단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

이 방법은 바이오마커 발견, 약물 발견, 진단 및 약물 또는 항체의 검진과 같은 생물 의학 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량이며 단백질 동소형을 매우 재현 가능한 방식으로 검출할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 영향 받은 단백질 또는 그들의 등소 양식을 측정할 수 있기 때문에 많은 질병의 진단으로 확장합니다.

이 방법은 세포 신호 경로에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 특정 단백질을 분석할 필요가있는 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 분석 단계가 거품 제거, 플레이트 로드, 등 세테라와 같은 트릭 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 먼저, DMSO 억제제 믹스 1편과 프로테아제 억제제 2마이크로리터를 47마이크로리터에 첨가하여 시료 희석제 혼합을 준비하여 DMSO 및 프로테아제 억제제의 최종 농도가 원하는 농도를 얻기 위해 시료 희석제 혼합을 이용하여 이전에 분리된 단백질 리자이 1개되도록 한다.

다음으로, 표준 사다리의 3.325 마이크로리터, 프로테아제 억제제6마이크로리터, 안톨라이트 프리믹스의 137.675 마이크로리터에 DMSO 억제제 3편을 추가한다. 샘플을 15초 이상 소용돌이치며 얼음을 유지합니다. DMSO 프로테아제 억제제와 등전점 표준 사다리의 최종 농도가 1X이고 모세관의 단백질이 최종 원하는 농도에 도달할 수 있도록 두 개의 준비된 용액을 1~3비율로 혼합한다.

단백질이 샘플 혼합물에 첨가된 후 모든 단계는 얼음이나 섭씨 4도에서 수행됩니다. 얼음 위에 384웰 접시를 놓습니다. 자동화 된 서양 블로팅 시스템 소프트웨어로 설계된 분석 템플릿 레이아웃에 따라 샘플 믹스의 10 마이크로 리터를 플레이트의 적절한 우물에 로드합니다.

이에 따라, 항체 희석제로 1차 및 이차 항체를 희석시한다. 그런 다음, 1차 항체의 10마이크로리터와 각각의 우물로 이차 항체의 15 마이크로리터를 피펫한다. 다음으로, 루미놀과 과산화수소 XDR을 1대 1 비율로 혼합합니다.

루미놀 과산화물의 파이펫 15 마이크로리터가 각 우물에 섞어 넣습니다. 시료와 레이건을 접시에 첨가하면 원심분리기는 2500회 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 액체를 회전시키고 거품을 제거합니다. 거품이 여전히 남아 있는 경우 얇은 파이펫 팁을 사용하여 수동으로 제거합니다.

자동화된 웨스턴 블로팅 시스템 소프트웨어를 열고 파일 메뉴에서 새'를 클릭합니다. 레이아웃 창으로 이동하여 384웰 플레이트의 레이건 및 샘플위치에 할당합니다. 블록의 어느 곳에서나 잘 클릭하여 레이건 과제를 수행합니다.

각 12개의 우물행 블록을 선택합니다. 다음으로 레이아웃 창 도구 모음으로 이동하여 샘플, 기본, 보조 또는 루미놀 행 블록을 삽입합니다. 프로토콜 창으로 이동하여 플레이트에서 레이건 위치를 선택합니다.

그런 다음 샘플 열의 셀을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 레이건을 선택합니다. 같은 방식으로 각 사이클에 대해 프라이머리, 보조 및 루미놀의 레이건 위치를 선택합니다. 1차 또는 이차 항체 컬럼에서 한 번에 하나씩 세포를 클릭하고 필요한 경우 인큐베이션 시간을 변경합니다.

그런 다음 프로토콜 섹션에서 추가 단추를 클릭하여 주기를 추가합니다. 템플릿 창에서, 1차 및 이차 항체의 ID, 카탈로그 번호 및 희석과 같은 샘플에 관련된 정보를 입력합니다. 새 분석 파일을 저장합니다.

시작 버튼을 클릭하기 전에 레이아웃을 신속하게 확인하여 모든 것이 올바른지 확인합니다. 이제 시작'을 클릭하여 실행을 시작합니다. 이 소프트웨어는 사용자가 폐기물을 제거하고, 물과 모세관 상자를 채우고, 자원 트레이에 아노라이트와 음극을 추가하고, 세척 버퍼를 추가하고, 냉각 된 샘플 트레이에 플레이트를로드하도록 사용자에게 메시지를 표시합니다.

실행이 시작된 후 몇 분 후에 컴퓨터 화면에 계측기 상태 표시줄이 표시됩니다. 실행 요약'화면을 클릭하여 상태 및 분리 창을 확인합니다. 모세관에서 전기전도 분리를 관찰하려면 원하는 주기를 클릭한 다음 제어판에서 재생 버튼을 클릭하여 모세관에 대한 분리 동영상을 재생합니다.

실행 파일을 열고 분석 화면 탭을 선택합니다. 편집을 클릭한 다음 분석'하여 등산 점 범위를 변경합니다. 적절한 동전점 표준을 적용합니다.

피크 핏을 추가하고 피크 이름을 추가합니다. 마지막으로 피크 탭에서 사용할 데이터를 선택하고 추가 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 혈관 내피 성장 인자 자극 용액용용액으로부터 인포증 외세포 신호 조절 키나아제의 전페로그램이 여기에 나와 있다.

혈관 내피 성장 인자와 관찰 된 인산 단백질의 매우 높은 유도가 있습니다. 인셋은 내인성 적재 제어인 HSP 70을 나타내며, 처리되지 않은 샘플과 처리되지 않은 샘플 모두에 대해 유사한 시료 하중을 나타낸다. 종래의 면역블롯에서는 인광세포외성 신호 조절 키나아제 단백질이 모세관 등포 집중 분석에 의해 4개의 피크로 해결되었음에도 불구하고 두 개의 밴드만 검출되었다.

혈관 내피 성장 인자 자극 용액에서 세포외 신호 조절 키나아제의 전극체사진은 여기에 표시됩니다. 인셋은 병렬로 사용되는 것과 동일한 로딩 컨트롤을 보여 주습니다. 종래의 면역블롯은 세포외 신호 조절 키나아제 1개 및 세포외 신호 조절 키나아제 2개에 대응하는 두 개의 밴드만 을 나타낸다.

모세관 등류 초점과 는 반면, 세포외 신호 조절 키나아제 단백질은 4개의 다른 인광 봉우리와 2개의 un-phosphorylated 봉우리 모두에 해당하는 6개의 봉우리로 해결되었습니다. 일단 마스터되면 이 기술은 제대로 수행되는 경우 주기 수에 따라 몇 시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 기존의 면역 blot에 비해 더 높은 항체 농도를 사용하는 것이 중요하다.

이 방법의 시각적 데모는 분석 단계가 거품 제거, 플레이트 로드, 세테라 와 같은 트릭 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분석법을 설계하고, 샘플을 준비하고, 분석기를 실행하고, 데이터를 분석하여 단백질의 다른 등색을 관찰하는 방법을 잘 이해해야 합니다.