Name: Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: 배우세요 형광 제자리 교잡법을 사용하여 Drosophila 난모세포에서 감수분열 팔 응집력 상태를 시각화하는 방법을. 이 기술은 조기 응집력 상실 조건을 연구하고 인간의 모계 연령 효과 이해에 기여합니다.

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이 작품은 샤론 E. 강사에 게 수 여 하는 NIH 그랜트 GM59354에 의해 지원 되었다. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 앤 Lavanway와 기술 지원에 대 한 제이 에밀리 리드 형광 팔 프로브를 생성 하기 위한 프로토콜을 개발에 도움에 감사 위이 Q. 응웬 하 고. 우리는 또한 유용한 토론 및 조언을 위한 초파리 커뮤니티에서 수많은 동료를 감사합니다.

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<li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li>
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<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li>
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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

물고기를 사용 하 여 나 고 분열 prometaphase 팔 응집력의 상태를 평가 하기 위해 프로브 나 초파리 oocytes 초파리 감수 분열의 분야에서 중요 한 발전 이다. 역사적으로, 초파리 연구 성숙 oocytes11,,1819팔 응집력의 조 손실 유추를 유전자 검사로 제한 되었습니다. 자, 여기에 제시 된 방법으로 팔 단결력의 상태 수 수 분석 직접 물고기를 사용 하 여. 크게 팔 단결력의 조 손실에 대 한 물리적 증거를 얻을 수 초파리 oocytes에서 팔 응집과 염색체 missegregation의 조 손실 메커니즘 연구에 사용할 수 있는 접근의 레 퍼 토리를 확장 합니다.
중요 한 단계 우리가 하지 염색체...

유사 분열, 감수 분열 동안 염색체의 적절 한 분리 필요 그 자매 chromatid 단결력, 유지, 설립 될와 조정된 패션1,2에 발표. 단결력 S 단계 설정 되 고 복잡 한, 자매는 실제 관계를 형성 하는 cohesin에 의해 중재 chromatids 함께. 감수 분열에서 결합 한 크로스 오버를 원심 또한 함께 재조합 homologs를 기능과이 실제 협회를 통해 올바른 방향이는 분열에의 나는 (그림 1)3,4, 스핀 들 5. 팔의 릴리스 anaphase에 응집력 나 반대 스핀 들 극을 분리 하는 homologs 수 있습니다. 그러나, 팔 단결력은 경우 중간, 손실 재조합 homologs 그들의 물리적 연결을 잃게 되며 임의로, 분리는 aneuploid gametes (그림 1)에서 발생할 수 있습니다.
인간의 oocytes에서 염색체 분리에 오류 유산 및 기형 아 출산, 다운 증후군6, 등의 주요 원인이 되며 그들의 발생 산 모 나이7기 하 급수적으로 증가. 자매 chromatid 단결력 태아 oocytes에서 설정 되 고 meiotic 재결합 출생 하기 전에 완료 됩니다. Oocytes 다음 체포 중간 의향에 나 배 란까지 고이 체포 하는 동안, 재조합 homologs의 지속적인된 물리적 협회 의존 자매 chromatid 단결력. 따라서, 감수 분열과 정상 임신 결과 정확한 분리 결합 최대 5 년간 그대로 유지 해야 합니다.
인간의 oocytes의 장기간된 meiotic 체포 중 응집 조 손실 모성 연령 효과에 기여할 제안 되었습니다와 증거의 여러 줄이 가설8,9를 지원 합니다. 그러나,이 현상의 우리의 이해의 대부분 모델 생물5,10,,1112, 를 사용 하 여 의존 인간의 oocytes meiotic 응집력의 과제를 감안할 때, 13,,1415.
초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집과 염색체 분리의 연구에 대 한 수많은 이점을 제공합니다. 간단한 유전자 분석 결과 수 aneuploid gametes에서 자손을 복구 하 고 X의 충실도 측정-대규모11,,1617에 염색체 분리. 또한, 하나 또한 나 팔 단결력11,18, 의 조 손실에 일치 하는 표현 형 감수 분열 시 재조합 homologs missegregate 때문에 염색체 분리 오류 발생 여부를 결정할 수 있습니다 19. 초파리 oocytes meiotic 응집력의 상태 관찰은 또한 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 직접. 비록 반복적인 위성 시퀀스에 교배 하는 형광 oligonucleotides 사용 되었습니다 10 년 이상 모니터링 성숙 초파리 oocytes4,20, 팔의 분석에서에서 pericentromeric 결합 하 단결력은 더욱 어려운 되었습니다. 팔 단결력의 상태 시각화 단일 복사본의 큰 영역에 걸쳐 프로브 시퀀스 이며 충분히 밝은 결과 개별 여동생에 대 한 표시 신호 chromatids 팔 단결력은 결 석 하는 경우 필요 합니다. 또한, oocyte 고정 조건 및 레이블이 지정 된 DNAs의 크기 큰 성숙한 초파리 oocyte (200 µ m 넓은 500 µ m 길이 의해)에 침투21 를 촉진 해야 합니다. 최근, 한 팔 조사는 성공적으로 활용, 하지만 저자 anaphase 동안 초파리 oocyte chromatids를 시각화 하기 위해 명시 된 그들은 prometaphase에 신호를 감지 하지 못했습니다 또는 분열 oocytes22를 체포. 여기 우리는 X의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제공-염색체 팔 물고기 조사 조건과 oocyte 준비 나 하 고 분열 chromatid 응집력 prometaphase 언 니의 조기 상실에 대 한 분석 결과 허용 난 oocytes. Meiotic 단결력의 유지 보수에 필요한 유전자 제품을 사용, 이러한 기술을 동생에 대 한 분석 결과를 다른 수 chromatid 단결력 다른 genotypes의 성숙한 초파리 oocytes에 결함.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi Prep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Prep BAC clone DNA</td></tr><tr><td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA2</td><td>Amplify BAC clone DNA</td></tr><tr><td>ARES Alexa Fluor 647 DNA 라벨링 키트</td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Label BAC 클론 DNA</td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>BAC 클론 DNA의 라벨링 후 비접합 염료</td></tr><tr><td>를 제거하십시오Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals & 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>참고: 모든 솔루션은 멸균 초순수를 사용하여 준비되며 오토클레이브 또는 필터 멸균으로 멸균해야 합니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>10% 재고 준비 동결 부분 표본</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)</td><td>인비트로겐</td><td>D1306</td><td>Toxic: 착용 적합한 보호구. 100&micro를 준비하십시오; 100% 에탄올에 있는 g/ml 주식, -20 &deg;C.에 aliquots에 있는 저장하십시오 1개를 &micro; 사용 전 2X SSCT의 g/ml 용액.</td></tr><tr><td>덱스트란 설페이트</td><td>시그마</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>드라이라이트</td><td>드라이라이트 회사</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>인비트로젠</td><td>15508-013</td><td>10 mM 재고</td></tr><tr><td>dTTP (10 &마이크로; mol, 100 &마이크로; l)</td> <td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>1 mM 재고</td></tr><tr><td>EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)</td> 준비<td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>250 mM 재고</td></tr><tr><td>준비 100% 에탄올 (분자 등급, 200 proof)Decon</td> <td>Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)</td><td>Sigma</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>Toxic: wear</td></tr>: <tr><td>proper protection Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td>Toxic: wear, appropriate</td></tr><tr><td>protection: Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4</td><td>Toxic: 적절한 보호 장치를 착용하십시오.</td></tr><tr><td>염산</td><td>Millipore</td><td>HX0603-4</td> <td>< 강한 > 독성 : < / 강한 > 적절한 보호 장치를 착용하십시오.</td></tr><tr><td>하이드록실아민</td><td>시그마</td><td>438227</td><td>준비 3 M 재고</td></tr><tr><td>4.9 M 염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 &Yuml; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &Yuml; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신(0.1mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>아세트산칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S209-500</td><td>3M 재고 준비</td></tr><tr><td>카코딜레이트 나트륨</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1131</td><td><강한>독성: </강한>적절한 보호구를 착용하십시오. 400mM 스톡 준비</td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>염화나트륨</td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>10% 트윈 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>참고: 모든 솔루션은 멸균 초순수를 사용하여 준비되며 오토클레이브 또는 필터 멸균으로 멸균해야 합니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE 완충액</td><td></td><td></td><td>10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH = 8.0</td></tr><tr><td>20X SSC (식염수 구연산 나트륨)</td><td></td><td></td> <td>3 M NaCl, 300 mM 구연산 나트륨</td></tr><tr><td>2X 카코딜 레이트 고정 용액</td><td></td><td></td> <td>< 강>독성 : < / 강> 적절한 보호 기능을 착용하십시오.200 mM 카코딜 산 나트륨, 200 mM 자당, 80 mM 아세트산 나트륨, 20 mM EGTA</td></tr><tr><td>1.1X 혼성화 완충액</td><td></td><td></td><td>3.3X SSC, 55% 포름아미드, 11% 덱스트란 황산염</td></tr><tr><td>고정 용액</td><td></td><td></td><td><강한>독성: </강한>적절한 보호를 착용하십시오. 4% 포름알데히드, 1X 카코딜레이트 고정 용액</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100</td></tr><tr><td>추출 버퍼 (PBSTx + Rnase)</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 & 마이크로; g/mL RNase</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC, 0.1% 트윈 20</td></tr><tr><td>2X SSCT + 20% 포름아미드</td><td></td><td></td><td><강한>독성:</강한> 적절한 보호를 착용합니다. 2X SSC, 0.1% 트윈 20, 20% 포름아미드</td></tr><tr><td>2X SSCT + 40% 포름아미드</td><td></td><td></td><td><강한>독성:</강한> 적절한 보호를 착용합니다. 2X SSC, 0.1% 트윈 20, 40% 포름아미드</td></tr><tr><td>2X SSCT + 50% 포름아미드</td><td></td><td></td><td>Toxic: 착용 적합한 보호구. 2X SSC, 0.1% 트윈 20, 50% 포름아미드</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AluI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0137S</td> HaeIII New England Biolabs R0108S <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>MspI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>RsaI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0167S</td><td></td></tr><tr><td>BfuCI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0636S</td><td></td></tr><tr><td>100X BSA</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td></td><td>NEB 효소</td></tr><tr><td>10X NEB 버퍼 #2</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩과</td><td></td> <td>함께 제공제한 효소 분해 완충액. NEB 효소 포함</td></tr> 말<tr><td>단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 400 U/&마이크로; l</td><td>Roche / Sigma</td><td>3333566001</td><td></td></tr><tr><td>TdT 버퍼</td><td>Roche / Sigma</td><td></td><td>TdT 효소</td></tr><tr><td>코발트 클로라이드</td><td>Roche / Sigma</td><td></td> <td>Toxic : wear 적절한 보호 기능을 제공합니다. TdT 효소</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/mL)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cytology Tools 등</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>#5 INOX, 바이오로지</td></tr><tr><td>9" 일회용 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td> 얕은 유리 해부 접시 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 를 살균하는 오토클레이브 맞춤형 <tr><td>깊은 우물 접시 (3 웰)</td> <td>Pyrex</td><td>7223-34</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest 프리미엄 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-104</td><td>깊은 우물 접시를 덮는 데 사용</td></tr><tr><td>젖빛 유리 슬라이드, 25 x 75 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48312-002</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드, 3 x 1인치, 1mm 두께</td><td>의 Thermo-Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 10 x 10mm, No. 1.5</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td></td><td></td><td>수제</td></tr><tr><td>Prolong GOLD 장착 매체</td><td>분자 프로브</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>압축 공기 다양한</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000, spectrophotometer</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>실</td>온에서 다양한 <td></td><td></td></tr><tr><td>탁상용 마이크로 분리기</td><td></td> 4 &deg에서 다양한 <td></td><td></td></tr><tr><td>탁상용 마이크로 중분리기; C</td><td>각종</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 구획</td><td>회전</td><td></td><td></td></tr><tr><td>장치 각종 혼성화 오븐 또는 인큐베이터</td><td>각종</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>각종</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1RSi 레이저 스캐닝 confoal</td><td>Nikon</td><td></td><td>40X 기름 계획 Fluor DIC (NA 1.3)</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>소모품 등</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로퓨지 튜브</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 &micro; l microfuge 관</td><td>각종</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l PCR 튜브</td><td></td> 꽉 끼는 뚜껑이있는 다양한 <td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 용기</td><td></td><td>다양한 Drierite</td>Kimwipes를 담기 위해 다양한 일회용 물티슈 파라 필름 다양한 파라핀 필름 < 강한> 이름 < / 강> < 강> 회사 < / 강> < 강>카탈로그 번호 < / 강><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>코멘트</td></tr><tr><td>기타</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC 정제 5' 표지 올리고뉴클레오티드</td><td>X 염색체의 359bp 위성 반복을 인식하는</td><td>통합 DNA Technologies</td><td></td> Cy3 표지 프로브</tr><tr><td>Volocity Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>버전 6.3</td></tr></tbody></table>

prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

인간에서는, oocytes에서 염색체 분리 오류 유산 및 기형 아 출산의 대부분에 대 한 책임이 있습니다. 또한, 여자 나이, 그들 마음속에 aneuploid 태아는 극적으로 증가 하 고이 현상의 위험 모성 연령 효과로 알려져 있다. Meiotic 분열 동안 정확한 염색체 분리에 대 한 요구 사항 중 하나는 자매의 유지 보수 oocytes 경험 확장된 의향 기간 chromatid 단결력. 인간 및 모형 유기 체에서 cytological 증거 meiotic 단결력 노화 과정 동안 악화 나왔다. 또한, 인간의 oocytes에서 분리 오류는 감수 분열 중 가장 널리 퍼진 나 팔 단결력의 조 손실와 일치. 모델 생물의 사용은 기초가 단결력의 연령에 따라 손실 메커니즘을 탈피 중요 합니다. 초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집력의 규칙을 공부에 대 한 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 최근까지, 유전 시험만 팔 응집력 oocytes 다른 genotypes 또는 다른 실험 조건에서의 손실에 대 한 분석 결과를 사용할 수 없었습니다. 여기, 상세한 프로토콜 형광에서 제자리에서 사용 하기 위한 교 잡 (물고기)을 직접 시각화 결함 prometaphase 팔 응집력에 나 고 분열 초파리 oocytes를 체포 하는 제공 됩니다. X 염색체의 원심 팔 hybridizes를 물고기 프로브를 생성 하 여 수집 하는 confocal Z 스택 연구원 수 3 차원에서 개별 물고기 신호의 수를 시각화 하 고 자매 여부 결정 chromatid 무기 분리. 설명한 팔 단결력 결함 초파리 oocytes의 수백에 계량을 가능 하 게. 따라서,이 방법은 단결력 유지 보수 뿐만 아니라 노화 과정의 죽음으로 이어질 요인에 기여 하는 메커니즘을 조사는 중요 한 도구를 제공 합니다.

그림 5 는 X 염색체에 cytological 지역 6E-7B에 hybridizes는 팔 조사로 얻은 이미지를 선물 한다. 공동의 DAPI, localizes 신호에서이 조사 결과 배경에서 쉽게 구별할 수 이며 팔 단결력 결함 다른 genotypes19에 척도를 성공적으로 사용 되었습니다. 단결력 결함의 부 량 제한 되었다 prometaphase에 어 분열 I 단계; 핵 붕괴 이전 oocytes 분석19에서 제외 했다. 그대로 핵 봉투 oocyte 염색체 주변 세포질 보다 개별 원형 지역에 의해 둘러싸여 있을 것입니다 때문에 DAPI 채널에서 스캔할 때 분명 하다.
그림 5...

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

이 절차의 전반적인 목표는 FISH 프로브를 생성하고 전중기 1기 및 중기 1기 동안 초파리 난모세포의 감수분열팔 응집 상태를 시각화하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 전중기(prometaphase) 및 중기(metaphase)에서 팔 응집력의 상태를 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 어떤 상태가 팔 응집력의 조기 상실로 이어지는지와 같은 초파리 감수분열 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술은 인간의 모계 연령 효과에 대한 이해를 넓힐 수 있는 잠재력을 가지고 있는데, 이는 적어도 부분적으로는 난모세포가 노화됨에 따라 감수분열 응집력이 저하되기 때문에 발생합니다. FISH용 암 프로브를 생성하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 난모세포를 해부하고 고정하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 후기 단계의 난모세포를 분리하려면 먼저 얕은 해부 접시에 PBSBTX 1ml를 첨가합니다.그런 다음 BSA 코팅된 팁이 있는 P-200을 사용하여 고정된 난소를 얕은 접시로 옮깁니다. BSA로 코팅된 피펫 팁으로 난소를 위아래로 피펫팅하여 덜 성숙한 난모세포에서 성숙한 난모세포를 제거합니다. 후기 단계의 난모세포가 충분히 분리되면 모든 조직을 500ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.파스퇴르 피펫을 당겨 튜브에 약 150-200 마이크로 리터를 남겨 두어 과도한 액체를 제거합니다. 난모 세포 롤링을 준비하려면 200마이크로리터의 PBSBTX로 깊은 웰 접시를 미리 적십니다. 접시를 덮고 따로 보관하십시오.젖빛 유리 슬라이드 3개를 얻고 슬라이드 3개를 옆에 둡니다. 다음으로, 슬라이드 1과 2의 젖빛 유리 부분을 함께 부드럽게 문지릅니다. 탈이온수로 헹구어 유리 파편을 제거하고 일회용 물티슈로 말리십시오.한 슬라이드에 50마이크로리터의 PBSBTX를 추가하고 이 영역을 다른 슬라이드로 문질러 슬라이드 1과 2의 젖빛 영역을 PBSBTX로 코팅합니다. 일회용 물티슈로 액체를 제거하고 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 슬라이드 1과 2의 서리로 덥은 부분이 접촉하도록 하고 슬라이드 3이 슬라이드 2를 지지하도록 합니다.난모세포를 굴리려면 먼저 P-200 피펫 팁을 PBSBTX에 미리 적시고 위아래로 피펫팅하여 마이크로분리 튜브의 난모세포를 분산시킵니다. 난모세포를 포함하는 50마이크로리터의 액체를 슬라이드 1의 젖빛 유리 부분 중앙으로 옮깁니다. 이렇게 하려면 슬라이드 2를 들어 올립니

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어...

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

우리는 성숙한 초파리 난모세포의 수집, 준비 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 방법을 사용하면 염색체 거동과 방추체 조립 및 감수분열 중 기능을 시각화할 수 있습니다.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

이 프로토콜은 초파리 흑개척 유충 시립엽에서 하이브리드화 연쇄 반응 형광 제자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 탐침 설계, 하이브리다이제이션, 증폭, 조직 장착 절차가 상세히 설명되어 발달 중인 시엽의 시각화를 용이하게 합니다.

발달 중인 초파리 시엽에서의 잡종화 연쇄 반응 FISH

배우세요 형광 제자리 교잡법을 사용하여 Drosophila 난모세포에서 감수분열 팔 응집력 상태를 시각화하는 방법을. 이 기술은 조기 응집력 상실 조건을 연구하고 인간의 모계 연령 효과 이해에 기여합니다.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

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