된 성인의 습관화 행동을 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.