March 19th, 2018
이 프로토콜에는 혈액에서 오염 없이와 뇌 척추 액체 (CSF)의 풍부한 컬렉션에 대 한 향상 된 기술을 설명합니다. 큰 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석 두뇌 및 척수에 영향을 질병의 우리의 이해를 추가 CSF를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 혈액 오염 없이 생쥐로부터 뇌척수액 수집을 개선하는 것입니다. 이 방법은 신경 질환의 바이오마커를 모니터링하기 위해 CSF를 수집하는 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 생쥐의 CSF 수집을 돕기 위해 마이크로 매니퓰레이터를 추가하면 수집 중 혈액 오염이 줄어든다는 것입니다.
당겨진 유리 모세관을 마이크로 매니퓰레이터에 단단히 장착된 모세관 홀더에 넣는 것으로 시작합니다. 다음으로, 해부 현미경을 통해 보면서 직선 집게를 사용하여 날카로운 모세관 끝을 부러뜨려 부러진 팁의 내경이 약 10-20미크론이 되도록 합니다. 그런 다음 얇은 튜브와 주사기를 모세관 홀더의 다른 쪽 끝에 부착하고 얇은 튜브와 주사기를 3방향 밸브에 연결한 다음 3방향 밸브를 이동하여 엽니다.
그런 다음 주사기를 떨어뜨려 오염 물질을 배출하고 모세관 튜브에 양압을 생성합니다. 주사기를 3방향 밸브에 분리했다가 다시 연결하여 이 작업을 몇 번 반복합니다. 그런 다음 주사기를 3방향 밸브와 최종 다시 연결하기 전에 공기를 100-200마이크로리터로 끌어올립니다.
유리 모세관이 있는 마이크로 매니퓰레이터를 옆으로 움직여 수술 중 손상을 방지합니다. 수술을 시작하기 전에 네 팔다리를 모두 꼬집어 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하고 반응이 없는지 관찰합니다. 그런 다음 해부 가위를 사용하여 눈 위, 귀 사이, 목 아래까지 마우스 머리 뒤쪽의 털을 자르고 다듬습니다.
입체식 프레임 마우스 어댑터를 사용하여 마우스 헤드를 고정합니다. 헤드가 움직일 수 없고 마우스 헤드를 부드럽게 눌러 어댑터에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 가위와 구부러진 집게를 사용하여 목 뒤를 가로질러 마우스 피부를 자른 다음 마우스의 귀와 눈 사이의 두개골 중앙을 잘라냅니다.
피부와 조직을 분리하고 수조 마그나 위의 영역에서 빼냅니다. 해부 현미경을 통해 보는 동안 집게를 사용하여 두개골 기저부의 마지막 얇은 근육층을 조심스럽게 해부하고 이 근육층을 관심 영역 밖으로 옆으로 이동합니다. 수조 마그나 위의 경막이 노출되면 젖은 면봉을 사용하여 멤브레인을 깨끗이 닦은 다음 마른 면봉을 사용하여 해당 부위를 말리십시오.
수조 마그나는 삼각형으로 보이며 1-2개의 큰 혈관이 이 부위를 통과합니다. 혈관의 양쪽 또는 혈관 사이는 모세혈관 삽입 및 CSF 수집에 최적입니다. 수조 마그나가 노출되면 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유리 모세관을 마우스 머리 뒤쪽에 정렬하여 날카로운 지점이 30-45도 각도로 멤브레인 바로 뒤에 오도록 합니다.
다음으로, 주사기를 한 번 또는 몇 번 떨어뜨린 다음 플런저를 100-200마이크로리터 뒤로 이동하여 오염 물질이 없고 유리 모세관에 음압이 있는지 확인합니다. 그런 다음 저항이 보일 때까지 모세관 끝을 멤브레인에 더 가깝게 이동하되 멤브레인에 구멍을 뚫지 않습니다. micromanipulator 컨트롤을 두드려 멤브레인을 통해 모세관 튜브를 부드럽게 두드립니다.
CSF는 구멍에 구멍이 뚫리면 자동으로 모세관 안으로 빨려 들어가야 합니다. 모세혈관을 제자리에 두어 천천히 CSF를 수집합니다. CSF의 흐름이 멈춘 경우 주사기를 약 50마이크로리터 위로 천천히 당겨 모세관에 더 많은 음압을 생성합니다.
10-15마이크로리터의 CSF가 10-30분 내에 수집됩니다. 원하는 양의 CSF가 수집되면 3방향 밸브를 이동하여 튜브를 닫고 튜브에 연결된 주사기를 닫고 제거합니다. 튜브를 열었다가 닫아 모세관, 튜빙 및 모세관 외부 영역에 균일한 압력을 생성합니다.
그런 다음 micromanipulator를 사용하여 마우스에서 유리 모세관을 부드럽게 제거하기 전에 주사기를 다시 연결합니다. 다음으로, 1마이크로리터의 20X 프로테아제 억제제가 들어 있는 수집 튜브를 유리 모세관의 날카로운 부분 아래에 놓습니다. 튜브를 열고 주사기를 부드럽게 떨어뜨립니다.
CSF는 모세혈관에서 채취 튜브로 흘러야 합니다. 채취 후 펄스 원심분리기로 CSF를 분리하여 검체를 채취 튜브 바닥에 있는 프로테아제 억제제와 혼합합니다. CSF 샘플을 분주한 다음 추가 분석을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.
APP/PS1 마우스에서 채취한 CSF는 생후 12개월에 인간 A 베타 42 수치가 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 야생형 마우스에서는 인간 A 베타 42가 검출되지 않았다. 일단 숙달되면 이 절차를 제대로 수행하면 1시간 안에 완료할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 모세혈관을 삽입할 때 혈관을 피하고 CSF 수집 중에 미세 조작기로 약간만 조정하여 혈액 오염을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
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이 프로토콜은 최소한의 혈액 오염으로 생쥐로부터 뇌척수액(CSF)을 수집하는 개선된 방법을 설명합니다. 마이크로매니퓰레이터를 이용하여 이 기술은 샘플 순도와 부피를 향상시켜 신경 질환의 바이오마커 분석을 더 잘 할 수 있게 합니다.
Reliable cerebrospinal fluid (CSF) collection is essential for biomarker discovery in neurodegenerative disease research, where sample purity directly impacts data quality and target validation confidence. This method addresses a critical bottleneck in murine neuroscience workflows by enabling higher-yield, low-contamination CSF extraction, supporting more robust mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. Improved CSF accessibility enhances translational continuity from target identification to preclinical biomarker monitoring.
The method integrates into early discovery workflows by providing a reliable upstream sample source for biomarker analysis, bridging target validation and lead optimization phases.