Name: 기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 배우세요 기자 효소 형광(REF) 이미징을 사용하여 쥐에서 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하는 방법을. 이 기술은 동일한 동물을 여러 시점에서 반복 촬영할 수 있어 감염 진행 과정과 치료 효과를 연구하는 데 유용합니다.

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동물 연구 지침 및 규정에 명시 된 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 텍사스 A & M 대학에 의해 수행 되었다. 검토 및 생물 안전 요원 또는 위원회에서 승인이 필요할 수 있습니다.
주의: 모든 절차 BSL3 포함을 해야합니다. 직원은 항상 개인 보호 장비를 착용 해야 합니다. 모든 조작은 Biosafety 내각 (BSC) 안에 수행 되 고 모든 sharps sharps 용기에 삭제 됩니다. 작업을 시작 하기 전에, 작업 후 작업 표면 및 BSC 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올으로 청소 됩니다. 절차는 일반적으로 결핵균, biosafety 수준 3에서 할 것 이라고 하지만 일러스트 레이 션 및 촬영 목적에 대 한 저자 덜 악성 박테리아와 biosafety 수준 2에서이 절차를 보여.
1. 긴장 조건 문화
참고: M. 결핵 변형 CDC1551는이 연구에 사용 되지만 어떤 M. 결핵 긴장 든 지 같은 방식으로 사용할 수 있습니다.
<ol><li>M-OADC-TW에 박테리아를 성장 (7 H 9 국물 0.5% 글리세롤, catalase, 없이 복잡 한 10% 올레산 포도 당 0.05와 보충 트윈-80%) 0.5 세600 를 37 ° C에 중간 서 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>M-OADC-TW에 문화를 희석 (1시 10분의 시리즈는 박테리아의 희석). 접시는 박테리아의 희석 (105, 106, 107, 108) CFU의 수 있도록 선택적 7 H 11 접시에 3 중에.</li>
	<li>37 ° C에 또는 식민지 정확 하 게 계산 될 수 있는 때까지 4 주에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>8,534 x g는 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안에 세균성 inoculum 원심 한 번 식 염 수 10 mL와 펠 릿을 세척 (0.9 %NaCl) 염 분의 15 mL에 펠 릿을 다시 중단 (0.9 %NaCl).</li>
</ol>2.에 어로 졸 감염 매디슨 챔버를 사용 하 여 마우스의
<ol><li>1 주일에 대 한 새로운 환경에 적응 하는 쥐를 수 있습니다.</li>
	<li>챔버에 그들을 로드 하기 전에 마우스 무게.</li>
	<li>3 코드 전원 스트립에 연결: 메인 챔버 전원, 진공 펌프와 공기 압축기를 순서 대로.</li>
	<li>유리 용기는 조심 스럽게 나사. 유리 항아리 biosafety 내각에 고 염 분의 15 mL에 도전 inoculum을 추가 (0.9 %NaCl) 달성 하기 ~ 104 -106 CFU 폐에 박테리아의.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 유리 항아리의 뚜껑을 닫습니다. 분무기 단위에 항아리를 연결 하 고 (입구) 하단은 항아리에서 액체의 수준 아래 인치의 4 분의 1에 대 한 수직 스테인리스 튜브를 조정.</li>
	<li>챔버로 (챔버는 최대 90 마우스를 수용할 수) 실험에 필요한 모든 동물을 로드 하 고 문을 모든 래치를 닫습니다.</li>
	<li>메인 (룸) 확인 공기 흐름 미터. (공) 부동의 센터 약 50 L/분으로 왼쪽에 규모 측정 실행 확인 하십시오.</li>
	<li>챔버의 제어판에서 시작 단추를 누릅니다. 규모에 4 L/min으로 압축기 공기 흐름 미터 (왼쪽에 작은 미터)를 통해 공기 흐름 속도 설정 합니다. 시각적으로 도전 inoculum는 되 고 nebulized 되도록 확인 합니다.</li>
	<li>15 분 후 제어판의 앞에 빨간 불이 나타나고 음성 신호는 실행의 끝을 나타냅니다 때 타이머를 다시 설정 하려면 제어판의 오른쪽 아래 모서리에 리셋 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>출시 진공 챔버의 문에 작은 빨간 버튼을 누른.</li>
	<li>약 실 문 열고 동물을 제거 합니다. 다시 그들의 감 금 소에는 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>유리 분무기 단지를 제거 하 고, 누설 방지 운송 컨테이너에 배치. 생물 안전 캐비닛 내부의 컨테이너를 놓고 지정된 폐기물 컨테이너에 도전 정지를 삭제.</li>
	<li>생물 학적 가방 안에 사용된 분무기 단지를 놓고는 압력솥에 수송을 위한 부 대를 밀봉 합니다.</li>
	<li>감염 프로시저의 끝에, 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올과 챔버의 내부를 스프레이 하 고 10 분 동안 앉아 챔버를 허용 합니다.</li>
	<li>그런 다음 모든 액세스할 수 있는 내부 표면 아래로 매우 철저 하 게 닦아. 모든 오염 된 종이 타 올, 등의 처분. 생물 학적 쓰레기. 압력솥에서 쓰레기 컨테이너를 낭비 하 고 분무기 항아리를 사용.</li>
	<li>영상 시간 포인트까지 제약 실에서 다시 동물을 놓습니다.</li>
	<li>이미징의 날, 이미징 방에 보조 용기에 동물을 전송 합니다.</li>
</ol>3. 동물 마 취
<ol><li>쥐와 isoflurane 사용자 정의 가스 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize.</li>
	<li>각 마 취 단위 위에 있는 두 개의 숯 필터 용기 무게.</li>
	<li>무게는 초기 무게 위에 50 g 경우 새로운 용기를 바꿉니다.</li>
	<li>절차에 대 한 충분 한 isoflurane 되도록 기화 장치를 확인 하십시오.</li>
	<li>챔버 내부에 이미징 코 콘 홀더를 배치 합니다. 코 콘 절차에 필요한 수 놓고 코 콘 차단제와 나머지 오프닝을 밀봉 합니다.</li>
	<li>고압 실린더에서 산소 공급을 켭니다 고 55 psi에 그것을 설정 합니다.</li>
	<li>마 취 단위 있는 피난 펌프를 켜고 8 L/min으로 설정.</li>
	<li>마 취 단위 있는 산소 토글 설정.</li>
	<li>마 취 유도 실 1.5 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하에 가스 흐름을 켭니다.</li>
	<li>가스 흐름 0.25 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하려면 이미징 챔버를 켭니다.</li>
	<li>켜고 isoflurane 기화 기 2-2.5%에 설정 합니다. 수와 isoflurane 기화 (~ 20 g의 무게는 마우스에 대 한 2-2.5%, 무게 300 g 기니 피그에 대 한 4%)에 다이얼을 회전 하 여 실험을 위해 사용 되는 동물의 무게에 따라 isoflurane 수준을 조정 합니다.</li>
	<li>마 취 약 실에 쥐를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 마 취 유도 약 실에 가스 흐름을 켭니다.</li>
	<li>5-10 분까지 완전히 마 취 마 취 유도 실에서 쥐를 둡니다.</li>
	<li>일단 쥐 취는 이미징 동안 그들을 보호 하기 위해 눈에 광 연 고를 적용.</li>
	<li>그들의 코는 이미징 절차 동안 쥐의 마 취를 촉진 하기 위하여 원뿔에 배치 되도록 복 부 또는 sternal recumbency에 쥐를 놓습니다.</li>
</ol>4. 기자 효소 형광 (REF) 이미징
<ol><li>주사는 감염으로 복 주입 제어 마우스에 의해 기판 (20 µ M, 무게의 2.5 µ L/g). 쥐 1 분 미만 대 한 이미징 챔버 내부 마 취 받고 있다.</li>
	<li>이미징 시스템을 시작 합니다.</li>
	<li>초기화를 클릭 하 여 시스템을 초기화 합니다. 온도 바 녹색으로 바뀝니다 때까지 기다립니다. 참고: 이미징 챔버 이미징 동안 동물의 체온을 유지 하기 위해 온수 플랫폼으로 구성 됩니다.</li>
	<li>영상 수집 설정, 형광을 선택 | 전체 동물에 대 한 트랜스-조명 또는 폐 조직에 대 한 피 조명 수집 컨트롤 패널에서 오버레이 및 구조.</li>
	<li>단일 마우스 및 램프 수준 높은 b 보기의 필드를 설정 합니다.</li>
	<li>780에서 자동, 중간 binning, 2-3 f/정지, 그리고 여기 745 nm 및 방출 필터에 필터에 대 한 노출 시간을 설정 840 nm nm.</li>
	<li>시퀀스 설정에 대 한 시퀀스 설정 클릭, 폐 지역에서 9-12 트랜스 조명 포인트를 선택 합니다.</li>
	<li>이미지 수집에 대 한 취득을 클릭 합니다.</li>
	<li>케이지 후 이미징에 다시 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>완전히 복구 될 때까지 마우스를 모니터링 하거나 실험의 시간 포인트에서 이미징 하는 경우 CFU 측정을 위해 희생. 수정된 Karnofsky 점수 후 이미징 쥐의 모니터링을 수행 합니다.</li>
</ol>5입니다. REF 이미징 분석
<ol><li>이미징 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>찾아보기 아이콘을 클릭 하 여 이미지 파일을 로드 합니다.</li>
	<li>스펙트럼 unmixing 스펙트럼 Unmixing 도구 팔레트에서 클릭을 unmix 하는 데 필요한 스펙트럼을 클릭 합니다. 시작 unmixing 클릭 하십시오.</li>
	<li>광학 표면 재건에 대 한 표면 지형 클릭.</li>
	<li>에 등, 모피 마우스 따라를 선택 하 고, 표면 생성을 클릭 합니다.</li>
	<li>이미지 자르기 그리고 관심 영역에 대 한 임계값 이미지를 설정 합니다. 완료를 클릭 합니다.</li>
	<li>장기 등록에 대 한 3 차원 광학 도구 드롭다운 메뉴에서 등록 탭으로 이동 합니다.</li>
	<li>등록 기관 아틀라스의 장기.</li>
	<li>기관 크기 또는 패널 등록 도구에 있는 온/오프 변환 도구를 사용 하 여 생성 된 표면 지형에 위치를 조정 합니다.</li>
	<li>형광 단층 (휙) 3D 재구성, 이동한 선택 분석 탭 선택 이미지 분석에 대 한 포함 될, 이미지 전송 형광 정규화 (NTF) 효율성을 종류, 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>모든 선택에 확인 하 고 데이터 미리 보기 탭에서 재구성.</li>
	<li>형광 정량화에 대 한 관심의 기관에 투자 수익 큐브 관심 영역 (ROI) 도구를 추가 하 고 관심의 장기를 큐브 크기 조정 이동 합니다. 클릭 3D ROIs를 측정.</li>
	<li>투자 수익 측정 창에서 3D ROI 측정 이동, pmolM-1c m-1을 소스 복 및 측정 단위를 데이터 형식을 선택 합니다.</li>
	<li>저장 하거나 날아다니는 3D 재구성 분석 결과 그림 또는 데이터 파일로 내보내기.</li>
</ol>6입니다. CFU로 박테리아의 정량화
<ol><li>0.1 mL pentobarbital 나트륨 (390 mg/mL)의 복 주입 하 여 쥐를 안락사.</li>
	<li>반사 반응이 있는지 확인 하는 쥐의 발 패드를 압박 하 여 페달 반사를 확인 합니다.</li>
	<li>소독 집게와가 위를 사용 하 여 마우스에서 폐 조직 explant 폐 조직 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1 mL에 균질</li>
	<li>살 균 1 x PBS에서 폐 homogenate의 10 연속 희석을 확인 합니다.</li>
	<li>도금, 대 한 천 배지에서 20 µ L 각의 각각 희석의 3 aliquots 자리.</li>
	<li>세균성 성장 위한 37 ° C와 모니터 인큐베이터에 접시를 품 어.</li>
	<li>수 각 식민지 보육 시간 후 고 CFU로 표현 / mL 및 희석에 대 한 수정 하 여 다음 식을 사용 하 여: CFU / mL (C/V) = M x 어디 C 자리, V 당 식민지 카운트 = = 볼륨 샘플 각 접시 (mL), 및 M 주사 = 곱셈 요인 (희석 사용의 역). 참고: 경우 11 식민지 10-4의 샘플 희석에 0.002 mL의 샘플 볼륨에 대 한 한 자리에서 세 어진다, 방정식를 사용 하 여 식민지 수 산출 될 것 이다로 (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

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REF, 같은 이미징 기술을 사용 하 여 강력 하 고 일관 된 데이터의 생성을 허용 하는 주요 전략 있습니다. 광학 이미징 이후 모든 방향으로 방출 하는 빛을 포착 하기 어려운, 침투의 깊이 영향을 줄 수 있는 조직에 흩어져 빛을 생성 합니다. 사용 근처 적외선 fluorophore (NIR)의 REF 700-900 nm의 Querange에 여기 및 방출 하는 파장을 갖는 이미징에 대 한 기판 포유류 조직에 의해 형광 신호의 최소한의 흡수를 용이 하 게 한다. 사용자 정의 설계 기판 NIR fluorophore, IRDye 800Cw를 끄는에 연결 하 여 건설 되었다 IRDye QC-1, 형광 공명 에너지 전송 기반 냉각 허용 락탐 반지에 의해. IRDye 우수한 조직 침투는 빛 산란 특성 및 포유류36에 분명 어떤 유해한 효과 없습니다, 24 h 형광 혈액과 기관에서 허가 되 고 신호 크게 증가 시작 후 4 h 기판 관리, 관리 후 6 h 레벨 최대에 도달.
세균 감염 복용량, 감염 복용량과 기판의 관리 시간 게시물 감염 파일럿 연구를 수행 하 여 이미징의 포인트의 모드는 크고, 복잡 한, 실험에 착수 하기 전에 표준화 되어야 한다. 파일럿 연구 크게 줄일 수 시간 및 비용 표준 절차 주요 실험 하 고 이전에 최적화 될 수 있기 때문에 동물의 많은 수를 이미징 하는 경우. 세균 중 관심 몸 전체 이미징 트랜스 조명과 epi 조명 신호 소스를 확인 하 고 상관 관계의 품질을 결정을 사용 하 여 폐 이미징 비보 전 을 사용 하 여 다음의 기관/조직에 결정 되어야 한다 박테리아와 함께 현재8번호. 파일럿 연구는 탐지의 문 턱, 기술의 동적 범위 이미징에 대 한 최적의 실험 조건의 결정에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.
그것의 높은 감도 자연 M. 결핵 을 이미지 하는 능력으로 이미징 REF를 사용 하 여의 주요 장점은 다른 형광 및 발광 전략에 비해 긴장. REF 이미징 모든 M. 결핵 임상 격리 및 결핵-복잡 한 긴장에 보존 BlaC 촉매로 강력한 효소를 사용 합니다. REF 이미징의 큰 감도 촉매 그만큼 BlaC의 조합에 주인 세포에 의해 쪼개진된 형광 제품의 유지와 함께 예정 이다. 신호 지속적으로 증가 기판은 결과 감염 된 세포와 조직 내에서 신호의 거의 무한 한 빌드에 사용할 수 있습니다. 이미징 REF의이 증가 된 감도 이미징의 다른 방법에 비해 두 시험관에 M. 결핵 의 특정 검색 허용 한다 vivo에서8,,2324, 29.
REF 이미징 세균 검출 감염 모델, 어느 실험실 동물8,37 또는 인간의 임상 자료29,38 의 직접 응용 프로그램을 사용 하는 유전 수정 없이 사용할 수 있습니다. . REF는 fluorogenic 기판 kinases, 프로 테아 제, β-galactosidases, ureases, 등 BlaC 이외의 수많은 효소 목표를 위해 개발 될 수 있기 때문에 다양 한 병원 체39,40, 이미지를 감지 하 사용할 수 있습니다. 그러나, 주의 생각 있도록 대상에 주어져야 한다 그것은 이미징에 대 한 최적의 특성 표시 합니다. BlaC이이 전략의 성공적인 응용 프로그램을 보장 하는 특성에 대 한 좋은 모델 효소를 나타냅니다. REF 이미징 제공 즉시 읽어 폐에 존재 하는 세균 중에 감염, 시의 결핵 병, 세균성 수의 결심은 일반적으로 3 ~ 6 주, 필요로 하기 때문에 하지만 더에 크게 진행 속도 이 이렇게 훌륭한 제의로 저장할 것 이다 급속 한 성장 하는 생물 시간. REF는 carcinomas 결핵, 결 절 성 병 변 환자41,42의 진단에 중요 한 문제에서에서 차별 또한 사용 수 있습니다. REF 가속 변환 결핵 영상 소설 도구 역할 하 고 심지어 잠재적으로 치료 결과의 빠른 예측을 허용 하는 인 간에 게 적용할 수 있습니다.

M. 결핵 의 느린 성장 속도 결핵1,2,3의 신속한 진단에 주요 장애물입니다. 문화 기반 진단 소요 주 결과를, 반면 acid-fast 얼룩은 어린이5 와 인간 면역 결핍 바이러스6,7공동 감염 환자에서 진단 제한4 . 광학 이미징 기술은 최근 결핵8,9를 위한 전통적인 진단 방법의 대 안으로 인정 되었습니다. 형광 및 생물 발광 광학 실시간10,11,12,,1314, 살아있는 동물에 M. 결핵 의 이미지를 사용할 수 있습니다. 15,,1617,,1819. 광학 이미징 M. 결핵20,,2122감염의 신속 하 고 구체적인 평가의 이점이 있습니다.
우리는 REF를 사용 하 여 라이브 쥐에 M. 결핵 의 광학 이미징에 대 한 세부 정보를 설명 합니다. 이 방법은 매우 구체적이 고 민감한23,24 이며, 다른 광학 방법에 유사한 적은 결핵 (TB) 이미징25, 단층 촬영 (CT)26, 자석 등의 다른 방법 보다 비싼 공명 영상 (MRI)27, 그리고 F-fluorodeoxyglucose 양전자 방출 단층 촬영/CT (F FDG PET/CT)28. REF 세균성 효소에 의해 쪼개 짐에 따라 형광 제품8,29를 생산 하는 사용자 지정 형광 또는 발광 기질을 활용 합니다. 따라서, 재조합 mycobacterial 기자 스트레인30,31를 요구 하지 않기의 이점이 있다. 설명 무서 워 기판은는 형광 색소와 끄는 BlaC (β-lactamase), 자연스럽 게 결핵-복잡 한 진 균8, constitutively 표현에 의해 분해 되는 β 락탐 반지에 의해 연결 된로 구성 32. 박테리아는 직접 많은 크기 순서와 M. 결핵의 민감한 감지에 의해 증폭 수 REF 촉매 활동으로 인해 신호를 생성.
이 연구에 사용 된 REF 기판 생체에 우수한 조직 침투 있으며 감소의 긴 파장 때문에 배경. 이 긴 파장 기판으로 그것은 거의 100의 M. 결핵 에 대 한 탐지의 문 턱을 달성 하는 것 콜로 니 형성 단위 (CFU) 생체 외에서 그리고 < 쥐 vivo에서 (전체 동물)8, 폐에서 1000 CFU 33. REF가 래, 임상 자료와 환자 마이크로 내 시경 시스템16,32,,3334 그것의 높은 감도 및 특이성 때문에 직접 진단 도구로 사용할 수 있습니다. REF는 BlaC, 자연스럽 게 생산된 세균 효소를 사용 하 여 검색 모든 긴장에 때문에 어떤 결핵 임상 스트레인에 적용할 수 있습니다. 이러한 특성 pathogenesis의 분석 뿐만 아니라 REF 일반적 치료 촉진 하기 전 임상 결핵 연구에 유용한 도구를 이미징 및 백신 평가 하지만 또한 궁극적으로 결핵 진단에 적용할 수 있습니다. 환자입니다.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>사용자 정의 합성</td><td></td><td></td></tr><tr><td>치명적인 플러스 솔루션</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 미들 브룩 국물</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC 미들 브룩 농축</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>스포르시딘</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook 한천</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>매디슨 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS 스펙트럼</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 가스 마취 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투명 코 콘</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. 결핵 균주 CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>암컷 BALB/C 마우스, 5-7주</td><td>잭슨 연구소</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

기자 효소 형광 (REF) 효소 이미징 또는 형광 또는 생물 발광에 의해 감지에 대 한 관심의 대상 생물에 존재에 대 한 관련 된 기질을 활용 합니다. 우리는 BlaC, constitutively 모든 M. 결핵 종자로 표현 하는 효소를 이용 한다. REF는 감염 된 쥐의 폐에 있는 박테리아의 급속 한 정량화를 허용 한다. 쥐의 동일한 그룹 많은 시간 포인트, 크게 비용 절감, 보다 신속 하 게 박테리아를 열거, 호스트 병원 체 상호 작용에 비 발한 관측을 허용 하 고 통계적 인 힘을 증가 하는 그룹 당 더 많은 동물을 쉽게 유지 됩니다 때문에 몇 군데 있습니다. . REF는 매우 BlaC 효소 기자의 촉매 특성으로 인해 과민 하 고 특정 사용자 지정 flourescence 공명 에너지 전달 (무서 워) 또는 fluorogenic 기판 사용. REF 필요 하지 않습니다 재조합 종자, 일반 호스트 병원 체 상호 작용을 보장. 800에서 최대한 방출 무서 워 기판 사용 M. 결핵 감염의 영상 설명 nm. 기판의 파장 포유동물에 중요 한 깊은 조직 이미지를 수 있습니다. 우리는 어로 졸 감염 M. 결핵, 쥐의 마 취, REF 기판, 광학 이미징의 관리와 쥐의 개요 것입니다. 이 방법은 호스트 병원 체 상호 작용 및 M. 결핵를 대상으로 하는 항생제의 효능 평가를 성공적으로 적용 되었습니다.

REF 감염된 제어 마우스 함께 M. 결핵 감염 쥐의 영상 그림 1A에 나와 있습니다. 감염 된 쥐 생성을 크게 (P = 0.0057) 높은 형광 신호 제어 기판 관리 시에 비해 감염 된 후 6 주에 폐에서. M. 결핵 REF를 사용 하 여에 대 한 치료 효능을 공부 하는 전형적인 시간 코스 1, 2, 4, 6, 15, 그 주에 이미징 수 24 후 감염. 형광 강도 피 조명 폐 조직 (그림 1B)에 대 한 사용 하 여 정량 이다. 감염 된 쥐의 폐에서 주 6 주 2에서에서 일관 되 게 증가 신호 REF 성공적으로 M. 결핵 vivo에서감지할 수 나왔다. 나중에 시간 (그림 1B) 컨트롤 마우스의 배경 신호에 한 방울 몸에 있는 증가에 표시 될 수 수 질량과의 여기 파장 침투를 줄여 6 주 동안 쥐의 볼륨. M. 결핵 감염 된 생쥐에서 형광 소스의 3D 날아다니는 재건은 그림 2A에 표시 됩니다. 이미지 시퀀스는 여러 개의 트랜스 조명 시점에 동일한 여기 및 방출 필터의 시리즈를 사용 하 여 마우스에 획득 됩니다. 이러한 이미지 시퀀스는 동물 주제 내에서 형광 소스 배포를 위한 3D 날아다니는 재건을 위해 사용 됩니다. 그림 2 A-D 마우스 단층 촬영 폐 기관 등록의 서로 다른 방향 (코로나, 화살 및 transaxial)을 보여 줍니다. NTF 효율 재건 품질 그림 2E에서 표시 됩니다 확인 하기 위해 매핑됩니다. NTF 중립 밀도 필터 캡처한 빼서 추가 이미지를 통해 트랜스 조명 이미지에서 배경 빛 누설 수 있습니다. 동일한 방출 필터와 오픈 여기 필터 (그림 2E-시뮬레이션)을 주고 측정 전송 이미지에 특정 여기 필터 (그림 2전자 측정)로 찍은 이미지 정규화 제작한 기판 혼자 신호입니다. 유사한 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율 모두 수평 (그림 2F) 프로필과 거의 0% 비율 오류 (그림 2E % 오류)와 세로 (그림 2G) 프로필 감소 및 향상 된 신호 지역화 유물과 감도와 좋은 품질의 3 차원 재구성의 증거를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> 그림 1 . 참고로 M. 결핵 의 이미징 (A) vivo에서 이미지 마우스 감염 되지 않은 및 2, 4, 그리고 6 주 후 감염에 M. 결핵 감염의입니다. 색상 막대 낮은 (노란색)에서 높은 (레드) c m2 당 초당 광자에 형광 성 신호의 강도를 나타냅니다. (B) 마우스 M.결핵 감염에서 형광 강도의 정량화. 형광 두 컨트롤 (블랙)에 대 한 값을 하 고 감염된 (레드) 각 시간 지점에 대 한 표준 오류와 함께 표시 됩니다. 결과의 의미는 학생 t에 의해 결정 되었다-테스트, p 값의 &lt; 0.05 중요 하 게 고려 했다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> 그림 2 . M.결핵 감염 된 생쥐에서 형광 소스의 3D 날아다니는 재건. 마우스 단층 촬영에서 서로 다른 방향으로; A) 화관, B) 화살, 및 C) transaxial D) 폐 기관 등록. 관심 (ROI) 3D 영역 소스 측정을 위한 폐에서 빨간색 큐브로 표시 됩니다. (E) NTF 효율 측정 및 재건 품질 검사에 대 한 시뮬레이션의 지도. 3D 재구성 (유사한 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율)의 좋은 품질을 제공 하는 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율 프로 파일 비교 되었다. F) 수평 및 G) 수직 신호 대표 측정된 (파란색) 프로필 (빨간색) NTF 효율 곡선을 시뮬레이션 하며 수평 및 수직 빨간 막대는 소스 위치를 나타냅니다. 색상 막대 낮은 (파란색)에서 높은 (레드) c m2 당 초당 광자에 형광 성 신호의 강도를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

이 Reporter 효소 형광 이미징 절차의 전반적인 목표는 발병기전, 치료제 및 백신 연구를 위한 전임상 동물 모델에서 결핵균의 민감하고 특이적인 검출을 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 박테리아 종의 독성 메커니즘, 치료제 개발 및 백신 이해를 포함하여 결핵 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 가장 큰 장점은 동일한 그룹의 동물을 여러 시점에서 이미지화할 수 있다는 것입니다.이를 통해 비용을 크게 절감하고, 숙주 병원체 상호 작용을 연구할 수 있으며, 더 많은 수의 동물을 동시에 쉽게 유지할 수 있기 때문에 통계적 검증력도 높아집니다. 먼저 섭씨 37도의 MOADCTW 배지에서 600나노미터에서 측정된 광학 밀도 0.5까지 M.tuberculosis 박테리아를 성장시킵니다. 감염 물질의 조작과 관련된 모든 절차는 생물 안전 캐비닛 또는 기타 승인된 물리적 격리 장치 내에서 수행되어야 합니다.준비가 되면 동일한 배지에서 배양을 1-10회 희석합니다. 그런 다음 CFU를 정확하게 측정하기 위해 희석액을 선택적 7H11 플레이트에 3회 도금합니다. 섭씨 37도에서 4주 동안 또는 CFU를 결정하기 위해 콜로니를 정확하게 계산할 수 있을 때까지 플레이트를 배양합니다.접종을 설정하기 전에 항상 생물 안전 후드가 분당 50리터의 공기를 흐르고 있는지 확인하십시오. 최대 90마리의 쥐를 감염시킬 수 있는 접종물을 준비하려면 15ml 매 튜브에서 원하는 CFU를 측정합니다. 일반적으로 10, 000에서 100만 CFU 사이가 사용됩니다.그런 다음 박테리아를 펠릿으로 만듭니다. 다음으로 10ml의 식염수로 박테리아를 한 번 씻습니다. 그런 다음 15ml의 식염수에 매달아 두십시오.그런 다음 생물 안전 캐비닛에서 분무기에 부착할 수 있는 유리병에 접종물을 넣습니다. 다음으로 분무기 장치를 연결하고 하단이 서스펜션의 반월판보다 약 1/4인치 아래에 있도록 수직 스테인리스 스틸 튜브를 조정합니다. 이제 어셈블리를 누출 방지 운송 용기에 담긴 접종 챔버로 옮깁니다.계속 진행하려면 전원이 켜진 접종실에 알려진 무게의 동물을 로드합니다. 챔버는 최대 90 마리의 마우스를 수용 할 수 있습니다. 그런 다음 도어의 모든 걸쇠를 닫습니다.다음으로 강철 cl을 사용하여 분무기를 연결합니다.amp. 그런 다음 챔버의 시작 버튼을 누릅니다. 그리고 공기 흐름 속도를 분당 3리터에서 5리터 사이로 설정합니다.압축 공기는 평방 인치당 약 22-26파운드로 흐르며 중요한 것은 챔버에서 접종 안개를 볼 수 있어야 한다는 것입니다. 15분 후 제어판 전면에 빨간색 표시등이 나타나고 신호음이 실행이 끝났음을 나타냅니다. 그런 다음 재설정 버튼을 눌러 타이머를 재설정합니다.진공을 해제하려면 챔버 도어에 있는 작은 빨간색 버튼을 누르십시오. 그런 다음 챔버 문을 열고 쥐를 집 우리로 되돌려 놓습니다. 앞으로는 동물들을 격리실에 가둬두세요.그런 다음 항아리와 운송 용기를 생물 안전 캐비닛에 다시 넣습니다. 거기에서 남은 박테리아 현탁액을 지정된 폐기물 용기에 버리십시오. 그런 다음 사용한 분무기 용기를 생물학적 위험 백에 넣고 오토클레이브로 운송하기 위해 백을 밀봉합니다.챔버를 청소하려면 내부 표면에 완충 페놀과 70% 에탄올을 분사하십시오. 이러한 솔루션이 10분 동안 해당 표면에서 반응하도록 합니다. 그런 다음 철저히 닦아내십시오.모든 물티슈는 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오. 그런 다음 쓰레기, 쓰레기통 및 사용한 분무기 용기를 고압증기멸균합니다. 동물들을 이미징 룸으로 옮깁니다.거기에서 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 마취하고 복강 내 주사로 조영제 기질을 주입합니다. 이미징 시스템 소프트웨어에서 시스템을 초기화하고 온도 막대가 녹색으로 바뀌면 계속 진행합니다. 시스템을 초기화한 후 마우스를 이미징 챔버에 놓습니다.콧구멍이 콧구멍 안에 있는지 확인하여 영상 촬영 중에 마취제를 투여합니다. 이제 컴퓨터로 돌아갑니다. 획득 제어 패널에서 전체 동물 시각화를 위해 형광, 투과조명을 선택하거나 폐 조직을 보려면 에피 조명을 선택합니다.단일 마우스의 경우 field of view를 B로 설정하고 lamp level을 high로 설정합니다. 노출의 경우 자동 시간, 중간 비닝을 사용하고 F/Stop의 경우 2개 또는 3개를 사용합니다. 그런 다음 여기 필터를 745나노미터로 설정하고 방출 필터를 780에서 840나노미터로 설정합니다.그런 다음 시퀀스 설정으로 이동하여 관심 영역에서 9-12개의 투과 조명 지점을 선택합니다. 이제 획득 버튼을 눌러 이미지를 수집합니다. 이미지 분석은 텍스트 프로토콜에서 다룹니다.감염 정도를 분석하기 위해 펜토바르비탈나트륨을 사용하여 쥐를 안락사시킵니다. 동물이 안락사되었는지 확인하기 위해 페달 반사를 확인하십시오. 그런 다음 표준 박리를 사용하여 폐를 이식합니다.다음으로 1ml의 PBS에서 폐 조직을 균질화합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 homogenyn을 10 배 연속 희석합니다. 희석된 균질성을 세 번 플레이트화하고 콜로니를 계산할 수 있을 때까지 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.그런 다음 CFU 점수를 사용하여 감염의 중증도를 측정합니다. 마우스는 기재된 바와 같이 취급하였다. M.tuberculosis의 진행을 관찰하기 위해 REF 기질을 사용했습니다.형광은 투과조명을 사용하여 정량화되었습니다. 그리고 감염된 쥐에서 2주차에서 6주차로 증가했습니다. 대조군 쥐에서 신호가 약간 감소한 것은 6주 동안 체질량과 부피가 증가했기 때문일 수 있습니다.형광 소스의 3D FLIT 재구성은 동일한 여기 및 일련의 투광 필터를 사용하여 여러 투과 조명 지점에서 이루어졌습니다. 재건 품질을 확인하기 위해 NTF 효율성 맵이 만들어졌습니다. 특정 excitation filter에서 촬영한 이미지는 동일한 emission filter와 open excitation filter로 만든 투과 이미지로 정규화되었습니다.이것은 기판 자체에 의해 생성된 신호를 제공합니다. 재건에는 오류가 거의 없었습니다. 수평 및 수직 보기 모두에서 데이터의 NTF 효율성을 조사한 결과 밀접한 상관 관계가 나타났습니다.따라서 3D 재구성에는 아티팩트가 적고 신호 위치 파악이 개선되었으며 다른 방법에 비해 감도가 향상되었습니다. 이 기술은 결핵 분야의 연구자들이 결핵균에 대한 약물의 치료 효능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 REF 기질을 사용한 후속 광학 이미징을 통해 에어로졸 경로를 통해 결핵균에 감염된 마우스를 감염시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

출처: Valentine, M. E. 외, Pseudomonas aeruginosa 에서 인프레임 유전자 결실 돌연변이 생성과 감염 단순 마우스 모델에서의 병원성 감감 검사. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 생체 쥐 모델에서 박테리아 감염을 모니터링하기 위해 생물발광 기반 영상 기법을 시연합니다. 순차적 생물발광 및 X선 영상은 숙주 전역에 퍼진 감염을 실시간으로 시각화하고 해부학적 위치를 파악할 수 있게 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 박테리아 감염의 실시간 영상

출처: 베헤라, R. K. 외. 감염된 조직에서 박테리아 유전자 조절을 연구하는 형광 기반 방법. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 이중 형광 리포터를 이용해 감염된 마우스 신장 조직을 준비하고, DNA 염색하며, 박테리아 유전자 발현을 검출하는 방법을 시연합니다. 빨간색은 모든 박테리아를, 초록색은 감염 반응성 세포를 표시합니다.

쥐 신장 조직에서 박테리아 집락화의 형광 영상

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis 감염의 생체 내 검출을 위한 리포터 효소 형광(REF) 이미징을 보여줍니다. 감염된 마우스는 REF 이미징을 위해 복강내 기질을 주입합니다. 박테리아 β-락타마제 효소에 의해 가수분해되면 기질은 형광을 방출하며, 이를 감지하면 감염 평가에 도움이 됩니다.

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection(세균 감염의 생체 내 추적을 위한 Reporter Enzyme Fluorescence Imaging)

이 비디오는 재조합 루시페라아제와 형광 단백질 발현 바이리포터 인플루엔자 A 바이러스를 사용하여 마우스 모델에서 바이러스 감염을 추적하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 생체 내 및 생체 외 연구를 모두 가능하게 하여 연구자가 바이러스 역학 및 중재의 효과에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.

바이러스 감염을 추적하기 위한 Luciferase-Fluorescent Reporter 인플루엔자 바이러스

멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을...

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

황색 포도상 구균의 발광 생물 공학적 변형을 이용하여, 정형 외과 임플란트 감염 마우스 모델에서 광과 μCT 화상을 결합하여, 비 침습적으로 및 종 방향에서의 세균 감염의 역학뿐만 아니라 대응하는 염증 반응 및 해부학 적 변화를 모니터 할 수있는 기능을 구비 뼈.

결합<em&gt; 생체</em&gt; 광학 및 μCT 이미징 마우스의 정형 외과 임플란트 감염에 감염, 염증 및 뼈 해부학을 모니터링

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 연간 전염병과 간헐적 인 전염병을 일으키는 전염성 호흡기 병원체입니다. 여기서, 우리는 새로운 재조합 루시퍼라제 및 형광 발현 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 사용하여 생체 내에서 바이러스 감염을 추적하는 프로토콜을 기술한다. 이 접근법은 연구원에게 생체 내에서 IAV를 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 제공합니다.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

배우세요 기자 효소 형광(REF) 이미징을 사용하여 쥐에서 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하는 방법을. 이 기술은 동일한 동물을 여러 시점에서 반복 촬영할 수 있어 감염 진행 과정과 치료 효과를 연구하는 데 유용합니다.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

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