2.15: 핵 자기 공명 (NMR) 분광기

1. NMR 시작 재료의 준비

1. 깨끗한 NMR 튜브에 ~ 10 mg의 시작 재료를 추가합니다.
2. 시작 물질을 ~0.7mL 의 유족 용매(예: CDCl_3)로용해한다. 좋은 스펙트럼에 대한 용매의 적절한 높이는 4.5-5cm이다.
3. NMR 튜브를 조심스럽게 캡에 캡하고 캡에 샘플 이름을 작성합니다.
4. 샘플을 부드럽게 흔들어 모든 재료가 용해되었는지 확인합니다. 용매와 캡 사이의 접촉을 피하기 위해주의, 이는 샘플의 가능한 오염으로 이어질 수 있습니다.
5. NMR 튜브를 조심스럽게 스피너에 삽입합니다. 스피너는 자석에 삽입되면 회전하여 전체 샘플이 균일한 자기장을 경험하도록 합니다. 지문과 먼지를 제거하기 위해 NMR 튜브와 스피너의 외부를 2 프로판올 및 실험실 조직으로 청소하십시오.
6. 스피너를 샘플 깊이 게이지에 배치하여 NMR 튜브의 바닥이 분광기를 손상시킬 수 있는 NMR 프로브에 너무 멀리 삽입되지 않도록 합니다. 다른 프로브는 샘플 깊이가 다르며 사용자는 특정 깊이 게이지를 알고 있어야 합니다.
7. 샘플을 NMR 분광계에 배치합니다. 여기서 자동 샘플러가 장착된 바리안 400 MHz 분광계가 사용되었습니다.
8. NMR 측정이 완료된 후 스펙트럼을 처리하고 스펙트럼의 피크를 할당합니다.

2. 3 M NaOH 및 찰콘 합성 준비

1. 추가 60 mg NaOH 에 50 mL 볼륨 플라스크.
2. 플라스크의 절반에 탈이온수를 추가하여 NaOH를 녹입니다. 마크에 도달할 때까지 물을 더 추가하여 용액을 더 희석시.
3. 마그네틱 스터디 바가 장착된 50mL 라운드 하단 플라스크에 10mL 에탄올을 넣습니다.
4. 그 후, 680.5 mg 4-메톡시벤잘데히드와 5mL NaOH 용액을 동일한 플라스크에 2.1단계로 제조하였다.
5. 671 mg 4-메틸레이스토페논을 교반 용액에 넣고 플라스크를 캡하고 실온에서 저어줍니다.
6. 시작 재료의 전체 소비까지 30 분 간격 (3 단계 참조)에서 ¹H NMR에 의해 반응의 진행 상황을 모니터링합니다.
7. 반응이 완료되면 5mL 물을 추가합니다(~3h). 생성된 침전물을 걸레로 걸이고 20mL 1:2 에탄올/물로 세척합니다. 침전 공기를 건조하게 하십시오.
8. 획득 된 제품의 수율을 계산합니다. 단계 1.2.2.7에 따라 NMR 샘플을 준비합니다. ¹H NMR로 순도를 확인하십시오. 순수하지 않은 경우 에탄올로 재결정화를 통해 제품을 정화하십시오.
9. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 NMR 튜브에 약 3 방울의 반응 혼합물을 추가하고 유족 용매로 파이펫을 헹굴하십시오.
10. 1.2-1.8 단계를 반복합니다.

3. NMR 스펙트럼의 간략한 해석

1. 적절한 프로그램(예: MestReNova)으로 스펙트럼을 처리합니다.
2. 표 1의NMR 이동과 다른 피크의 상관 관계를 구분합니다. 화학 적 변화는 양성자가 존재하는 환경의 유형을 암시합니다.
3. 피크를 통합하여 각 피크에 해당하는 수소를 제공합니다. 모든 피크를 통합하면 상대적인 수의 총 양성자가 있습니다.
4. 이웃 수를 나타내는 양성자 피크의 분할을 평가합니다.
5. J 커플링을 측정하여 양성자가 서로 어떻게 연결되는지 확인합니다.

핵 자기 공명(NMR) 분광법은 유기 화학에서 샘플의 분자 구조와 순도를 결정하는 중요한 방법입니다.

NMR 분광법에서 샘플은 강한 자기장에 노출됩니다. 노출 시 특정 핵 전이 또는 공명, 신중한 에너지 준위 사이. 이러한 수준 사이의 에너지 갭은 측정하고 스펙트럼으로 시각화할 수 있습니다. 이 데이터는 샘플의 화학 구조를 설명하는 데 사용할 수 있습니다.

모든 핵이 NMR 활성에 필요한 특성을 가지고 있는 것은 아닙니다. 연구되는 일반적인 동위원소는 1H, 2H, 13C, 19F 및 31P입니다.

이 비디오는 NMR의 원리를 소개하고, 화학 반응의 여러 단계에서 NMR 샘플의 예제 준비를 단계별로 진행하고, 여러 응용 분야에 대해 논의합니다.

NMR 기기에서는 액체 질소와 헬륨을 사용하여 초전도 자석을 냉각합니다. 자석은 샘플에 일정한 자기장을 가합니다. 샘플 내에서 홀수 개의 양성자 및/또는 중성자를 가진 원자핵은 장과 정렬하여 저에너지 상태를 채택하거나 이에 반대하여 고에너지 상태를 채택합니다.

두 레벨 사이의 에너지 차이는 공진 주파수이며, 이는 적용된 필드의 강도와 핵의 유형에 따라 달라집니다. NMR에 사용되는 자석의 경우 값은 무선 주파수 또는 RF 범위에 있습니다.

RF 코일은 무선 주파수 펄스로 샘플을 여기시켜 저에너지 핵을 더 높은 상태로 이동시킨 후 다시 되돌립니다. 코일은 이러한 자화 변화를 감지하여 피크로 표시합니다.

NMR의 강점은 화학적 환경에 따라 핵(이 경우 수소)을 구별하는 능력에 있습니다. 이웃 원자의 전자는 자기장의 일부로부터 핵을 차단하거나 "보호"합니다. 이 효과적인 자기장은 화학적 이동이라고 하는 특정 핵에 대한 공진 주파수를 변경합니다. 에탄올에서 메틸렌, 하이드록실 및 메틸 양성자는 모두 고유한 공명 주파수를 가지고 있습니다. 각 피크 아래의 면적을 결정하면 각 유형의 양성자 수가 설명됩니다.

서로 다른 자기 강도를 가진 기기는 공진 주파수를 이동시키기 때문에 샘플에 추가된 표준 분자, 종종 테트라메틸실란 또는 TMS를 참조합니다. 주파수의 화학적 이동은 매우 작으며 종종 ppm (parts per million)으로보고됩니다.

고해상도의 강력한 자석을 사용할 때 피크는 때때로 서브 피크로 분할됩니다. 이것은 인접한 핵에 의해 발생하며, 그 중 일부는 자기장과 정렬되고 일부는 반대입니다. 핵에 적용되는 유효 필드를 더 변경합니다. 에탄올에서 2 개의 메틸렌 양성자는 메틸 피크를 삼중항으로 두 번 분할하고 3 개의 메틸 양성자는 메틸렌 피크를 3 번 사중주로 분할합니다. 분열 또는 J-커플링의 거리는 핵의 거리와 관련이 있어 질적 발견을 돕습니다.

이제 NMR의 기본 원리를 이해했으므로 양성자 NMR을 사용하여 알데히드와 케톤에서 칼콘의 합성을 모니터링하는 예시 절차를 검토해 보겠습니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 비커에 소량의 출발 물질을 첨가하는 것으로 시작합니다. 흄 후드로 이동하여 시작 물질을 0.7mL의 중수소 용매로 희석합니다. 중수소의 공진 주파수가 양성자의 범위를 벗어나기 때문에 중수소화 용매가 사용됩니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 희석된 출발 물질 0.7mL를 깨끗한 5μmm NMR 튜브에 넣고 바닥 4.5μm 5cm를 채웁니다. NMR 튜브에 뚜껑을 씌우고 라벨을 붙입니다. 튜브를 부드럽게 흔들면서 샘플과 캡이 접촉하지 않도록 주의합니다. 그런 다음 튜브를 스피너에 삽입합니다.

튜브와 스피너의 외부를 2-프로판올과 실험실 티슈를 사용하여 청소합니다. 그런 다음 샘플 어셈블리를 깊이 게이지에 놓고 삽입 깊이를 보정합니다.

보정 후 샘플 어셈블리를 수동으로 또는 자동 샘플러를 사용하여 NMR 분광계에 로드합니다. 마지막으로 컴퓨터 워크스테이션을 사용하여 NMR 스펙트럼을 획득합니다.

반응의 각 시작 물질에 대해 이 절차를 사용하여 NMR 스펙트럼을 생성합니다. 칼콘의 합성을 위해서는 메톡시벤즈알데히드와 메틸아세토페논 모두에 대해 스펙트럼을 생성해야 합니다.

다음으로, 플라스크에서 출발 물질과 시약을 결합하여 반응을 시작하여 샘플 합성을 수행합니다.

30분 간격으로 파스퇴르 피펫을 사용하여 반응 혼합물의 작은 부분 표본을 제거하고 깨끗한 NMR 튜브에 3방울을 추가합니다.

이 조반응 생성물을 중수소화 용매로 희석하고, 전술한 절차를 이용하여 NMR을 준비한다.

반응이 진행됨에 따라 노란색 침전물이 형성됩니다. 반응이 완료되면 침전물을 세척 및 여과하고 정제된 반응 생성물에 대한 NMR 스펙트럼을 생성합니다.

이제 화학 반응의 각 단계에서 NMR 스펙트럼을 생성했으므로 분석해 보겠습니다.

각 출발 물질에 대한 NMR 스펙트럼의 피크는 화학적 변화와 각 피크에 기여하는 양성자의 수에 따라 분자 내의 다른 양성자 그룹에 할당됩니다. 여기에서는 메틸아세토페논과 메톡시벤즈알데히드에 대한 4개의 주요 양성자 그룹을 할당하여 9.5ppm에서 10.5ppm 사이의 알데히드 피크에 주목합니다. 서로 다른 시점에서 조잡 반응 생성물의 NMR 스펙트럼을 비교함으로써 칼콘을 합성하는 화학 반응의 진화가 설명됩니다. 예를 들어, 출발 물질인 메톡시벤즈알데히드의 알데히드 피크는 30분 반응 후에도 여전히 존재하지만 3시간 후에는 완전히 사라지므로 반응이 완료되었음을 나타냅니다.

정제된 생성물의 스펙트럼을 조사함으로써 우리는 각 피크를 칼콘 구조의 양성자 그룹에 할당할 수 있습니다. 예를 들어, 피크 3과 4를 조사하면 적분이 둘 다 하나이며, 하나의 양성자만 포함하는 그룹에 해당한다는 것을 알 수 있습니다.

피크 3과 4는 하나의 이웃 양성자를 나타내는 이중선이라고 합니다. 둘 다 16Hz의 J-커플링 상수를 가지고 있으며, 이는 양성자가 E-이중 결합을 가로질러 위치한다는 것을 시사합니다.? 정제된 반응 생성물의 모든 NMR 피크를 할당하여 순수한 칼콘의 합성을 확인합니다.

NMR 분광법은 광범위한 응용 분야를 가지고 있으며 많은 과학 및 의료 분야에서 사용됩니다.

이 응용 분야에서 양성자 NMR은 NMR 스펙트럼이 서로 다른 피크 분할 패턴을 갖는 디아미도카르벤과 모노노아미도카르빈의 합성 및 구조를 확인하는 데 사용됩니다. 이 카르빈은 또한 백린과 결합했을 때 겉보기에 다른 반응 생성물을 생성했습니다. DAC1은 밝은 적색 반응 생성물을 생성한 반면 MAAC2는 밝은 주황색 반응 생성물을 생성했습니다. 이러한 반응 생성물의 차이는 NMR의 두 번째 적용, 31P? NMR, 인 핵의 공진 주파수의 차이를 기반으로 스펙트럼을 생성합니다.

여기에서 핵 자기 공명 영상(MRI)을 사용하여 뇌의 해부학적 지도를 생성하고 관심 있는 뇌 영역을 선택했습니다. 그런 다음 NMR 분광법을 사용하여 주요 대사 산물의 스펙트럼을 생성했습니다. 마지막으로, 다양한 실험 조건에서 MRI를 사용하여 뇌 대사의 변화를 평가했습니다.

이 응용 프로그램에서는 NMR을 사용하여 결합 특성을 분석하고 구리 결합 펩타이드의 3D 구조를 제안했습니다. 먼저, 펩타이드의 비결합 및 구리 결합 상태에 대해 NMR 스펙트럼을 비교했습니다. 그런 다음 보다 발전된 2차원 NMR 기술을 사용하여 펩타이드 구조의 다양한 전위 형태를 평가했습니다. 마지막으로, 이러한 NMR 유래 구조 제약 조건을 사용하여 결합되지 않은 펩타이드에 대해 제안된 3차원 구조를 개발했습니다.

NMR 분석에 대한 JoVE의 소개를 시청했습니다. 이제 NMR 스펙트럼 생성 및 분석의 기본 원리와 NMR 샘플 준비 절차를 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!