Name: 검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 학습하세요 ATR-FTIR 분광법과 다변량 데이터 분석을 활용하여 Plasmodium falciparum 감염 적혈구의 말라리아 기생충을 정량화하는 방법입니다. 이 기법은 현장 진단을 가속화하여 환자 결과를 개선할 수 있습니다.

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호주 연구 협의회에 의해 제공 된 저자에 게 자금 (BRW 미래 친목 FT120100926), 국가 건강 및 의료 연구 위원회의 호주 (프로그램 그랜트와 수석 연구 친목 JGB; 초기 경력 동호회 JSR; 연구 인프라 지원 체계 부여 버넷 연구소 연구소), 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 버넷 연구소를 부여. 우리 경 음악 지원 씨 Finlay 정강이 인정합니다.

적절 한 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하 고 적절 한 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 훈련을 추구 하십시오. BSL-2 캐비닛 무 균 기술을 사용 하 여, 의미 오염 제거 단계, 바늘 지팡이 상해, 및 생물 학적 노출 및 감염에서 유해한 UV 방사선에 노출의 모험 경우에 모든 자란 단계를 완료 해야 합니다 기생충 문화 어떤 상해를 입력합니다. 또한, 혈액 은행에서 주식 혈액은 특정 질병 및 혈액 질병 부담을 확산에 대 한 잠재적인 상영만 잠재적인 위험. 상해의 발생에 즉각적인 의료 처치를 추구 합니다.
1. 준비 및 3D 7의 측정 변형 체 falciparum 기생충 희석 시리즈
참고: 변형 체 sp. 문화는 매우 중요 한. 신선한/만료 시 약을 사용 하 고 미디어를 변경 하 여 기생충을 정기적으로 피드. 5 %parasitemia; 두 번째 매일 아래 피드 문화 하루에 한 두 번; 6-10 %parasitemia 사이의 문화를 피드 그리고 하루에 4 회 11 ~ 20% 사이의 문화를 피드. 기생충을 굶 어 시작 하는 그들의 모양을 분실 하 고 계약을 시작 합니다. 이러한 경우, 피드 및 미디어 변경 하 고 추가 주식 Rbc. 수집 기증자 혈액 혈액 컬렉션 튜브 응고 제 및 첫 번째 6 h 내에서 측정값으로 헤 파 린을 포함 하 여 즉시 희석.
<ol><li>문화 3D 7의 30 mL의 총 변형 표준 프로토콜에 따라 변형 체 falciparum 기생충은 parasitemia 10% 반지에 도달할 때까지.</li>
	<li>
기생충의 동기화
	<ol>
<li>기생충의 수명 주기에 shizogeny 후 11 h resuspend 문화 및 자동된 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브로 전송.</li>
		<li>300-400 g x 5 분에 대 한 표준 실험실 조건 (25 ° C와 100 kPa)에 문화 원심</li>
		<li>피 펫 그리기 또는 진공에는 펠 렛을 방해 하지 않고 연결 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 여는 상쾌한을 제거 합니다. 10% 표 백제 솔루션으로 폐기물 미디어를 삭제 합니다.</li>
		<li>천천히 자동된 피 펫을 사용 하 여 펠 릿을 4 %sorbitol 솔루션의 12-15 mL을 추가 하 고 상한 및 문화는 균질 성 때까지 튜브를 거꾸로 하 여 문화를 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 37 ° C에서 문화를 품 어.</li>
		<li>300-400 g x 5 분에 대 한 표준 실험실 조건에서 문화 원심</li>
		<li>1.2.3 단계에서 설명한 대로 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>펠 릿을 0.9% 염 분의 10-15 mL을 추가 하 고 상한 및 문화는 균질 성 때까지 튜브를 거꾸로 하 여 솔루션을 혼합.</li>
		<li>단계 1.2.6–1.2.8 sorbitol의 모든 잔재를 씻어 두 번 더 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Parasitemia 희석 시리즈의 준비
	<ol>
<li>세척 단계 1.2.6–1.2.9에서 Rbc 증권.</li>
		<li>표준 실험실 조건, 5 분 동안 300-400 x g에서 Rbc 증권에서 문화 원심 하 고 상쾌한 1.2.3 단계에서 삭제.</li>
		<li>0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% 및 1.000%, microcentrifuge 튜브 라벨 고 0 µ L, 1 µ L, 2.5 µ L, 7.5 µ L, 10 µ L, 25 µ L, 75 µ L 및 문화의 각각 0.2-20 µ L 피 펫을 사용 하 여 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>추가 100 µ L, 99 µ L, 97.5 µ L, 92.5 µ L, 80 µ L, 75 µ L, 25, 0 µ L 재고 RBCs의 관 이라는 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750%, 및 1.000%, 각각.</li>
		<li>분리기 신선한 기증자 혈액 항 응 혈 약 튜브 1200 x g 및 10 분에 대 한 표준 실험실 조건에서 수집.</li>
		<li>플라즈마는 피 펫 드로잉 하 고 1.2.3 단계에서 설명한 대로 삭제 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>각 microcentrifuge 튜브로 격리 된 RBCs의 900 µ L을 추가 하 고 10 배를 반전 하 여 철저 하 게 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스펙트럼 획득
	<ol>
<li>동반 스펙트럼 수집 프로그램을 사용 하 여, "악기 설정"을 클릭 하 고 다음에 데이터 컬렉션 매개 변수를 설정: 배경에; 128 검색 32 스캔 샘플; 그리고 8/cm 악기의 최대 샘플 범위를 해결.</li>
		<li>하룻밤 또는 제조업체의 추천 당 ATR FTIR 계의 온도 설정 합니다.</li>
		<li>크리스탈 원형 모션 린 트를 사용 하 여 무료 잎사귀 초순 물 적셔 부드럽게 닦 고 하 여 청소. 다음 다른 린 트 무료 지우기를 사용 하 여 완전히 건조 합니다.</li>
		<li>"배경 측정"를 클릭 하 여 공기의 배경 측정을 가져가 라. 모든 20 분 단계 1.4.3에서 크리스탈을 청소 하 고이 측정을 반복.</li>
		<li>"미리 보기"를 클릭 하 여 라이브 뷰를 엽니다. 크리스탈이 깨끗 한 나타내는 평면, 수평 기준선을 관찰 합니다.</li>
		<li>10 µ L의 중간에 직접 이온된 수의 플라스틱을 "샘플 측정"을 클릭 합니다. 모든 5 샘플 후이 물 측정을 반복 합니다.</li>
		<li>크리스탈 린 트 무료 지우기와 부드러운 원형 모션을 사용 하 여 건조.</li>
		<li>플라스틱 샘플의 10 µ L을 "샘플 측정"을 클릭 합니다.</li>
		<li>크리스탈 단계 1.4.3에서 샘플 사이 청소.</li>
		<li>3 복제 인수, 샘플 및는 복제의 순서를 무작위로 확인 될 때까지 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 다변량 데이터 분석 (MVDA)
참고: 데이터 처리 수행 되어야 합니다 전체 데이터 집합을 통해 소음과 비 생물학 근원의 봉우리의 추가 피하기 위하여. 반면, 생물학으로 관련 된 지구에 분석: 2980-2800/cm와 1750-850/cm.
<ol><li>
데이터 처리 참고: 두 개의 소프트웨어, 예를 들면, Matlab (향후 소프트웨어 1 이라고 함)와 (이제 소프트웨어 2 라고도 함)는 Unscrambler X MVDA에 대 한 예제로 사용 됩니다. 소프트웨어 1은 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 추가 없이 MVDA 수행 수 있습니다. 그러나, GUI (테이블의 재료)를 구입 하는 것이 좋습니다. 가정 것 이다 소프트웨어 1 참조 하는 경우 다음 지침에 따라 상업적으로 사용할 수 있는 GUI 도구 상자와 함께에서 이며 예제 데이터 처리 스크립트 첨부 되었습니다.<ol>
<li>적절 한 다변량 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다, 그리고 "데이터 가져오기"를 클릭 하 고 분석을 위해 파일의 유형을 선택 합니다.<ol>
<li>1 소프트웨어에서 GUI를 열려면 명령 창에 "분석"을 입력 합니다. 오른쪽 X 상자 찾을 "데이터 가져오기"를 클릭 합니다.</li>
			<li>2 소프트웨어에서 "가져오기"를 찾으려고 "파일" 탭을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>별도로 각 집합에서 모든 스펙트럼을 선택 하 고 "열기"를 클릭 하 여 작업 영역에 데이터 집합으로 샘플, 물, 기준선 스펙트럼을 가져올 고 각 설정 예를 들어, '와트' 물 스펙트럼의 데이터 집합에 대 한 짧은 이름을 합니다.</li>
		<li>"새로운 행렬/벡터"를 클릭 하 여 새 테이블/행렬을 선택 하 고 n은 샘플의 수 n × 1 벡터를 생성. 각 샘플의 parasitemia를 입력 하 고 이름을 벡터는 'Parasitemia'.<ol>
<li>1 소프트웨어에서 명령 창에 있는 "새 변수"을 클릭 합니다.</li>
			<li>2 소프트웨어에서 "새로운 매트릭스" 아이콘을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>"플롯 데이터 아이콘"을 클릭 하 여 데이터를 플롯 합니다. "확대"를 클릭 하 여 확대 1800-1400/cm; 수증기 효과 대 한 스펙트럼을 검사 가장 명확 하 게 관찰는 아 미드의 경사면을 따라 짧고, 날카로운, 좁은 봉우리로 나 아 미드 II 밴드.</li>
		<li>극단적인 수증기의 경우, 편집/사전 과정 데이터 탭을 열고 "스무 딩"을 선택 합니다. 잡음 및 강한 수증기 기여 스무 딩의 최대 25 포인트를 사용 하 여 샘플 및 물 스펙트럼을 부드럽게 하 여 줄이거나 수증기 수정 방법을 사용 하 여.</li>
		<li>2.1.4 단계에서 동일한 편집/사전 과정 데이터 탭에서 해당 되는 경우 기본 보정 알고리즘을 사용 하 여 올바른 비 수평 기준선.</li>
		<li>물 스펙트럼 평균 샘플 데이터 집합에 해당 n × m 행렬에 행을 복사 하 고 0.7을 곱하여 70% 강도를 감소.<ol>
<li>1 소프트웨어에서 그렇게 명령 창에서 다음 스크립트 "AverageWater=mean(WaterDataset)"를 입력 하 여. 그런 다음 복사-붙여넣기 행 일치 하는 샘플 데이터 집합을. 농도를, 입력 "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 샘플의 스펙트럼에서 평균 물 스펙트럼을 뺍니다.<ol>
<li>1 소프트웨어에서 그렇게 명령 창에서 다음 스크립트를 입력 하 여 "WaterCorrectedData SampleDataset-AverageWater70 =".</li>
		</ol>
</li>
		<li>두 번째 파생 기능을 적용 하 고 다음 단일 정상적인 변량 (SNV) 기능을 선택 하 여 데이터를 정규화 센터 데이터 의미 편집/사전 과정 데이터 탭을 엽니다.<ol>
<li>1 소프트웨어에서 한 가지에 이렇게. 먼저 "" 및 스무 딩, 3의 다항식 순서 및 스무 딩의 25 점과 Savitzky Golay 함수를 사용 하 여 설정 하는 샘플에 파생 순서 입력된 25 포인트를 선택 합니다. 다음 선택 "SNV"와 "센터"를 의미 합니다. "좋아/적용"을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>편집/사전 과정 데이터 탭을 열고 선택한 변수에"열", 2980-2800/cm와 1, 750-850/cm 그들의 상자를만 났는 다는 것을 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
데이터 분석
	<ol>
<li>주요 구성 요소 분석 (PCA)<ol>
<li>클릭 "분석 | 분해"고 선택 PCA입니다.<ol>
<li>1 소프트웨어에서 "빌드 모델"을 클릭 합니다.</li>
				<li>2 소프트웨어에서 PCA 메서드를 입력 합니다. 이 작품에서-7-주 구성 요소 (PCs)의 최적의 수 입력 100 번 및 유효성 검사 방법에 대 한 선택 교차 유효성 검사의 최대. "실행"을 클릭 합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>95% 신뢰 한계, p c 1과 PC2 사이 점수 플롯에서 점선된 반지를 관찰 합니다.</li>
			<li>샘플 스펙트럼으로 잠재적인 outliers "선택 스펙트럼 도구"를 사용 하 여도 밖에 서 발생 하는 점수를 표시 합니다.</li>
			<li>만약 표시 된 스펙트럼 높은 Hotellings T2 값과 높은 Q 오차 제외 그들 추가 분석에서.</li>
		</ol>
</li>
		<li>부분 최소 제곱 회귀 (PLS-R)<ol>
<li>클릭 "분석 | 회귀"그리고 선택" PLS-R ".<ol>
<li>소프트웨어 1, 오른쪽 Y 블록을 클릭 하 고 선택 벡터 "Parasitemia | 모델 작성할 ".</li>
				<li>2 소프트웨어, PLS-R 메서드를 입력 합니다. "Y" 및 샘플 데이터 집합으로 "X 데이터 집합" 및 유효성 검사 방법으로 선택 교차 유효성 검사로 벡터 "Parasitemia"를 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>회귀 모델을 분석 합니다. 0.80 및 교차 유효성 검사 (RMSECV) 값을 0.1 %parasitemia 보다는 더 적은의 평균 제곱근 오차 R2 값은 수락 가능한 모델입니다.</li>
			<li>회귀 벡터 분석 및 생물 학적 밴드를 식별 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2016/report/en/">World Malaria Report 2016</a>. , (2016).</li>
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<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
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<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

PLS-R 모델은 Y 선형 관계를 찾는 감독된 복수 방법 = bX + E, 예측 변수 X 사이 (여기에서, 각 wavenumber에 흡 광도)와 연속 변수 Y (여기, parasitemia 수준). 모델 변수 x Y, X 상관에 차이 캡처 잠재 변수 (LVs)의 새로운 집합을 만들 결합 하 고 회귀 벡터 (b)를 계산 하는 즉, 새로운 스펙트럼 결과 y 값의 추정에 의해 하는. 모델의 강도 두 값에서 반입할 수 있습니다: R2 값과 평균 제곱근 오차의 교차 유효성 검사 (RMSECV). 전 설명 모델과 따라서 견고성의 선형성 (가까이 그것은 1로 더 나은) outliers 및 시끄러운 데이터에 대 한 R2 값이 0.8 보다 작은 모델에 대 한 데이터를 신중 하 게 검토 되어야 합니다. RMSECV 값 예측을 만들 수 있는 오류를 설명 합니다. 그것은 항상 최선을 시도 하 고 신중 하 게 데이터를 처리 하는 이상 값을 제외 하 여이 수 가능한 최소화 하 고 가능한 많은 생물 복제는 확인 하는...

말라리아는 우리 시대의; 가장 치명적인 질병 중 하나입니다. 발병 지역에서 위험이 절반 이상의 인구가 살고 그리고 그것은 어울리지 않게 가난한1,2,,34짐. 문제의 큰 부분 무 증상 사업자 및 초기 단계 환자5모기 벡터 대 한 저수지 역할을 젖은 계절 중에 감염의 스파이크를 일으키는 원인이 되 고 지역 사회에서 계속 하 허용 이다. 말라리아는 가장 치명적인 질병2의 가장 심각한 형태를 일으키는 원인이 되는 P. falciparum 은 5 변형 체 기생충에 의해 발생 합니다.
현재, 말라리아의 진단 위한 기술을 완벽 미만입니다. 광학 현미경 검사 법, 현재 골드 표준만 사용 되는 방법6에 따라 62-88 기생충 / µ L를 검색할 수 있습니다. 많이 하 고 많은 지역 현미경 오진에서 요구 하는 높은 기술 때문에 또한, >의 경우 50%, 특히 그 낮은 parasitaemia 레벨2는 직접의 영역에 리소스 부족에 기 인할 수 있다 안티-말라리아 약의 오용입니다. 다른 2 주요 진단 메서드는 급속 한 진단 테스트 (RDTs), 검색 및 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험, 차별 하 고 계량 DNA에서 기생충에 대 한 항 체를 활용 하는. 현재, RDTs만 치료 되는 질병의 희귀 한 형태로 발생 하는 혈액의 적어도 100 기생충 / µ L의 P. vivax 그리고 P. falciparum 감지 수 있습니다. 7 , 8 반대로, PCR 분석 실험 차별 및 감도 0.0004-5의 변형 체 의 종 계량 기생충 / µ L의 혈액. 그러나, 그것은 비싼 시 약, 장비 및 기술, 필요 하 고 따라서 필드 응용 프로그램에 적합 하지 않습니다.
매우 민감한, 안정적이 고 저렴 한 기술 때 진단 시간을 따라서 환자 결과 개선 및 질병 제거를 가능 하 게 하 고 향상 시키기 위해 필수적 이다. 감쇠 총 반사 푸리에 변환 (ATR FTIR) 분광학이이 문제에 대 한 잠재적인 해결책을 제공합니다. 이전 작업으로 감지 하 고 고정 피 영화의 검출 한계를 달성 하는 메탄올에 P. falciparum 계량 가능 했다 나타났습니다 < 혈액의 1 기생 / µ L (< 0.0002 %parasitemia)9, PCR 방법에 비해. 최근 연구 결과 검출 및 계량 수성 샘플에서 기생충 따라서 정착 단계를 제거 하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 수증기, 스펙트럼 잡음 및 데이터 처리 같은 요인 최적의 결과10고려 될 필요가 있다.
이 프로토콜 ATR FTIR 스펙트럼을 취득 하 고 수성 적혈구 (RBC) 샘플10 P. falciparum 에의 검출에 대 한 회귀 모델을 준비 하는 방법 새 사용자를 표시 하는 것을 목표로.

<table><tbody><tr><td>헌혈자 혈액</td> <td>-</td><td></td> <td>숙련 된 의사가 수집해야합니다</td></tr><tr><td>재고 혈액</td><td>호주 적십자사</td> <td>'</td>-<td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>The Burnet Institute-Laboratory</td><td></td> <td>균주 야생형 등가</td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체 (중탄산 나트륨이없는 L-hepes 시</td><td>그마 Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>50mL 팔콘 튜브에 부분 표본을 넣고 냉동고에 보관</td></tr><tr><td>중탄산</td>나트륨 <td>시그마 알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>giemsa 염색</td><td>시그마 알드리치</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S1876</td><td>배양에 사용하기 전에 여과해야 함</td></tr><tr><td>채혈 튜브(진공 청소기)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>침지 오일</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25mL 피펫 팁</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10mL 피펫 팁</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>자동화된 피펫 컨트롤러</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R 원심분리기</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 직접 열 CO2 인큐베이터</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 쌍안 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>구매할 때 100x 렌즈가 오일인지 확인하십시오. 침수 렌즈</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR 분광계 ATR 퀵 스냅 어태치먼트</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td> Matlab Mathworks Inc <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>다변량 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>The Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>다변량 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td> 구매 시 "Eco-ATR" 첨부 파일을 요청하십시오.<td></td><td>Matlab용 GUI</td></tr></tbody></table>

검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

복수 데이터 분석 (와 함께에서 간단한 벤치탑 감쇠 총 반사 푸리에 변환 적외선 (ATR FTIR) 분석기를 사용 하 여 정량화 하는 방법 및 수성 적혈구 (Rbc)에 기생충의 탐지 설명 MVDA)입니다. 3D 7 P. falciparum 10 %parasitemia 링 무대 기생충에 교양 있었다 및 시리즈를 만들 희석 0-1 사이의 절연 신선한 기증자 Rbc 스파이크 사용 %. 10 µ L 각 샘플의 스펙트럼을 얻으려고 ATR 다이아몬드 윈도우의 중앙에 배치 했다. 샘플 데이터 취급 신호 대 잡음 비를 개선 하 고 물의 기여를 제거 하 고 두 번째 파생 스펙트럼 기능 해결에 적용 했다. 데이터 다음 MVDA의 두 종류를 사용 하 여 분석 했다: 어떤 outliers 그리고 부분 최소 제곱 회귀 (PLS-R) 정량화 모델 확인 첫 번째 주요 구성 요소 분석 (PCA).

부분 최소 제곱 (PLS-R) 플롯 및 그것의 관련 된 회귀 벡터, 그림 1a 및 1b 각각 기생충에서 신호는 충분히 Rbc 양식에 사용 되는 선형 회귀 모델에 사용할 수 있는 다른 표시는 미래의 데이터 세트에서 기생충 예측
강력 하 고, 선형 PLS-R 모델 0.87의 R-제곱 값이 생성 하 고 루트 평균 제곱 그림 1a0.13 %parasitemia 교차 유효성 검사 오류 (RMSECV). 증가 parasitemia 레벨은 주로 관련 된 핵 산 밴드, 특히 1042, 1083 1226/cm, RNA ribose에서는 ν(C=O)에 할당 되는 그룹, νs(포4-)와 ν는는</su...

여기, 선물이 탐지 및 정량화의 변형 체 falciparum 감염 수성 적혈구 감쇠 총 반사 적외선 분석기 및 다변량 데이터 분석을 사용 하는 프로토콜.

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

이 절차의 전반적인 목표는 다변량 데이터 분석을 가진 ATR-FTIR 분광법을 사용하여 말라리아 기생충증의 예측을 위한 회귀 모형을 구축하는 것입니다. 이 방법은 미래에 환자 결과를 개선하는 데 도움이 될 수있는 치료 시점 진단을 신속하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모델이 구축하는 데 시간이 걸릴 수 있지만 휴대성이 뛰어나고 사용자 친화적이며 매우 민감하며 비용이 낮다는 것입니다.이 방법은 말라리아 기생충의 정량화를 가능하게 하지만, 항균제로 인한 기생충 조성의 변화와 같은 환경 변화에 대한 현상적 반응을 관찰하는 데도 사용될 수 있다. 아이디어는 우리가 말라리아 감염한 세포에 호주 싱크로트론에서 한 일에서 개발했습니다. 이것은 단세포 수준에 있었습니다.거기에서, 우리는 실제로 진단 시험을 개발하기 위하여 ATR-FTIR 분광기를 사용하기로 결정했습니다. 동기화 절차를 시작하기 전에, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 3D7 균주 플라스모듐 팔시파룸 기생충의 문화 30 밀리리터. 자동 파이펫을 사용하여 문화를 다시 중단하고 50밀리리터 원유형 튜브로 전송합니다.원심 분리는 5 분 동안 표준 실험실 조건하에서 300 ~ 400 배 g에서 배양합니다. 펠릿을 방해하지 않고 자동화된 파이펫으로 그려서 상체를 제거합니다. 폐기물 미디어를 10% 표백액으로 폐기합니다.펠릿에 4%의 소르돌 용액의 12~15밀리리터를 천천히 추가하고 문화가 균일해질 때까지 튜브를 캡핑하고 반전시켜 배양을 혼합합니다. 15분 동안 섭씨 37도에서 문화를 배양합니다. 15분 후, 원심분리기를 5분간 양해합니다.자동 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. 펠릿에 0.9%의 식염수 10~15밀리리터를 넣고 배양이 균일해질 때까지 튜브를 캡핑하고 반전시켜 용액을 혼합합니다. 원심분리및식염액을 두 번 더 씻어 서 소르비톨의 모든 잔해를 제거한다.이 절차를 시작하려면, 재고 적혈구 또는 RbC. 상체를 제거하고 총 3 번 0.9 %의 식염수로 씻어. 주식 RBC와 문화를 5분 동안 300~400회 g로 원심분리하고 각 튜브에서 상퍼를 폐기합니다.표시된 대로 8개의 미세원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 0.2 ~ 20 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 각 튜브에 적절한 양의 배양을 추가하십시오. 다음으로, 원하는 기생충 희석을 얻기 위해 각 튜브에 적절한 양의 스톡 RBC를 추가한다.10 분 동안 1, 200 배 g 및 표준 실험실 조건에서 항응고관에서 수집 된 신선한 기증자 혈액 원심 분리. 파이펫으로 플라즈마를 제거하고 10 % 표백제 용액으로 폐기하십시오. 각 마이크로센심분리기 튜브에 900마이크로리터의 마이크로리터를 추가하고 10번 반전하여 철저히 섞습니다.간단한 벤치탑 감쇠 총 반사 푸아로 변환 적외선, 또는 ATR-FTIR 분광계스펙트럼을 획득하는 데 사용됩니다. 초순수물로 감쇠된 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 크리스탈을 원형 으로 부드럽게 닦아 크리스탈을 준비하고 청소합니다. 그런 다음 다른 보풀이없는 닦기를 사용하여 크리스탈을 완전히 건조시하십시오.배경 측정을 클릭하여 공기의 배경 측정을 수행합니다. 20분마다 크리스탈을 청소하고 이 측정을 반복합니다. 미리 보기를 클릭하여 라이브 뷰를 엽니다.결정이 깨끗하다는 것을 나타내는 평평한 수평 기준선을 관찰합니다. 파이펫 10 마이크로리터의 탈이온화된 물은 크리스탈 의 중앙에 직접 정수및 측정 샘플을 클릭합니다. 보풀이 없는 와이프와 부드러운 원형 동작으로 크리스탈을 건조시다.파이프 10 마이크로리터의 샘플은 결정의 중간에 측정 샘플을 클릭합니다. 샘플 사이에 결정을 청소합니다. 이 데모에서는 MATLAB을 사용하여 다변량 데이터 분석을 수행합니다.데이터 처리를 시작하려면 명령 창에 입력 분석을 입력하여 그래픽 사용자 인터페이스를 엽니다. X 상자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 가져오기 데이터를 찾습니다. 분석을 위해 파일 유형을 선택합니다.샘플, 물 및 기준 스펙트럼을 각 집합의 모든 스펙트럼을 별도로 선택하고 열기를 클릭하고 각 집합에 짧은 이름을 지정하여 데이터 집합으로 데이터 집합으로 가져옵니다. 명령 창에서 새 변수를 클릭하고 벡터에게 파라사이트미아라는 이름을 지정합니다. 각 샘플의 기생충증을 입력합니다.X 상자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 플롯 데이터를 찾습니다. 데이터 플롯 아이콘을 클릭하여 데이터를 플롯합니다. 확대/축소를 클릭하고 1, 800에서 1, 400센티미터를 확대하여 수증기 효과에 대한 스펙트럼을 검사하며, 가장 명확하게 아미드 I 와 Amide II 대역의 경사면을 따라 짧고 날카롭고 좁은 봉우리로 관찰됩니다.극단적인 수증기의 경우 사전 처리 편집 데이터 탭을 열고 스무딩을 선택합니다. 시료 및 수분 스펙트럼을 부드럽게 하여 소음 및/또는 강력한 수증기 기여도를 줄입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 데이터 처리 후 데이터 편집 탭을 열고 열 변수에서 상자만 체크하여 2980~2800cm 및 1750~850cm를 선택합니다.이제 데이터가 분석을 위해 준비되었습니다. 주 성분 분석 또는 PCA를 수행하려면 분석 분해를 클릭하고 PCA를 선택합니다. 모델 빌드를 클릭합니다.PC 1과 PC 2 사이의 점수 플롯에 95 %의 신뢰 도면, 파선 링을 관찰합니다. 스펙트럼 선택 도구를 사용하여 한도 외부에서 발생하는 점수와 샘플 스펙트럼을 잠재적 이상값으로 표시합니다. 부분 최소 제곱 회귀 또는 PLSR을 수행하려면 분석 회귀를 클릭하고 PLSR을 선택합니다.Y 블록을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 벡터 Parasitemia 빌드 모델을 선택합니다. 회귀 모델 및 회귀 벡터를 분석하고 생물학적 대역을 식별한다. RBC의 부분 최소 사각형 회귀 플롯은 0에서 1% 사이로 급증하여 R-제곱 값0.87및 루트 평균 제곱 교차 유효성 검사 오류 0.13%의 파라사이트미아를 생성했습니다.이는 x축에 알려진 기생충증과 y축의 예측된 기생충증을 가진 각 샘플에서 기생충증을 예측하는 모델의 능력을 보여줍니다. 관련 회귀 계수는 모델의 예측 능력에 대한 각 밴드의 기여도를 설명합니다. 밴드가 더 강렬할수록 모델에 더 많이 기여하며, 따라서 기생충이 혈액의 화학 적 조성을 어떻게 변화시키는지.결과는 기생충의 신호가 향후 데이터 집합에서 기생충의 예측을 위한 선형 회귀 모델을 형성하는 데 사용할 수 있는 RBC와 충분히 구별된다는 것을 보여줍니다. 일단 마스터되면, 이 기술은 제대로 수행하면 샘플 당 3 분 미만 걸릴 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 잔류물의 ATR 결정을 청소하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, P vivax와 P 말라리아 와 같은 그밖 말라리아 종은 종을 구별하기에 충분히 민감한 ATR-FTIR 분광기같이 대답하기 위하여 모델링될 수 있습니다? 개발 후, 이 기술은 생체 분화 분야의 연구원들이 다른 혈액 매개 병원체의 검출 및 정량화를 탐구하고 포도당및 우레아와 같은 혈액에서 분석할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 회귀 모델을 구축하기 위해 ATR-FTIR 분광및 NVDA 분석을 잘 이해해야 합니다.환자 혈액 및 말라리아 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 적절한 생체 안전 수준 훈련 및 봉쇄는 이 절차를 시도할 때 항상 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

유전자가 말라리아에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 이내 Plasmodium 감염을 예방의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 plasmodium 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. gametocyte 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액을 준비하고 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기와 감염 표현형 결정에서 Plasmodium falciparum 감염에 대한 프로토콜

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

이 동영상은 단핵구에 의해 표지되고 옵소니화된 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구를 포함하는 유세포 분석 기반 식세포작용 분석을 보여줍니다. 유세포 분석은 단핵구에서 형광을 식별하여 식세포작용을 통해 옵소니화된 적혈구의 성공적인 식별을 확인합니다.

기생충에 감염된 적혈구의 항체 매개 식세포작용(Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes)을 정량화하기 위한 분석

hemozoin의 상자성의 특성은 월말 단계를 분리하는 데...

의 분리<em&gt; Plasmodium falciparum</em자기 수단으로&gt; 늦은 단계에 감염된 적혈구

항체의 기능을 측정하는 것은 변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성을 이해하는 열쇠입니다. 이 방법은 가능한 merozoites의 정화 및 유동 세포 계측법에 의해 옵 소닌 의존 식균 작용의 측정에 대해 설명합니다.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

적혈구 내에서 말라리아 기생충 침입하여 및 복제합니다. merozoite 침공과 기생충의 정확한 평가는 말라리아 감염의 과정을 평가에 따라서 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 말라리아의 마우스 모델에서 이러한 매개 변수의 측정을위한 기반 프로토콜 유동 세포 계측법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의해 쥐 말라리아 기생충의 생체 내 평가와 Merozoite 침공

인간 microRNA는 숙주 적혈구에서 Plasmodium falciparum 기생충으로 전위합니다. 여기에서는 합성 microRNA를 숙주 적혈구로 transfection하고 P. falciparum에서 모든 RNA를 분리하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다.  또한 이 논문에서는 기생충 전사체의 리보솜 점유 및 번역 가능성을 결정하기 위해 P. falciparum에서 폴리솜 분리 방법을 자세히 설명합니다.

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Plasmodium falciparum 감염에 자연적으로 드러나는 개인의 혈장 또는 혈장에 존재하는 항체의 용량을 측정하는 방법에 대한 지침을 제공하여 기생충에 감염된 적혈구 (IEs)의 phagocytosis를 opsonize 및 유도하는 것입니다.

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정

이 프로토콜은 모기에서 타액선 포자석을 검출하기 위한 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석을 설명합니다. 쉽게 구할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 이 방법은 Plasmodium falciparum 또는 Plasmodium vivax를 운반하는 모기를 비용 효율적으로 고처리량으로 검출할 수 있습니다. 이 방법은 매개체 조사를 포함한 말라리아 전염 연구에 적합합니다.

효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 Anopheles 모기의 Plasmodium sporozoites 검출

표준 막 공급 분석(SMFA)은 잠재적인 항말라리아 화합물의 평가 및 식별을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 이 인공 먹이 시스템은 Plasmodium falciparum 기생충의 강도와 유병률에 대한 이러한 화합물의 영향을 추가로 평가하기 위해 모기를 감염시키는 데 사용됩니다.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

여기서 우리는 감염의 혈액 단계에서 Plasmodium 에 대한 세포 면역의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 새로운 방법을 설명합니다. 이것은 세포 독성 림프구에 의한 감염된 적혈구 사멸을 측정하는 시험관 내 분석입니다.

체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석

학습하세요 ATR-FTIR 분광법과 다변량 데이터 분석을 활용하여 Plasmodium falciparum 감염 적혈구의 말라리아 기생충을 정량화하는 방법입니다. 이 기법은 현장 진단을 가속화하여 환자 결과를 개선할 수 있습니다.

검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화

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