Name: Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 γ-시크레타제 활성 정량화 방법을 세포 기반 루시퍼라제 기자 시스템을 활용하여 알츠하이머병 치료제 개발을 위한 효율적인 스크리닝 플랫폼을 구축하는 기술입니다.

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저자는 기술 지원에 대 한 연구소의 휴대 및 Organismic 생물학, 학계 Sinica의 핵심 시설을 감사합니다. 이 연구는 과학과 기술, 대만 (Y. f 가장 103-2320-B-001-016-MY3에 의해 지원 되었다 L.), 의약품 개발-기술 플랫폼 축 지원의 변환 혁신 프로그램 (Y. 플로리다에 NP7) 체계, 그리고 학계 Sinica (하 영-플로리다).

1. 해당 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-Secretase 분열 하는 Luciferase 기자 신호 측정
참고: CG과 셀20,21의 세대에 대 한 자세한 설명에 대 한 이전 게시를 참조 하십시오.
<ol><li>
NG 또는 CG 셀 씨앗 (20, 000 셀/잘) 200 μ/잘 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 플러스 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5 μ g/mL blasticidin, 250 μ g/mL 항생제 (예: 구성 된 성장 매체에서의 마지막 볼륨에 96-잘 microplates에 zeocin), 그리고 200 μ g/mL hygromycin B.
	<ol>
<li>hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>습도 CO2 배양 기에는 microplates를 전송 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 우물에서 성장 매체의 100 μ를 제거 합니다.</li>
	<li>성장의 100 μ/잘 추가 중 0.2% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 2 μ M와 2 μ g/mL 항생물질을 포함 하 고 중간 CL-387,785, 2 μ M N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT), 또는 기타 관련 ErbB1/ErbB2 억제제.</li>
	<li>치료 CG 나 니 셀 24 h에 대 한 37 ° C에서 microplates에 품 어.</li>
	<li>Microplates에서 150 μ/잘 성장 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>추가 50 μ/잘 luciferase 분석 시 약 ( 테이블의 자료를 참조 하시기 바랍니다).</li>
	<li>
발광 microplate 리더에는 microplates를 전송.
	<ol>
<li>부드러운 동요와 5 분 동안 실 온에서 microplates을 유지 관리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반딧불 luciferase (FL) 결정-발광 발광 microplate 리더에 저장 된 미리 정의 된 프로그램을 사용 하 여 방출.
	<ol>
<li>인스트루먼트 컨트롤 소프트웨어를 열고 (악기 자세한 재료의 표 참조).</li>
		<li>'도구' 메뉴에서 'Luminometry'를 선택 합니다.<ol>
<li>'매개 변수' 설정에서 세 시간에 대 한 방출 필터, 방출 조리개에 대 한 진드기 '정상' 입력 '1' '필터'를 선택 하 고 발광 읽기를 설정 하려면 '확인'을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>'악기 제어' 탭에서 활성 프로토콜 목록 하 고 발광을 읽기 위한 사전 저장된 프로토콜을 선택 합니다.</li>
		<li>'라이브 디스플레이' 탭 아래 풀 다운 목록에서 확장을 정의 하 고 형식에 대 한 '로그' 또는 '선'을 선택 합니다.</li>
		<li>'온도' 탭에서 접시 난방에 대 한 '끄기' 선택 합니다.</li>
		<li>읽고 발광을 수행 하려면 '시작' 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>필요에 따라, 제어 소프트웨어 내에 포함 된 '탐색기'를 사용 하 여 스프레드시트 형식으로 결과 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. γ-Secretase 활동의 정량화
<ol><li>
CG에 의해 방출 하는 발광 신호 또는 NG 셀 100% 상대 γ-secretase 활동으로 혼자 1 μ g/mL 항생물질을 포함 하는 성장 매체에 0.1 %DMSO 치료를 정의 합니다.
	<ol>
<li>성장 매체 항생물질을 포함 하지 않는 세포를 치료 하 여 cg로 또는 NG 셀에서 배경 발광을 견적 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Luciferase 신호 1 μ g/mL 항생물질을 포함 하는 성장 매체와 교양 하는 CG 나 NG 셀에서 정상화 하 고 셀 DMSO 치료 CG 또는 NG에 의해 방출 된 luciferase 신호 DAPT의 어느 1 μ M CL-387,785 또는 1 μ M (100% 상대 γ-secretase 활동으로 2.1에서 정의).</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
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<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
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<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

광고에 대 한 aducanumab immunotherapy의 단계 1b 재판에서 유망한 결과 단단히 광고22 의 병 인에 Aβ의 중요 한 역할을 설립 하 고 안티-Aβ 접근은 여전히 안티 광고 약물의 개발에 대 한 실행 가능한 전략을 제안. 여기, 우리는 애플 리 케이 션-C99 및 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 NΔE의 γ-secretase 촉매 베이스 측정을 위한 세포 기반 분석 설명 합니다. 응용 프로그램-C99 및 NΔE는 두 개의 가장 잘 공부 γ-secretase 기판 함께 γ-secretase13의 병원 성 및 생리 활동을 나타냅니다. CL 387,785에 의해 ErbB2 downregulation 우선적으로 애플 리 케이 션-C99의 정상 수준을 줄일 수 있습니다 및 분 비 Aβ은 현재 연구에서 설명 하는 γ-secretase의 기판 관련 세포 분석 실험에 의해 입증 추가 우리의 발견 현재 프로토콜은 따라서...

아 밀 로이드 β (Aβ)의 oligomeric 모양은 neurodegeneration Alzheimer의 질병 (광고)1에서 고통 받는 환자의 두뇌에서의 주요 원인이 될 것으로 추정 된다. Aβ 펩 티 드 그리고 γ-secretase2β-secretase에 의해 처음으로 녹말 체 선구자 단백질 (APP)의 stepwise 분열에 의해 생산 됩니다. 지난 10 년간에서 광고의 치료로 치료 접근 Aβ 생산3의 예방에 집중 했다. 연구의 대부분은 애플 리 케이 션의 γ-secretase 분열을 배제 하 고 그로 인하여 Aβ의 생산 또는 β-및/또는 γ-secretase 활동4의 금지를 감소 수 있는 α-secretase 활동의 확대에 집중 했다. 불행히도, 피할 수 없는 부작용에 β 또는 γ secretases 결과의 비 선택적인 억제는 β와 γ-secretase5,6의 다른 생리 적인 기판의 기능 방해 예정 이다. Γ-secretase 억제제에 관한 최근 연구 화학 및 유전 변조기 노치7의 필수적인 γ-secretase 중재 처리에 사소한 영향을 발휘 하는 동안 Aβ 생산을 통제할 수 있는 수의 발견 보고 그러나 ,,89,10,11,12,, 성공적인 치료 아직 개발 하지 않은. 따라서, 더 체계적인 스크린은 보증 소설 유전과 화학 한정자 선택적으로 γ-secretase 중재 애플 리 케이 션 처리를 조절 수 있습니다 발견.
Γ-Secretase 이상의 90 다른 막 정박 단백질을 쪼개로 알려져 있다. 이러한 기판 중 그 활동은 세포 운명 결정과 분화 개발13과정에 대 한 중요 한 단계가입니다. 선택적으로 변조 γ-secretase 촉매 응용 프로그램 부재에 처리에 영향을 미치는 노치의 처리 부작용에 대 한 최소화 노치 관련 γ-secretase 억제제의 필수적인 되며이 선택도 기본 요소가 될 것으로 생각 됩니다. 광고의 만성 치료에 대 한 잠재적인 γ-secretase 변조기의 생물학적 효능을 지정 합니다. 다양 한 arylsulfonamide 유도체, GSI-953 (begacestat) 등 BMS-708163 (avagacestat), γ-secretase14,15의 강력 하 고 선택적인 억제를 전시 발견 되었습니다 되었습니다. 이전 연구는 APP와 노치의 γ-secretase 분열의 차동 저해 조합 vivo에서 유효성 검사 zebrafish16를 사용 하 여 양이 많은 ELISA 기반 분석 결과 사용 하 여 관찰 될 수 있다 설명 했다. 또한, 세포 기반 분석 결과 패러다임 γ-secretase 애플 리 케이 션 및 노치17,18대의 잠재적인 기판 선택도 해결 하기 위해 설립 되었습니다. 여기 설명한 비슷한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 최근에 발견 (D)의 소설 클래스-potently 노치를 살려주는 선택도19APP의 γ-secretase 분열을 조절 하는 leucinamides. 함께,이 연구의 제공의 증거-개념 γ-secretase의 기판 선택/가용성 화학 변조 및 실험 검증 대상이 될 수 있는 개념을 지 원하는 됩니다. 그러나, 이러한 분석 결과 플랫폼 종종 상대적으로 낮은 처리량 판독 및 약물 발견 프로그램에 대 한 산업 표준에 맞지 수 있습니다 노동 집약적인 접근에 의존 합니다.
우리는 최근 셀 기반 luciferase 취재 원 유전자 분석 실험 양적 γ-secretase 두 가지 기판, APP (응용 프로그램-C99)의 99 아미노 산 성 C 터미널 단편과는 세포 외의 촉매 활동을 확인할 수 있는 생성 된 도메인 삭제 노치 펩 티 드 (NΔE)입니다. 애플 리 케이 션-C99 및 NΔE γ-secretase 다양 한 분석 실험에서의 직접 기판으로 널리 사용 되었습니다 있다. 균일 하 고 일관 된 luciferase 리포터 유전자 분석 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-secretase 분열에 대 한 생성, 우리 생성 한 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (CG) constitutively Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 (표현 하 Gal4-Luc)와 Gal4/VP16 태그 애플 리 케이 션-C99 융합 단백질 (C99-GV). 또한, constitutively Gal4 루크와 Gal4/VP16 태그 NΔE (NΔE-GV)를 표현 하는 또 다른 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (NG)를 생성 했습니다. 이러한 새로운 기판 전용 γ-secretase 분석 실험을 사용 하 여, 우리 이제 계량 하 고 γ-secretase 별개 기판 (애플 리 케이 션-C99 CG 세포에서) 또는 NG 셀에 NΔE로의 촉매 활동을 구별 하는 방법을 제공 합니다. 또한, 기판 전용 γ-secretase 분석 실험이 콘텐츠 심사 플랫폼에 도움이 되도록 설계 되었습니다. 이 새로 생성 된 γ-secretase 분석 도출 다음-세대 치료에 대 한 바람직하지 않은 노치 저해 하지 않고 Aβ 생산을 억제 하 여 인지 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 있는 소설 γ-secretase 변조기의 발견에 대 한 길을 닦은 수 있습니다. 광고.

<table><tbody><tr><td>VictorLight 발광 플레이트 리더</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Class II, Type 2 생물 안전 캐비닛</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 시리즈 A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12100046</td><td>성장 배지의 주요 구성 요소</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytomer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805 Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate</td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo luciferase assay reagent</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Humidified CO2 incubator</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>T-REx293 세포주</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 소프트웨어 버전 3.0</td><td>발광 마이크로플레이트 리더의</td> <td>PerkinElmer</td><td></td> 기기 제어 소프트웨어</tr></tbody></table>

Γ-secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

우리는 양적 측정 별개 기판의 γ-secretase 분열 하 셀 기반 리포터 유전자 분석 실험의 한 쌍을 개발 했습니다. 이 원고는 애플 리 케이 션-C99 또는 Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 노치의 γ-secretase 중재 분열을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 절차를 설명 합니다. 이 분석 실험 안정적으로 공동 Gal4 구동 luciferase 취재 원 유전자와 응용 프로그램 (애플 리 케이 션-C99;의 C-터미널 Gal4/VP16 태그 조각 HEK293 세포 transfecting에 의해 설립 되었다 Cg로 셀), 또는 Gal4/VP16 태그 노치-ΔE (NΔE; NG 셀)입니다. 동시에 이러한 기자 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 증명 하고있다 ErbB2 억제제, CL-387,785, 우선적으로 CG 셀에 애플 리 케이 션-C99 하지만 NG 셀에 NΔE 하지의 γ-secretase 분열을 억제 하실 수 있습니다. CL-387,785로 치료 하면 CG과 세포에 의해 전시 하는 차동 응답 γ-secretase 변조기에 대 한 선호 특성 나타내고 이러한 응답 γ-secretase DAPT에 의해 유도 된 팬 억제에 강한 대조에 있다. 우리의 연구는 다른 기판으로 γ-secretase 활동 세포 맥락에서 분화 될 수 있다 직접적인 증거를 제공 합니다. 이러한 새로운 분석 따라서 향상 된 광고 치료를 위한 약물 발견에 유용한 도구를 수 있습니다.

CL 387,785에 의해 ErbB2 저해에 의해 애플 리 케이 션-C99의 처리 홍보 차동 수 있습니다. Γ -secretase 노치 분열에 영향을 주지 않고 양적 특정 γ-secretase 기판의 분해 분열을 측정할 수 있는 세포 기반 분석 결과 설정 하는 항생물질을 유도할 수 있는 C 말기 Gal4/VP16 태그의 안정적인 공동 transfection에 의해 HEK293 파생 CG 셀 라인 생성 응용 프로그램-C99 고 Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 취재 원 유전자. 병렬 NG 셀 라인 NΔE의 γ-secretase 분열에 대 한 분석 결과를 또한 설립 되었다. NG 셀, 항생물질을 유도할 수 있는 C 터미널 Gal4/VP16 태그 NΔE와 Gal4 발기인 구동 luciferase 취재 원 유전자 안정적으로 공동 transfected HEK293 세포로...

우리는 성공적으로 두 기판 전용 γ-secretase 분석 생성 된 있다. 여기에 제시 된 두 세포 기반 분석은 계량 반딧불 luciferase 기자 들의 출력을 통해 γ-secretase 효소 활동 설계 되었습니다.

Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

감마-세크레타제에 대한 이 정량적 세포 기반 리포터 유전자 분석의 전반적인 목표는 감마-세크레타제 매개 절단에 대한 추정 감마-세크레타제 조절제의 차등 효과를 조사하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병 치료를 위한 새로운 감마-세크레타제 조절제의 식별과 같은 알츠하이머병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 고효율 분석 시스템이며 감마 세크레타제 조절제를 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 부작용을 최소화하는 항 AD 약물의 잠재적 발견을 통해 알츠하이머병 치료로 확장됩니다. 이 방법은 감마-세크레타제의 기질 선택성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 신경모세포종과 같은 다른 질병에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다.이 방법을 처음 사용하는 개인은 너무 많은 교란으로 인해 최종 결과가 복잡해질 수 있으므로 세포 배양 배지를 96 마이크로플레이트에 조심스럽게 제거하고 추가하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 참조된 대로 NG 및 CG 세포의 준비로 이 절차를 시작합니다. 혈구계로 NG 또는 CG 세포를 계수합니다.다음, 성장 매체에 있는 우물 당 200 마이크로리터의 마지막 양에 96 잘 microplate에 200 well당 200 세포에 20의 세포에 세포를 씨를 뿌립니다. 마이크로플레이트를 가습된 이산화탄소 인큐베이터로 옮기고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후 각 웰에서 100마이크로리터의 성장 배지를 제거합니다.0.2%dimethyl sulfoxide, 2개의 마이크로몰 CL-387, 785, 2개의 마이크로몰 DAPT 또는 기타 관련 ErbB1/ErbB2 억제제와 함께 1ml당 2마이크로그램의 테트라사이클린을 포함하는 성장 배지 웰당 100마이크로리터를 추가합니다. 처리된 세포와 마이크로플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 마이크로플레이트에서 성장 배지 웰당 150마이크로리터를 제거합니다.그런 다음 루시페라제 분석 시약 웰당 50마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 마이크로플레이트를 발광 마이크로플레이트 리더로 옮기고 실온에서 5분 동안 유지합니다. 발광 마이크로플레이트 리더에 저장된 사전 정의된 프로그램을 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 방출 발광을 측정합니다.먼저 기기 제어 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 도구 메뉴에서 Luminometry를 선택합니다. Parameters 설정에서 emi

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 테트라사이클린 유도 시스템을 사용하여 유전자 변형 인간 세포에서 γ-secretase 활성을 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 테트라사이클린으로 APP 유전자 발현을 유도하고, 아밀로이드 β 펩타이드를 생성하고, 루시페라아제 생산을 활성화하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 루시퍼라제-기질 반응으로 인한 생물 발광을 측정하여 γ-secretase 활성을 반영합니다.

인간 세포에서 γ-Secretase 활성을 측정하기 위한 Luciferase 분석

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

단백질 응집체 또는 단백질 요법 씨앗의 세포 간 이동은 신경 퇴행성 질환에서 병리학의 진행의 기초가 될 수 있습니다. 여기에서는 재조합 또는 생물학적 샘플에서 시딩 활성을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있는 새로운 FRET 유세포 분석 분석에 대해 설명합니다.

FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

계량 misfolded 단백질의 집계 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 세부 사항을 lentiviral 안정적인 셀 라인 생성, 자동된 confocal 영상, 및 단백질의 이미지 분석을 유도 한다. 설명 응용 프로그램으로 우리는 SOD1 집계 시간 복용량에 따라 방식에서 홍보에 작은 분자의 효과 공부 했습니다.

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 "고아" 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.

생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 기반 이미징 질량 분석기 (MALDI-IMS)와 분자 이미징 생물 학적 샘플에서 여러 analytes의 동시 매핑을 수 있습니다. 여기, 선물이 Alzheimer의 질병과 MALDI IMS를 사용 하 여 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy 샘플의 뇌 조직에 감지 및 아 밀 로이드 β 단백질의 시각화에 대 한 프로토콜.

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

이 프로토콜 셀룰러 맥락에서 본질적으로 낮은 활동, 단일 매출 효소의 분해 활동을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 특히,이 메서드는 PCSK9, 그 분해 활동은 그것의 궁극적인 노인 기능에 필요한 지질 대사의 핵심 드라이버의 분해 활동을 평가에 적용 됩니다.

단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

이 프로토콜은 베타 세포에서 인슐린 분비를 위한 프록시로 인슐린 연결된 Gaussia luciferase를 사용하여 중간 처리량에서 급속한 저비용 luciferase 분석기를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 이 분석은 대부분의 발광 플레이트 판독기 및 다중 채널 파이펫으로 수행될 수 있습니다.

공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정

이 프로토콜은 재조합 단백질 정제와 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 결합하여 신경 발달 장애와 관련된 유전적 변이가 탈유비퀴틸화 효소 활성에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

배우세요 γ-시크레타제 활성 정량화 방법을 세포 기반 루시퍼라제 기자 시스템을 활용하여 알츠하이머병 치료제 개발을 위한 효율적인 스크리닝 플랫폼을 구축하는 기술입니다.

Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

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