Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

감마-세크레타제에 대한 이 정량적 세포 기반 리포터 유전자 분석의 전반적인 목표는 감마-세크레타제 매개 절단에 대한 추정 감마-세크레타제 조절제의 차등 효과를 조사하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병 치료를 위한 새로운 감마-세크레타제 조절제의 식별과 같은 알츠하이머병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 고효율 분석 시스템이며 감마 세크레타제 조절제를 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 부작용을 최소화하는 항 AD 약물의 잠재적 발견을 통해 알츠하이머병 치료로 확장됩니다. 이 방법은 감마-세크레타제의 기질 선택성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 신경모세포종과 같은 다른 질병에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다.

이 방법을 처음 사용하는 개인은 너무 많은 교란으로 인해 최종 결과가 복잡해질 수 있으므로 세포 배양 배지를 96 마이크로플레이트에 조심스럽게 제거하고 추가하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 참조된 대로 NG 및 CG 세포의 준비로 이 절차를 시작합니다. 혈구계로 NG 또는 CG 세포를 계수합니다.

다음, 성장 매체에 있는 우물 당 200 마이크로리터의 마지막 양에 96 잘 microplate에 200 well당 200 세포에 20의 세포에 세포를 씨를 뿌립니다. 마이크로플레이트를 가습된 이산화탄소 인큐베이터로 옮기고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후 각 웰에서 100마이크로리터의 성장 배지를 제거합니다.

0.2%dimethyl sulfoxide, 2개의 마이크로몰 CL-387, 785, 2개의 마이크로몰 DAPT 또는 기타 관련 ErbB1/ErbB2 억제제와 함께 1ml당 2마이크로그램의 테트라사이클린을 포함하는 성장 배지 웰당 100마이크로리터를 추가합니다. 처리된 세포와 마이크로플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 마이크로플레이트에서 성장 배지 웰당 150마이크로리터를 제거합니다.

그런 다음 루시페라제 분석 시약 웰당 50마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 마이크로플레이트를 발광 마이크로플레이트 리더로 옮기고 실온에서 5분 동안 유지합니다. 발광 마이크로플레이트 리더에 저장된 사전 정의된 프로그램을 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 방출 발광을 측정합니다.

먼저 기기 제어 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 도구 메뉴에서 Luminometry를 선택합니다. Parameters 설정에서 emission filter(방출 필터)에 대해 No Filter(필터 없음)를 선택하고, emission aperture(방출 조리개)에 Normal(보통)을 선택하고, 계수 시간에 대해 하나를 입력하고, OK(확인)를 클릭하여 발광 판독값을 설정합니다.

Instrument control 탭에서 활성 프로토콜 목록을 스크롤하고 발광을 판독하기 위해 사전 저장된 프로토콜을 선택합니다. Live display 탭의 풀다운 메뉴에서 스케일을 정의하고 유형으로 Logarithm 또는 Linear를 선택합니다. 온도 탭에서 플레이트 가열을 위해 끄기를 선택합니다.

마지막으로 시작 버튼을 클릭하여 발광 판독을 수행합니다. 제어 소프트웨어에 내장된 Explorer를 사용하여 결과를 스프레드시트 형식으로 내보냅니다. 테트라사이클린을 포함하지 않는 성장 배지로 처리된 CG 또는 NG 세포에서 배경 발광을 추정합니다.

테트라사이클린 밀리리터당 1마이크로그램을 단독으로 함유하는 성장 배지에서 0.1% DMSO로 처리된 CG 또는 NG 세포에서 방출되는 발광 신호를 100% 상대 감마-세크레타제 활성으로 정의합니다. 마지막으로, 테트라사이클린과 CL-387, 785 또는 DAPT를 함유한 성장 배지로 배양된 CG 또는 NG 세포의 루시페라제 신호를 DMSO 처리된 CG 또는 NG 세포에서 방출되는 루시페라제 신호로 정규화합니다. 여기에 표시된 것은 CG 세포에서 APP-C99의 감마-세크레타제 절단의 정량적 측정을 보여주는 대표적인 결과입니다.

세포는 24시간 동안 섭씨 37도에서 테트라사이클린 밀리리터당 1마이크로그램의 존재 하에 CL-387, 785 또는 DAPT 1마이크로몰로 처리되었습니다. C99-GV의 감마-세크레타아제 매개 단백질 분해에서 유래한 발광은 루시페라제 분석 시약의 웰당 100마이크로리터를 첨가한 후 정량화되었습니다. 비히클만으로 처리된 세포에서 방출되는 루시페라아제 신호는 100% 상대 발광으로 설정되었습니다.

NG 세포에서 N-delta-E의 감마-세크레타제 절단의 정량적 측정을 보여주는 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 유사하게, 세포는 24시간 동안 섭씨 37도에서 테트라사이클린 밀리리터당 1마이크로그램의 존재 하에 CL-387, 785 또는 DAPT의 1마이크로몰로 처리되었습니다. N-delta-E-GV의 감마-세크레타아제 매개 단백질 분해에서 유래한 발광은 루시페라제 분석 시약의 웰당 100마이크로리터를 첨가한 후 정량화되었습니다.

비히클만으로 처리된 세포에서 방출되는 루시페라아제 신호는 100% 상대 발광으로 설정되었습니다. 이 기법을 완전히 익히면 검사할 화합물의 수를 결정하기 전까지 1-2시간의 실습 시간만 필요합니다. 개발 후 이 기술은 알츠하이머병 분야의 연구자가 알츠하이머병에 대한 새로운 치료법을 추구하기 위해 감마-세크레타제의 유전적, 화학적 변형을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.