해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩
March 2nd, 2018
Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.
이 절차의 전반적인 목표는 초파리 번데기 난소를 절개하고 염색하는 것입니다. 이 방법은 모델 유기체인 초파리(drosophila)의 줄기세포 분화 및 조직 발달과 관련된 것과 같은 생물학 발달의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법으로는 분리하기 어려운 번데기 난소의 작은 크기와 반투명한 특성을 수용하기 위해 맞춤형 도구를 사용한다는 것입니다.
우리는 번데기 초파리 발달 중 난소의 줄기세포 분열을 추적하기 위해 시간 경과 실험을 수행할 때 그의 방법을 사용하자는 아이디어를 가지고 있었습니다. 프로토콜을 시작하기 위해 10마리의 수컷 초파리와 15마리의 암컷 성체 초파리 파리를 효모가 보충된 정상적인 풍부한 파리 사료 바이알에 결합합니다. 알이 3-4일 동안 실온에서 유충으로 자라도록 합니다.
3-4일 후, 부드러운 칫솔모가 있는 촉촉하고 고운 브러시를 사용하여 바이알 벽을 따라 브러시로 롤링 동작을 만들고, 바이알에서 방황하는 세 번째 instar 유충을 1X 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 가장자리까지 채워진 유리 우물로 옮깁니다. 1X PBS로 채워진 다른 우물로 옮겨 유충에서 음식물 찌꺼기를 씻어냅니다. 수컷과 암컷 유충을 집게로 분리하십시오.
수컷 유충은 앞쪽 끝에서 2/3 아래쪽의 측면에있는 지방체에 박혀있는 한 쌍의 큰 원형 및 반투명 고환으로 식별합니다. 그런 다음 우물에서 최소 10마리의 암컷을 모으고 암컷 유충을 1X PBS로 채워진 별도의 우물에 넣습니다. 집게를 사용하여 암컷 유충을 효모가 보충된 신선한 파리 먹이가 담긴 새 유리병에 부드럽게 옮깁니다.
번데기를 용이하게 하기 위해 암컷 유충과 함께 바이알을 어두운 곳에 놓습니다. 하루 종일 유충이 번식하는지 모니터링하십시오. 각 유충이 엽엽을 형성하고 번데기 이전으로 발달함에 따라 번데기 이전을 바이알에 대고 번데기 이전에 처음 형성되는 대략적인 시간을 기록합니다.
분젠 버너 위에서 페스터 피펫의 유리 끝을 녹입니다. 유리가 녹으면 집게를 사용하여 팁을 파이펫의 나머지 부분에서 수평으로 당겨 더 얇은 팁을 만듭니다. 냉각 후 피펫 팁의 작은 부분을 떼어내어 깔끔한 원형 구멍을 만듭니다.
파이펫의 다른 쪽 끝에 전구를 부착하고 파이펫에 1X PBS를 로드합니다. 바이알 벽에 붙어있는 번데기를 수확하려면 번데기와 바이알 사이의 접촉 영역을 따라 작은 물방울을 바르십시오. 단백질 접착제가 1-2분 동안 녹도록 한 후 촉촉하고 고운 브러시로 번데기를 벽에서 부드럽게 들어 올립니다.
1X PBS로 채워진 우물당 한 마리의 번데기를 옮깁니다. 한 쌍의 집게로 번데기의 뒤쪽 끝을 잡으면서 번데기의 머리가 보일 때까지 번데기의 앞쪽 부분을 다른 쌍으로 조심스럽게 찢습니다. 번데기 머리의 가장 앞쪽 끝을 집게로 잡고 번데기 케이스에서 번데기를 부드럽게 당겨 빼냅니다.
다음으로, 복낭만 남을 때까지 번데기의 앞쪽 절반과 뒤쪽 절반을 분리하여 버립니다. 한 손에는 집게로 우물 바닥에 대고 복주머니를 잡고 다른 손에는 1X PBS로 채워진 얇은 유리 피펫을 잡습니다. 얇은 피펫 끝을 주머니 입구 쪽으로 향하게 하고 1X PBS를 복부에 천천히 피펫으로 넣어 번데기 난소를 둘러싼 지방세포를 씻어냅니다.
지방체의 3분의 2 이상이 사라질 때까지 또는 복부 주머니 입구 근처에서 난소가 보일 때까지 지방체 세포를 씻어냅니다. 난소가 우물 안에서 보이지 않는다면 복부에 남아 있어야 한다. 난소가 나왔으면 새 번데기를 우물에 넣고 이 단계를 반복합니다.
고정 완충액으로 채워진 투명하게 덮인 유리 챔버로 복부를 옮기고 그 위에 뚜껑을 놓습니다. 염색 및 장착 과정에서 충분한 난소가 서 있을 수 있도록 필요한 것보다 더 많은 난소를 절개합니다. 염색 과정 전반에 걸쳐 집게를 사용하여 떠 있는 난소를 덮인 유리 웰의 바닥으로 부드럽게 밀어 난소가 항체 용액에 완전히 잠기도록 합니다.
새 역가의 평평한 표면에 양면 테이프 스트립을 놓고 난소와 고정 완충액이 들어 있는 챔버 커버 유리를 접착 표면에 놓습니다. 실온에서 15분 동안 고정 완충액에 난소를 배양합니다. 다음으로, 1% Triton X-100 또는 1% PBST를 1X PBS에서 각각 5분, 10분, 45분 동안 3회 헹구어 난소를 철저히 투과시킵니다.
0.5%PBST에 10% 일반 염소 세럼으로 난소를 30분 동안 잠급니다. 그런 다음 600마이크로리터의 1차 항체에서 섭씨 4%에서 0.5%PBST로 난소를 밤새 배양합니다. 다음 날, 난소를 5분씩 0.5%PBST로 3회 헹굽니다.
실온에서 0.5%PBST로 희석된 600마이크로리터의 2차 항체에서 난소를 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 난소를 0.5%PBST에서 5분 동안 두 번, 1X PBS에서 5분 동안 한 번 헹굽니다. 1X PBS를 현미경 슬라이드에 한 방울 떨어뜨립니다.
집게를 사용하여 챔버 커버 유리에서 1x PBS로 채워진 유리 웰로 복부 주머니를 옮깁니다. 복주머니와 남아 있는 지방체를 집게로 찢어냅니다. 겸자 끝 사이의 난소 중심을 잡고 현미경 슬라이드에서 웰의 난소를 1x PBS 한 방울로 옮깁니다.
용액이 마르면 슬라이드에 1X PBS를 몇 방울 떨어뜨립니다. 모든 난소를 해부하여 현미경 슬라이드로 옮긴 후 40마이크로리터의 장착 매체를 22 x 22mm 커버에 피펫으로 밀어 넣고 커버 슬립을 난소 위에 부드럽게 놓습니다. 마지막으로, 이미징하기 전에 슬라이드를 밤새 건조시킵니다.
포스포 히스톤 H3 염색과 같은 세포 증식에 특이적인 면역조직화학은 줄기세포 및 기타 유사분열 활성 세포 유형의 세포 분열 패턴을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 군집 세포에서 유래한 번데기 줄기 세포는 Fasciclin III 염색으로 윤곽을 그릴 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 지방체 추출 또는 면역조직화학 과정에서 몇 개의 난소가 손실될 수 있으므로 실험에 필요한 것보다 더 많은 PB를 수확하고 해부하는 것이 가장 좋습니다.
시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 기사는 줄기 세포 틈새 공간 발달 연구에 중요한 모델인 초파리 번데기 난소를 해부하고, 염색하고, 장착하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 번데기 난소의 작은 크기와 반투명한 특성이 가져오는 어려움을 해결합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경 과학
- 발달 생물학
- 줄기 세포 연구
배경
- 초파리는 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체입니다.
- 줄기 세포 분화를 이해하는 것은 조직 발달에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 번데기 난소 해부는 기존에 상세하게 설명되지 않은 특수한 기술이 필요합니다.
- 이 프로토콜은 발달 중 줄기 세포 분열을 연구할 수 있는 능력을 향상시킵니다.
연구 목적
- 번데기 난소 해부에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
- 줄기 세포 분화 및 조직 발달 연구를 용이하게 합니다.
- 초파리 난소 발달 연구에 대한 접근성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 풍부한 음식 환경에서 성숙한 수컷과 암컷 초파리를 결합합니다.
- 실온에서 알이 유충으로 발달하도록 합니다.
- 해부 및 염색을 위한 사용자 정의 도구를 사용합니다.
- 번데기 발달 중 줄기 세포 분열을 추적합니다.
주요 결과
- 번데기 난소를 분리하는 성공적인 프로토콜이 확립되었습니다.
- 이 방법은 난소의 효과적인 염색 및 장착을 가능하게 합니다.
- 사용자 정의 도구가 해부 과정을 크게 개선했습니다.
- 발달 중 줄기 세포 행동에 대한 통찰력을 얻었습니다.
결론
- 설명된 프로토콜은 초파리 난소 발달 연구를 향상시킵니다.
- 줄기 세포 생물학 분야의 미래 연구를 위한 프레임워크를 제공합니다.
- 사용자 정의 기술은 다양한 발달 연구에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accessing and analyzing Drosophila pupal ovaries enables high-resolution investigation of stem cell differentiation and tissue development, supporting early-stage target validation in developmental biology. The protocol's ability to isolate and stain these challenging tissues provides predictive confidence for mechanistic studies and informs translational research strategies. This workflow is relevant for biopharma teams seeking robust model systems for pathway interrogation and functional target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of stem cell division and differentiation pathways in a genetically tractable model.
- Supports functional target validation by allowing visualization of specific cell populations via immunohistochemistry.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying developmental processes relevant to disease modeling.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream antibody-based assays and imaging workflows.
- Improves assay reproducibility through standardized dissection and staining procedures.
- Enables quantitative analysis of cell proliferation and differentiation markers in situ.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant system modeling by tracking developmental cell fate decisions.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting time course experiments across developmental stages.
- Offers predictive value for translational biomarker identification in stem cell and tissue development contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model development, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven analysis of stem cell behavior and tissue morphogenesis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for antibody-based detection of cell states.
- Analytics: Delivers high-content imaging data for comparative analysis of developmental conditions.
- Translational Research: Bridges basic developmental insights to preclinical model validation when aligned with disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for dissecting and staining small, delicate tissues in diverse model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in developmental pathway analysis and target validation.
- Operational Value: Standardizes challenging tissue preparation steps for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing ambiguity in early-stage biological models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microdissection and immunohistochemistry of small tissues.
- Needs access to customized dissection tools and high-resolution imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and staining.
- May require adaptation for other model organisms or tissue types with similar challenges.
- Involves a learning curve due to the small size and fragility of pupal ovaries.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:41
Egg Laying and Female Larvae Selection
2:12
Pupae Antibody Staining Preparation
4:24
Immunohistochemistry
5:52
Dissecting and Mounting Pupal Ovaries
6:49
Results: Clear Antibody Staining that Reveals Drosophila Structure and Cellular Organization
7:12
Conclusion
