Name: 마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 마취 쥐에서 미세조작기를 이용해 뇌척수액을 채취하는 개선된 방법을. 혈액 오염을 최소화하여 신경질환 바이오마커 분석의 정확도를 높이는 이 기술은 신경과학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81650110527, 81371400)와 키 기본 연구 프로그램의 중국 국가 (2013CB530900)에 의해 지원 되었다.

모든 동물 실험 신경 과학 (미국), 복 단 대학 (상하이, 중국) 윤리 위원회에 대 한 협회의 정책에 따라 수행 했다. 이 절차는 비 생존 수술입니다.
1입니다. CSF 컬렉션 장치 설치
<ol><li>유리 모 세관 당겨 (내경 0.75 m m, 외부 직경 1.0 m m) 같이 사용 하는 micropipette 끌어당기는 사람 (리 우 외. 10; 날카롭게 모 세관에에서 표시 됩니다 그림 1).</li>
	<li>장소는 날카롭게 유리 모 세관 홀더 micromanipulator (그림 1A)에 단단히 장착으로 모 세관.</li>
	<li>그 깨진된 팁의 내부 직경에 대 한 날카롭게 모 세관의 끝 해 현미경 직선 겸 휴식 10-20 µ m (그림 1C).</li>
	<li>모 세관 소유자의 다른 쪽 끝을 얇은 튜브와 주사기를 첨부 하 고 얇은 튜브 및 주사기 3 방향 밸브를 연결.</li>
	<li>3 방향 밸브를 열고 유리 모 세관 튜브에 긍정적인 압력 만들고 어떤 오염 물질을 추방 하는 모 세관 튜브를 통해 주사기에서 타격 공기를 주사기 플런지 이동 합니다.</li>
	<li>반복이 몇 번 표시 연결 다시 3 방향 밸브에 주사기를 연결 하 고 주사기를 그리기 여 ~ 100-200 µ L 주사기 3 방향 밸브 (그림 1B)와 함께 마지막 다시 연결 하기 전에.</li>
	<li>유리 모 세관 micromanipulator 마우스 해 부 동안 손상을 방지 하기 위해 측면으로 이동 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig1.jpg"> 그림 1입니다. 현미경, micromanipulator, 및 모 세관 설치. (A) 현미경과 연결 된 모 세관으로 micromanipulator 설치, (B)의 이미지를 가까이 뿐만 아니라 연결 된 주사기 및 3-방향 밸브를 엽니다 (그림 참조) 하거나 파이핑, 및 (C) 연속적인된 (오른쪽) (왼쪽) 깨진 모 세관 팁 CSF 컬렉션에 대 한 준비입니다. 0.75 m m의 내경, 외경의 1.0 m m. 모 세관의 끝을 해야, 일단 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
2. 마우스 해 부
<ol><li>마우스 anesthetize 참고:이 프로토콜, C57BL/6 및 아 밀 로이드 선구자 단백질/presenilin 1 (APP/PS1) 유전자 변형에 대 한 마우스 (알츠하이머병 마우스 모델)이 사용 되었고 4 %chloral 하이드 레이트 (dH20)에서 복을 통해 마우스 무게 10 µ L/g에와 취 사출입니다.</li>
	<li>완전히 마 취 때 마우스 취 적절 하 게 확인 합니다. 약간 뒷 다리 사지를 확장 하 고 발가락을 꼬 집 고 철수 응답에 대 한 보고 꼬집어, 발가락을 철수 응답 적절 한 마 취를 보장 하기 위해 수행 됩니다. 모든 4 개의 사지;를 곤란 하 게 하 여 확인 아무 반응입니다 마우스 제대로 마 취. 고 해 위 (그림 2A)를 사용 하 여 목의 아래쪽에 귀 사이 눈 위에서 마우스의 머리 뒤쪽 머리 손질. 또는, 또는 depilatory 크림 머리 제거에 도움을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>마우스 어댑터를 사용 하 여 마우스의 머리를 보호 (에 아래로 지적 코를 가진 위로 머리 향하도록 뒤로 ~ 45 °, 그림 2A). 귀 바 귀와 마우스의 눈 사이 수정 하 고 조입니다. 머리 수 없습니다 이동 하 고 마우스의 머리에 부드럽게 밀어 어댑터에 단단히 확보 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>발가락 수술 절 개를 하기 전에 대 타를 철수 응답을 다시 확인 하 고 정기적으로 마 취의 수술 비행기를 그 후. 시각적으로 절차를 마 취의 비행기에 변화를 나타내는 동안 호흡 속도에 변화를 note. 깨끗 하 고 무 균 기술은이 짧은 생존 비 수술에 대 한 사용할 수 있습니다. 두개골의 기지는 근육의 단지 얇은 층으로 노출 될 때까지 피부와 근육의 첫 번째 레이어를 통해 잘라가 위를 사용 하 여 곡선된 겸 자. 참고: 마우스 피부를 통해 목의 뒷면에 걸쳐 고 귀와 마우스의 눈 사이 두개골의 중간 아래 피부를 잘라. 피부와 조직 수 다음 수 떨어져와 지역에 당겨 시스테 마그나.</li>
	<li>보기 해 현미경을 통해 신중 하 게 멀리 해 부 동안 마지막 집게를 사용 하 여 두개골의 기지에 근육의 층을 얇은 하 고 측면을 관심의 영역에서 근육의 이러한 레이어를 이동 합니다. 거기는 출혈 하는 경우 목화 꽃 봉 오리를 사용 하 여 제거 하 고 출혈을 멈추게 하는 데 도움이.</li>
	<li>경질 시스테 마그나에 노출 되 면 (삼각형 모양와 일반적으로 1-2 큰 혈관; 영역을 통해 실행 양쪽의 또는 혈관 사이 최적입니다 모 세관 삽입 및 CSF 컬렉션, 그림 2B), 젖은 사용 목화 꽃 봉 오리를 막 닦아 깨끗 하 고 마른 면봉을 사용 하 여 건조 한 지역.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig2.jpg"> 그림 2입니다. CSF 컬렉션에 대 한 모 세관 삽입의 대표 이미지와 함께 마우스 및 해 부 설치. 마우스 (A)와 CSF 추출에 대 한 준비의 설치는 해 부와 (B) 세부 시스테 마그나를 취재 해 부 마우스 경질의 이미지 (10 x 뷰)에 대 한 장소에 고정 머리를 면도 (점선된 화살표 표시는 지역을 통해 실행 하는 혈관 및 단단한 화살표 영역을 표시 모 세관 삽입에 대 한 최적의) 합니다. (C)의 상세한 이미지 (10 x 보기) 날카롭게 시스테 마그나, (D) 포인트는 모 세관 거의 구멍 도청 경질, 및 (E) 모 세관 팁에서 일부 저항 경질의 경질에 대 한 정렬 유리 모 세관의 끝 통해 수집 CSF를 경질. CSF는 투명 한 액체 유리 모 세관 (점선된 화살표)에서 수집 해야 합니다. 각 현미경 이미지의 오른쪽 하단에 모든 규모 막대 표시 100 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. CSF 컬렉션 마 취 마우스에서
<ol><li>날카롭게 포인트에서 막 바로 뒤에 유리 모 세관 마우스 머리의 뒤에 정렬 한 ~ 30-45 ° 각도 (그림 2C).</li>
	<li>뛰어내리는 주사기를 한 번 또는 몇 번 하 고 주사기를 세우 ~ 100-200 µ L (되도록 아무 오염 물질 고 거기에 부정적인 압력 유리 모 세관).</li>
	<li>모 세관 이동 micromanipulator를 사용 하 여 저항을 볼 수 있는 때까지 막에 가까이 팁 하지만 (그림 2D) 그것을 puncturing 하지.</li>
	<li>일단 저항 모 세관의 팁과 막 본은, 부드럽게 노크 micromanipulator 컨트롤에 의해 멤브레인을 통해 모 세관 튜브를 누릅니다. 시스테 마그나에 모 세관 펑크의 날카로운된 포인트를 볼 수 있는 현미경을 사용 합니다. CSF 자동으로 그려야 모 세관 튜브로 일단 개통 구멍 되었습니다 (그림 2E).</li>
	<li>천천히 CSF를 수집을 모 세관을 둡니다. CSF 밖으로 그리기 중지 되었습니다, 그린 작은 금액을 주사기 천천히 (~ 50 µ L) CSF를 추출 하는 모 세관에서 더 부정적인 압력을 만들려고. 참고: 또는, 모 세관 수 부드럽게 그리고 천천히 오게 될 CSF 다시 모 세관으로 흐르는 것을 허용 하도록 잘 micromanipulator 컨트롤을 사용 하는 두뇌. 총 금액 ~ CSF의 10-15 µ L (~ 모 세관에 3-4 cm) 걸립니다 ~ 10-30 분 및 때때로 20 µ L 이상의 수집 될 수 있습니다. 절대적으로 필요 하지 않지만 CSF 수집 중 열 패드를 사용 하는 것이 좋습니다. CSF 컬렉션 실내 온도에서 수행 되었다 (~ 23 ° C).</li>
	<li>일단 원하는 CSF의 금액을 수집 (CSF를 끌어 중지) 닫습니다 3 방향 밸브를 이동 하 여 튜브를 닫습니다.</li>
	<li>주사기에 튜브에 연결에 밖으로 가십시오 그리고 열고 튜브 (모 세관, 튜브, 그리고 모 세관 외부 영역에서 평준화 압력을 만드는)를 닫습니다. 3-방향 밸브와 주사기를 다시 연결 하지만 주사기를 빠지게 하지 마십시오.</li>
	<li>부드럽게는 micromanipulator를 사용 하 여 마우스에서 유리 모 세관을 제거 합니다.</li>
	<li>유리의 날카로운된 지점에서 컬렉션 튜브 (protease 억제제 x 20의 1 µ L와 1.5 mL microtubes) 장소 모 세관.</li>
	<li>튜브를 열고 부드럽게 주사기 플런지: 모 세관 그리고 컬렉션 튜브에 CSF 흐른다 한다.</li>
	<li>수령 후, 신속 하 게 원심 (5 회전 펄스 미니 원심 분리기를 사용 하 여 최대 속도로 s) 컬렉션 튜브의 하단에 프로 테아 제 억제 물 샘플 혼합 CSF. 참고: CSF 견본 aliquoted 수-80 ° c.에 추가 분석을 위해 저장 하 고 마우스의 나머지는 뇌와 척수와 같은 다른 조직에 대 한 해 부 수 있습니다. 마우스가이 단계에서 아직도 살아 이며 따라서 혈액도 수집 될 수 있습니다, 필요한 경우.</li>
</ol>

<ol><li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+Biomarkers+for+Alzheimer%27s+Disease+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Alzheimers.+Dis%22%5BJournal%5D)">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li>
<li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer%27s+disease+diagnosis%3A+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer%27s+Biomarkers+Standardization+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li>
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<li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li>
<li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+A%CE%B242+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li>
<li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li>
<li>You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li>
<li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+amyloid-%CE%B2+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2(2013).</li>
<li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 설명 자세히 혈액 오염 최소화 및 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 CSF 컬렉션의 현재 방법10 에 향상 (평균 ~ 10-15 µ L를 얻을 수 있다) 쥐에서. 모 세관 끝을 깨는, 모 세관의 끝 해서는 안됩니다 (그럼 CSF 추출 됩니다 매우 느리게) 너무 작은 또는 너무 큰 (되지 않습니다 CSF 수집을 충분히 잘 하 고 조직 모 세관에서 제기 될 수 있다). 주의 해야 때 CSF 컬렉션에 대 한 영역 해 부: 출혈이 중지와 dH20 샘플 오염을 방지 하는 혈액에서 청소 유리 모 세관의 삽입에 대 한 지역. 각 마우스의 해부학은 다른, 하지만 대부분의 마우스 1-2 주요 혈관 모 세관 CSF 컬렉션에 대 한 삽입 해야 하는 영역을 통해 실행. 모 세관의 삽입에 대 한 올바른 위치에 너무 가까운 삽입으로 중요 한 선택 주요 혈관 혈액과 CSF 오염 됩니다. 그림 2에서처럼 지역으로 또는 주요 혈...

CSF 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. CSF는 주로, (아니 붉은 혈액 세포와만 몇 백혈구) 몇 셀을 포함 하 고는 거의 단백질-무료. 그것 하나는 체액의 중앙 신경 시스템 (CNS)와 가까이 접촉에서 이며 전달할 수 많은 전해질 밖으로 두뇌 및 척수 주변 시스템을. 인간에서는, CSF 샘플 수집 질병 진단에 도움이 될 수 있습니다 또는 임상 시험에서 연구 목적, 척추 수돗물 (또는 요 추 찔린)으로 사소한, 침략 적 절차: CSF 액체가에 직접 액세스 하지 않고 CNS에 변화를 반영할 수 있다 조직입니다. 따라서, 병원, 연구 목적을 위해 최근 몇 년 동안에서 CSF 샘플 Alzheimer의 질병, 다른 치 매1,2,3같은 신경 퇴행 성 질환의 환자에서 얻이 되었습니다. 많은 잠재적으로 클리닉2,3에서 질병 진단에 도움이 CSF 샘플을 사용 하 여 개발 된 바이오 마커 분석 실험을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 구체적으로 진단 질병4,5일관성, 민감한 결과를 이러한 분석의 신뢰성에 많은 논쟁이 있다. 그래서, 큰 감도와 특이성 신경 퇴행 성 질환을 진단 하는 표준 기술을 생산에 도움이 더 나은 분석 및 목표, CSF에서 찾을 수 있습니다, 개발에 대 한 중대 한 필요가 있다. 질병에서 인간 CSF 샘플의 잠재적인 중요성 때문 신경 과학 연구에 설치류에서 CSF의 컬렉션의 관심 이기도합니다.
마우스 생물학과 의학 연구에 중요 한 동물 고 잠재적 치료 화합물 및 인간 임상 시험 전에 개념 증명 연구의 테스트에 대 한 허용 한다. 그러나, 쥐에서 어렵습니다 작은 동물, 뇌의 친밀감 때문에 CSF 샘플을 얻기 위해 생쥐에서 CSF 컬렉션의 일반적인 방법은 시스테 마그나, 소 뇌 수 질 oblongata의 등 쪽 표면 사이 개통을 통해 그것을 얻을 하는 것입니다. 어려움으로이 지역에 해 부 어렵다 CSF 샘플을 수집 하 고 혈관, 혈액 세포에서 오염의 위험이 증가에 가까운 근접에서 발생 합니다. 이러한 어려움 때문에 대부분 연구자만 분석 (일반적으로 5-7 µ L로 명시 된)에 대 한 CSF의 작은 금액을 가져올 수 있습니다 및 혈액 세포에 의해 CSF 견본의 오염 분석6,,78 에 대 한 주요 관심사는 , 9. 혈액 오염 결과 보이지 않게 수 고 하지 진정으로 CNS의 상태를 반영. 쥐에서 수집 된 일반적인 금액으로 충분 한 측정 (또는 3 중) 제한 된 샘플 수집 연구를 충격 하는 또한, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여. 따라서, CSF 샘플 충분 한 샘플을 여러 분석 실험을 실행 하기 위해 여러 마우스에서 일반적으로 풀링됩니다. 풍부한에 대 한 프로토콜을 개발, 쥐에서 CSF의 오염의 컬렉션은 크게 원하는 하 고 설치류를 사용 하 여 신경 과학 연구를 개선에 도움이 될 것입니다.
이 프로토콜, 풍부한 기술 (평균 10-15 µ L) 마 취 쥐에서 CSF의 컬렉션 자세히 설명 하 고 피10에서 오염을 최소화 하기 위해 CSF 컬렉션의 현재 알려진된 방법에 향상. CSF 컬렉션에 대 한 강력한 프로토콜 CSF 기반 바이오 마커 분석, 질병 진단에 도움이 CNS에 영향을 미치는 질병의 기반이 되는 메커니즘을 연구 개선 하는 데 사용 수의 개발에 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>클로랄 하이드레이트 (마취제로 사용)</td><td>Sinopharm Chemicals Reagen Co., Ltd.</td><td>30037517</td><td>CAS 번호 302-17-0.</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>66 비전 기술</td><td>54002</td><td></td></tr><tr><td>곡선 집게 해부</td><td>66 비전 기술</td><td>53072</td><td></td></tr><tr><td>직선 집게 해부</td><td>66 비전 기술</td><td>53070</td><td></td></tr><tr><td>마우스 어댑터(이어바 포함)</td>사<td>내에서 제작.</td><td>N/A</td><td>World Precision Instruments에서 사용할 수 있는 유사한 장비.</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Meiji Labax</td><td>모델 15381</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>미세 매니퓰레이터용 마그네틱 베이스</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>모델 P-1000</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1ml)</td> <td>Tansoole</td><td>02024692</td><td>1ml.</td></tr><tr><td>마이크로튜브 (1.5ml)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 세트 III EDTA-free</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Human A&beta; 42 ELISA kit</td><td>Invitrogen</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>Piping(테프론 튜빙)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MMP-KIT</td><td>마이크로 주입 키트에서 얻어 모세관 홀더와 주사기에 부착합니다.</td></tr><tr><td>미니 원심 분리기</td><td>Tiangen Biotech</td><td>OSE-MC8</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>가정용품점/약국에서 구입합니다.</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

뇌 척추 액체 (CSF) 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. 그것은 중앙 신 경계와 가까운 접촉에서 체액 중 하나입니다 하 고 따라서,이 조직에 직접 액세스 하지 않고 뇌 또는 척수의 병 상태를 분석에 사용할 수 있습니다. 그러나, 쥐 혈관의 친밀감 때문 시스테 마그나에서 얻기 어렵다,이 종종 샘플 오염. 마우스에 CSF 컬렉션에 대 한 지역에 해 부도 어렵습니다 그리고 종종 작은 샘플 (5-7 µ L의 최대 또는 더 적은) 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자세하게에서 혈액 오염 최소화 (평균 10-15 µ L를 수집할 수 있습니다)에 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 하는 컬렉션의 현재 방법에 향상 하는 기술을 설명 합니다. 이 기술은 그것 CSF 추출 하는 동안 모든 조직에 영향을 하지 않습니다 마우스에서 조직 컬렉션에 대 한 다른 해 부 방법으로 사용할 수 있습니다. 따라서, 뇌와 척수가이 기법으로 영향을 받지 않습니다 하 고 그대로 유지. 큰 CSF 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석이 더 액체 보조 신경 과학 연구에 사용할 수와 더 나은 두뇌 및 척수에 영향을 미치는 질병을 이해.

(그림 1 및 그림 2) 여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 모 세관에 즉시 수집 CSF 클리어 (그림 2E), 분홍색 또는 빨간색 이어야 한다. 액체는 모 세관에서 수집에 붉은 가미에 분홍색 경우 혈액으로 오염이 했다.
CSF 샘플의 응용 프로그램의 예를 들어가이 방법으로 수집, 단백질 아 밀 로이드-베타 (Aβ)의 수준은 ELISA를 사용 하 여 측정 했다. Alzheimer의 질병 연구7수준 CSF에 Aβ의 일반적으로 측정 됩니다. CSF는 주로 단백질-무료. Alzheimer의 질병 (APP/PS1 마우스)의 마우스 모델에서 인간 Aβ42</su...

이 프로토콜에는 혈액에서 오염 없이와 뇌 척추 액체 (CSF)의 풍부한 컬렉션에 대 한 향상 된 기술을 설명합니다. 큰 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석 두뇌 및 척수에 영향을 질병의 우리의 이해를 추가 CSF를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

이 절차의 전반적인 목표는 혈액 오염 없이 생쥐로부터 뇌척수액 수집을 개선하는 것입니다. 이 방법은 신경 질환의 바이오마커를 모니터링하기 위해 CSF를 수집하는 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 생쥐의 CSF 수집을 돕기 위해 마이크로 매니퓰레이터를 추가하면 수집 중 혈액 오염이 줄어든다는 것입니다.당겨진 유리 모세관을 마이크로 매니퓰레이터에 단단히 장착된 모세관 홀더에 넣는 것으로 시작합니다. 다음으로, 해부 현미경을 통해 보면서 직선 집게를 사용하여 날카로운 모세관 끝을 부러뜨려 부러진 팁의 내경이 약 10-20미크론이 되도록 합니다. 그런 다음 얇은 튜브와 주사기를 모세관 홀더의 다른 쪽 끝에 부착하고 얇은 튜브와 주사기를 3방향 밸브에 연결한 다음 3방향 밸브를 이동하여 엽니다.그런 다음 주사기를 떨어뜨려 오염 물질을 배출하고 모세관 튜브에 양압을 생성합니다. 주사기를 3방향 밸브에 분리했다가 다시 연결하여 이 작업을 몇 번 반복합니다. 그런 다음 주사기를 3방향 밸브와 최종 다시 연결하기 전에 공기를 100-200마이크로리터로 끌어올립니다.유리 모세관이 있는 마이크로 매니퓰레이터를 옆으로 움직여 수술 중 손상을 방지합니다. 수술을 시작하기 전에 네 팔다리를 모두 꼬집어 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하고 반응이 없는지 관찰합니다. 그런 다음 해부 가위를 사용하여 눈 위, 귀 사이, 목 아래까지 마우스 머리 뒤쪽의 털을 자르고 다듬습니다.입체식 프레임 마우스 어댑터를 사용하여 마우스 헤드를 고정합니다. 헤드가 움직일 수 없고 마우스 헤드를 부드럽게 눌러 어댑터에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 가위와 구부러진 집게를 사용하여 목 뒤를 가로질러 마우스 피부를 자른 다음 마우스의 귀와 눈 사이의 두개골 중앙을 잘라냅니다.피부와 조직을 분리하고 수조 마그나 위의 영역에서 빼냅니다. 해부 현미경을 통해 보는 동안 집게를 사용하여 두개골 기저부의 마지막 얇은 근육층을 조심스럽게 해부하고 이 근육층을 관심 영역 밖으로 옆으로 이동합니다. 수조 마그나 위의 경막이 노출되면 젖은 면봉을 사용하여 멤브레인을 깨끗이 닦은 다음 마른 면봉을 사용하여 해당 부위를 말리십시오.수조 마그나는 삼각형으로 보이며 1-2개의 큰 혈관이 이 부위를 통과합니다. 혈관의 양쪽 또는 혈관 사이는 모세혈관 삽입 및 CSF 수집에 최적입니다. 수조 마그나가 노출되면 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유리 모세관을 마우스 머리 뒤쪽에 정렬하여 날카로운 지점이 30-45도 각도로 멤브레인 바로 뒤에 오도록 합니다.다음으로, 주사기를 한 번 또는 몇 번 떨어뜨린 다음 플런저를 100-200마이크로리터 뒤로 이동하여 오염 물질이 없고 유리 모세관에 음압이 있는지 확인합니다. 그런 다음 저항이 보일 때까지 모세관 끝을 멤브레인에 더 가깝게 이동하되 멤브레인에 구멍을 뚫지 않습니다. micromanipulator 컨트롤을 두드려 멤브레인을 통해 모세관 튜브를 부드럽게 두드립니다.CSF는 구멍에 구멍이 뚫리면 자동으로 모세관 안으로 빨려 들어가야 합니다. 모세혈관을 제자리에 두어 천천히 CSF를 수집합니다. CSF의 흐름이 멈춘 경우 주사기를 약 50마이크로리터 위로 천천히 당겨 모세관에 더 많은 음압을 생성합니다.10-15마이크로리터의 CSF가 10-30분 내에 수집됩니다. 원하는 양의 CSF가 수집되면 3방향 밸브를 이동하여 튜브를 닫고 튜브에 연결된 주사기를 닫고 제거합니다. 튜브를 열었다가 닫아 모세관, 튜빙 및 모세관 외부 영역에 균일한 압력을 생성합니다.그런 다음 micromanipulator를 사용하여 마우스에서 유리 모세관을 부드럽게 제거하기 전에 주사기를 다시 연결합니다. 다음으로, 1마이크로리터의 20X 프로테아제 억제제가 들어 있는 수집 튜브를 유리 모세관의 날카로운 부분 아래에 놓습니다. 튜브를 열고 주사기를 부드럽게 떨어뜨립니다.CSF는 모세혈관에서 채취 튜브로 흘러야 합니다. 채취 후 펄스 원심분리기로 CSF를 분리하여 검체를 채취 튜브 바닥에 있는 프로테아제 억제제와 혼합합니다. CSF 샘플을 분주한 다음 추가 분석을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.APP/PS1 마우스에서 채취한 CSF는 생후 12개월에 인간 A 베타 42 수치가 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 야생형 마우스에서는 인간 A 베타 42가 검출되지 않았다. 일단 숙달되면 이 절차를 제대로 수행하면 1시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 모세혈관을 삽입할 때 혈관을 피하고 CSF 수집 중에 미세 조작기로 약간만 조정하여 혈액 오염을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에​​ 질병이 인간의 환자에서 진행됨에 따라 조사를 위해 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 시리얼 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다.

Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

출처: Sweeney, AM, et al. 형광 거시경을 이용한 온전한 마우스 두개골을 통한 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징. J. Vis. Exp. (2019) 이 비디오는 형광 영상을 사용하여 마우스 뇌의 뇌척수액(CSF) 흐름을 시각화하는 과정을 보여줍니다. 형광 추적자를 수조 마그나(CM)에 주입하여 지주막하 및 혈관주위 공간을 통해 CSF와의 움직임을 추적할 수 있습니다. 타임랩스 이미징은 추적자의 여정을 포착하여 세동맥을 통해 뇌 조직으로의 분포를 강조합니다.

형광 거시경을 이용한 마우스 뇌에서 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

심실 뇌척수 (CSF)는 배아의 초기 뇌 발달 동안 neuroepithelial과 대뇌 피질 전구 세포를 bathes. 여기에는 생물학적 기능을 조사하기 위해 다양한 연령대의 쥐 배아에서 심실 CSF를 분리하기 위해 개발 된 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 우리의 대뇌 피질 explant의 해부와 문화 매체 또는 CSF의 최소한의 볼륨으로 explant 성장을 허용 문화 기술을 보여줍니다.

해부하는 뇌 두피 Explants와 함께 사용하기위한 쥐 태아의 뇌척수의 절연

여기는 시스테 마그나 cannulation (CMc), 뇌 척추 액체 (CSF)에 추적기, 기판 및 신호 분자를 제공 하는 최소 침 습 방법을 수행 하는 프로토콜에 설명 합니다. 다른 이미지 형식으로 결합, CMc glymphatic 시스템 및 CSF 역학 평가 뿐만 아니라 다양 한 화합물의 두뇌 전체 배달 수 있습니다.

설치류의 시스테 마그나에 정 맥 주입

경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

높은 척수액 단백질 수준은 변경된 혈액 뇌 장벽 또는 신분 합성을 통해 혈장 단백질의 확산의 결과일 수 있습니다. 최적화된 테스트 프로토콜은 두 경우를 모두 구별하는 데 도움이 되며 합성된 단백질의 정량적 측정을 제공하는 이 문서에 제시되어 있습니다.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

이 기사에서는 생쥐의 뇌척수액(CSF)에서 포도당 농도를 증가시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 높은 CSF 포도당이 생쥐의 신경변성, 인지 및 말초 포도당 대사에 미치는 영향을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.

마우스 뇌척수액의 포도당 농도 증가를 위한 삼투압 미니펌프 이식

이 프로토콜은 지속적인 비디오 뇌전도(EEG) 모니터링과 병행하여 수행된 간질 쥐의 반복적인 뇌척수액 및 혈액 수집을 보여줍니다. 이는 다양한 체액 분자의 변화와 발작 활동 사이의 가능한 연관성을 탐구하는 데 도움이 됩니다.

EEG 기록 중 쥐의 측면 꼬리 정맥에서 뇌척수액 및 혈액 샘플링

생체 내에서 뇌의 혈류 조절을 연구하기 위해 전통적인 약리학적 방법은 침습적이며 종종 두개골, 경막 및 연수막을 손상시킵니다. 이 연구에서 우리는 나노인젝터 유도 시스터내 마그나(ICM) 주입과 레이저 스페클 대비 이미징을 결합하여 두개골과 연극의 무결성을 보존하는 최소 침습 기술을 개발했습니다.

Paired Cisterna Magna Nanoinjection 및 Laser Speckle Contrast Imaging Assay를 통해 In Vivo에서 대뇌 혈류 조절 연구

여기서는 여러 신경학적 질환에서 중요한 역할을 하는 마우스 수막 림프관(MLVs)을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 추적자 배수의 기능적 평가와 등쪽 MLVs 네트워크의 상세한 형태학적 특성화를 모두 가능하게 하는 통합 방법을 제공하는 것입니다.

수막 림프관 평가를 위한 통합 프로토콜: 흉부 주사, 림프절 영상, 수막 박리, 전면 착색

배우세요 마취 쥐에서 미세조작기를 이용해 뇌척수액을 채취하는 개선된 방법을. 혈액 오염을 최소화하여 신경질환 바이오마커 분석의 정확도를 높이는 이 기술은 신경과학 연구에 필수적입니다.

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

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