두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

이 실험의 전반적인 목표는 수상돌기의 이광자 칼슘 이미징과 병행하여 뉴런 소마의 전체 세포 패치 클램프 기록을 사용하여 다양한 자극 패러다임에 대한 반응으로 뉴런 수상돌기의 칼슘 상승을 연구하는 것입니다. 이 방법은 작은 수지상 구획에서 칼슘 신호를 모니터링하는 데 사용할 수 있으며, 시냅스 입력이 통합되는 동안 수지상 가지에서 발생하는 과정을 면밀히 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 칼슘 신호 패턴을 높은 시공간 해상도와 특이성으로 관찰할 수 있다는 것입니다.

지속적으로 산소가 공급되는 차가운 ACSF-자당이 들어 있는 페트리 접시에 마우스 뇌를 놓습니다. 추출한 뇌에서 해마 조각을 준비하려면 약 2분 동안 뇌를 식힌다. 그런 다음 얼음으로 채워진 페트리 접시에 여과지 한 조각을 놓고 뇌를 여과지에 옮깁니다.

그런 다음 뇌를 두 개의 반구로 해부합니다. 절개된 반구를 비브라톰 절편 플랫폼에 붙이고 얼음처럼 차가운 산소가 공급된 ACSF-수크로오스로 채워진 절편 트레이에 담그십시오. 그런 다음 300마이크로미터 두께의 단면을 비브라톰 쿨러를 사용하여 섭씨 1도에서 자르거나 비브라톰 트레이 주위에 얼음을 놓습니다.

페인트 브러시를 사용하여 해마가 포함된 조각을 섭씨 37도까지 가열된 산소가 공급된 ACSF 회수 욕조로 옮깁니다. 이 단계에서는 해마 절편을 레이저 스캐닝 이광자 현미경의 대물렌즈 아래에 있는 수조로 옮깁니다. 산소가 공급된 ACSF-normal로 욕조를 지속적으로 관류하십시오.

그런 다음 적외선 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 크기, 모양 및 위치를 사용하여 관심 세포를 찾습니다. 그 후, 적색 형광단을 함유한 ACSF-normal 용액으로 자극 피펫을 채웁니다. 끝이 관심 셀과 동일한 영역에 있도록 슬라이스 위로 내립니다.

그런 다음 패치 피펫에 패치 용액을 채우고 헤드 스테이지에 부착합니다. 끝이 관심 있는 셀 바로 위에 오도록 슬라이스 위에 놓습니다. 그런 다음 주사기를 3방향 마개에 끼우고 플라스틱 튜브를 통해 패치 피펫에 연결합니다.

패치 피펫에 일정한 양압을 주입하고 스톱콕을 가까운 위치에 유지합니다. 그런 다음 MultiClamp 증폭기 제어 소프트웨어 모듈을 열고 VC 버튼을 클릭하여 전압 클램프 모드로 전환합니다. 전기생리학적 신호를 기록하기 위한 전기생리학 Clampex 데이터 수집 소프트웨어를 열고 멤브레인 테스트 아이콘을 클릭하여 파이펫 저항의 변화를 모니터링하기 위한 일정한 구형전압 펄스를 보냅니다.

이제 패치 피펫이 대상 세포 바로 위에 올 때까지 내립니다. 세포막에 닿으면 스톱콕을 열린 위치로 돌려 압력을 제거합니다. 그런 다음 피펫 저항이 1기가옴에 도달할 때까지 스톱콕에 장착된 빈 주사기를 사용하여 패치 피펫에 약간의 음압을 가합니다.

데이터 수집 소프트웨어의 Membrane Test 창에서 셀을 음의 60m볼트로 고정합니다. 피펫 저항성이 떨어지고 전체 셀 구성이 이루어질 때까지 음압을 계속 가합니다. MultiClamp 증폭기 제어 소프트웨어 모듈에서 IC 버튼을 클릭하여 패치 구성을 전류 클램프로 설정하고 과분극 및 탈분극 전류의 체세포 주입에 대한 반응으로 멤브레인 특성을 기록합니다.

셀이 패치 솔루션에 있는 지표로 채워질 때까지 최소 30분 동안 기다립니다. 이미지를 획득하려면 적색 형광 신호를 사용하여 관심 있는 수상돌기를 찾으십시오. GABAergic 인터뉴런에서 거리에 따라 AP 역전파의 효율성이 크게 감소할 수 있으므로 50마이크로미터 미만의 근위 수상돌기를 선택하여 가시적인 반응을 보장하고 xt 모드로 전환합니다.

레이저 강도 컨트롤러를 사용하면 이광자 레이저를 기준선 녹색 형광이 약간만 보이는 최소 출력 수준으로 설정하여 광독성을 방지할 수 있습니다. 그 후, Clampex 전기생리학 데이터 수집 소프트웨어 프로토콜 창 및 이미지 수집 소프트웨어에서 원하는 진폭의 체세포 전류 주입을 포함하는 원하는 기간의 기록 시험을 생성합니다. 그 후, 기록 시작 버튼을 클릭하고 1-2초 동안 지속적으로 형광을 획득합니다.

이미지 획득을 3-10회 반복합니다. 광손상이 발생하지 않도록 단일 스캔 사이에 최소 30초를 기다리십시오. 전기 자극에 의해 유도된 수지상 칼슘 과도 현상을 기록하려면 적색 형광 신호를 사용하여 관심 있는 수상돌기를 찾습니다.

자극 피펫을 관심 있는 수상돌기 위의 슬라이스 표면에 놓습니다. 자극 피펫을 수상돌림막에서 10-15마이크로미터 떨어진 곳에서 천천히 내리고, 전체 세포 구성을 방해하지 않도록 움직임을 최소화합니다. 애스피니 뉴런에서 시냅스 미세도메인의 위치를 시각화하려면 이미지 획득 소프트웨어에서 xt 모드로 전환하고 관심 있는 수지상 가지를 따라 선을 배치합니다.

Protocol 창에서 자극을 트리거하는 레코딩 트라이얼을 만듭니다. 획득 소프트웨어를 사용하여 1-2초 동안 수상돌기를 따라 계속 스캔합니다. 사진 손상을 방지하기 위해 스캔 사이에 30초 동안 대기하고 3-5회 획득을 반복합니다.

세포의 형태에 대한 예비 정보를 얻고 자극 피펫의 위치를 기록하려면 빨간색 채널에서 세포의 Z-스택을 획득합니다. xyz 모드에서 수집 소프트웨어를 사용하여 모든 프로세스가 포함된 전체 셀을 이미지화하기 위해 상한 및 하한 스택 한계를 설정합니다. 그런 다음 단계 크기를 1마이크로미터로 설정하고 Start Record 버튼을 사용하여 스택 수집을 시작합니다.

Z-stack 획득이 완료되면 소프트웨어의 Maximum Projection 옵션을 사용하여 스택의 모든 초점 계획을 중첩하고 획득 품질을 확인합니다. 그런 다음 패치 피펫을 슬라이스에서 천천히 집어넣습니다. 사후 형태학적 식별을 위해 슬라이스를 고정하려면 페인트 브러시를 사용하여 수조에서 슬라이스를 빠르게 제거하고 ACSF로 채워진 페트리 접시의 두 여과지 사이에 놓습니다.

ACSF를 4% 파라포름알데히드 용액으로 교체하고 접시를 섭씨 4도에서 밤새 그대로 두십시오. 이 그림에서 이광자 Z-스택의 최대 투영은 Alexa-594로 채워진 패치된 인터뉴런을 보여줍니다. 흰색 화살표는 피라미드 층 내의 축삭 말단의 위치를 가리키며, 이는 중간뉴런이 바구니 세포임을 암시합니다.

이 그림은 자극 전극이 배치된 근처의 수지상 가지를 보여줍니다. 파선은 선 스캔의 위치를 보여줍니다. 여기 이미지는 빨간색 및 녹색 채널의 라인 스캔 결과를 보여줍니다.

자극 시 녹색 형광의 증가는 해당 영역의 칼슘 농도가 상승했음을 나타냅니다. 이미지를 더 작은 세그먼트로 그룹화하여 반응의 확산을 분석할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있는 흔적은 이미징 시험 동안 체세포 수준에서 기록된 전기 자극에 대한 반응으로 다른 세그먼트에서 유도된 칼슘 과도 현상을 보여줍니다.

칼슘 과도 현상의 진폭은 중심 핫스팟에서 멀어질수록 감소하며, 이는 반응이 공간적으로 국소화되어 있음을 나타냅니다. 이 절차에 따라 전압 민감성 염료 이미징 또는 광유전학과 같은 다른 방법을 수행하여 수지상 분기 내 메모리 전위의 국부적 변화 또는 특정 입력의 통합과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수지상 투입 통합 및 가소성의 복잡성을 탐구하는 데 유용한 광생리학적 기술의 조합을 사용하여 뉴런 수상돌기의 활성에 따른 칼슘 변동을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.