Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

이 절차의 전반적인 목표는 FISH 프로브를 생성하고 전중기 1기 및 중기 1기 동안 초파리 난모세포의 감수분열팔 응집 상태를 시각화하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 전중기(prometaphase) 및 중기(metaphase)에서 팔 응집력의 상태를 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 어떤 상태가 팔 응집력의 조기 상실로 이어지는지와 같은 초파리 감수분열 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술은 인간의 모계 연령 효과에 대한 이해를 넓힐 수 있는 잠재력을 가지고 있는데, 이는 적어도 부분적으로는 난모세포가 노화됨에 따라 감수분열 응집력이 저하되기 때문에 발생합니다. FISH용 암 프로브를 생성하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 난모세포를 해부하고 고정하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 후기 단계의 난모세포를 분리하려면 먼저 얕은 해부 접시에 PBSBTX 1ml를 첨가합니다.

그런 다음 BSA 코팅된 팁이 있는 P-200을 사용하여 고정된 난소를 얕은 접시로 옮깁니다. BSA로 코팅된 피펫 팁으로 난소를 위아래로 피펫팅하여 덜 성숙한 난모세포에서 성숙한 난모세포를 제거합니다. 후기 단계의 난모세포가 충분히 분리되면 모든 조직을 500ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.

파스퇴르 피펫을 당겨 튜브에 약 150-200 마이크로 리터를 남겨 두어 과도한 액체를 제거합니다. 난모 세포 롤링을 준비하려면 200마이크로리터의 PBSBTX로 깊은 웰 접시를 미리 적십니다. 접시를 덮고 따로 보관하십시오.

젖빛 유리 슬라이드 3개를 얻고 슬라이드 3개를 옆에 둡니다. 다음으로, 슬라이드 1과 2의 젖빛 유리 부분을 함께 부드럽게 문지릅니다. 탈이온수로 헹구어 유리 파편을 제거하고 일회용 물티슈로 말리십시오.

한 슬라이드에 50마이크로리터의 PBSBTX를 추가하고 이 영역을 다른 슬라이드로 문질러 슬라이드 1과 2의 젖빛 영역을 PBSBTX로 코팅합니다. 일회용 물티슈로 액체를 제거하고 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 슬라이드 1과 2의 서리로 덥은 부분이 접촉하도록 하고 슬라이드 3이 슬라이드 2를 지지하도록 합니다.

난모세포를 굴리려면 먼저 P-200 피펫 팁을 PBSBTX에 미리 적시고 위아래로 피펫팅하여 마이크로분리 튜브의 난모세포를 분산시킵니다. 난모세포를 포함하는 50마이크로리터의 액체를 슬라이드 1의 젖빛 유리 부분 중앙으로 옮깁니다. 이렇게 하려면 슬라이드 2를 들어 올립니다.

액체의 표면 장력이 두 개의 젖빛 유리 영역 사이에 밀봉을 만들 때까지 슬라이드 2를 천천히 내립니다. 서리가 내린 부분을 덮을 수 있을 만큼 충분한 액체가 있어야 하지만 아무 것도 새어 나오지 않아야 합니다. 그런 다음 한 손으로 하단 슬라이드 1을 제자리에 잡고 다른 손을 사용하여 상단 슬라이드 2를 수평 방향으로 앞뒤로 움직여 슬라이드 2를 수평으로 유지하고 슬라이드 3을 지지합니다.

난모세포의 움직임과 진행 상황을 쉽게 시각화할 수 있도록 현미경 아래에서 수행합니다. 수평 방향으로 몇 번 움직인 후 이동 각도를 약간 변경합니다. 여러 증분으로 상단 슬라이드 2의 이동이 시작 방향에 수직이 될 때까지 이 각도를 90도까지 점차적으로 증가시킵니다.

빈 맥락막은 액체에서 볼 수 있으며 맥락막이 없는 난모세포는 더 길고 얇게 보입니다. 난모세포를 굴릴 때 롤링 방향이 항상 직선이고 원 운동이 아닌지 확인하십시오. 용액이 약간 흐려질 때까지 약 7-10회 롤링을 반복합니다.

대부분의 난모세포가 유리막을 잃은 것처럼 보이면 굴러가는 것을 멈춥니다. 상단 슬라이드 2를 부드럽게 들어 올려 모서리 중 하나를 하단 슬라이드 1의 서리 영역 중앙으로 드래그하여 말린 난모세포가 서리 영역의 중앙에 축적되도록 합니다. PBSBTX가 포함된 두 슬라이드의 난모세포를 PBSBTX가 들어 있는 깊은 웰 접시에 헹굽니다.

슬라이드 1과 2를 초순수로 청소합니다. 일회용 물티슈로 말리고 재설정하십시오. 동일한 유전자형의 모든 난모세포가 굴러갈 때까지 이 단계를 반복합니다.

이것은 일반적으로 유전자형당 3-4번의 롤링이 필요합니다. 압연 후 이물질을 제거하려면 15ml 원추형 튜브에 1ml의 PBSBTX를 추가합니다. 액체를 휘젓어 튜브의 측면을 코팅합니다.

PBSBTX로 코팅된 P-1, 000 피펫 팁을 사용하여 딥웰 접시에서 롤링된 난모세포를 1ml의 PBSBTX가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 난모세포가 들어 있는 원뿔형 튜브에 PBSBTX 2ml를 추가로 추가합니다. 어두운 배경에 원뿔형 튜브를 대고 가라앉는 불투명한 난모세포를 확인합니다.

난모세포가 바닥에 가라앉도록 한 후 P-1, 000을 사용하여 파편이 포함된 용액의 상단 2밀리리터를 제거하고 버립니다. 총 3회의 잔해 제거 단계를 반복한 후 PBSBTX 코팅된 P-1, 000 피펫 팁을 사용하여 난모세포를 원래의 500마이크로리터 마이크로분리 튜브로 다시 이동합니다. 20-25명의 암컷은 약 50마이크로리터의 말린 성숙한 난모세포를 생성해야 합니다.

각 유전자형에 대해 새로운 젖빛 슬라이드, 깨끗한 깊은 우물 접시 및 새 원뿔형 튜브를 사용하여 나머지 유전자형에 대해 이 과정을 반복합니다. 1%Triton X-100이 함유된 PBS 500마이크로리터로 난모세포를 헹굽니다. 액체를 제거하고 500마이크로리터의 추출 버퍼를 추가합니다.

실온에서 2시간 동안 너트레이터에서 샘플을 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 pre-hybridization washes를 수행한 후 denaturation 및 hybridization을 수행합니다. 먼저, BSA 코팅된 P-200 피펫 팁을 사용하여 난모세포를 200마이크로리터 PCR 튜브로 이동합니다.

샘플을 섭씨 37도로 유지하고 난모세포가 바닥에 가라앉도록 합니다. 용액을 변경할 때 인내심을 갖고 이 과정에서 난모세포가 손실되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 난모세포가 가라앉으면 당겨진 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액체를 제거합니다.

그런 다음 40마이크로리터의 프로브 함유 혼성화 용액을 난모세포에 추가합니다. 난모세포가 포함된 PCR 튜브를 PCR 기계에 넣고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 배양합니다. 프로브를 난모세포에 추가한 후에는 가능한 한 어두운 곳에 보관하십시오.

하이브리드화 후 세척의 경우 2X SSCT와 50% 포름아미드를 섭씨 37도로 예열하고 하이브리드화 인큐베이터에 보관합니다. BSA 코팅된 P-200 피펫 팁을 사용하여 섭씨 37도 2X SSCT 100마이크로리터와 50% 포름아미드를 난모세포가 있는 PCR 튜브에 첨가하고 난모세포를 새로운 500마이크로리터 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 동일한 튜브에 섭씨 37도 2X SSCT와 포름아미드 50%를 400마이크로리터로 더 첨가한 후 난모세포가 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 정착되도록 합니다.

이 단계에서 정착하는 데 시간이 더 오래 걸리는 경우가 많습니다. 15분 이상 걸리는 것은 드문 일이 아닙니다. 인내심이 부족하면 난모세포가 크게 손실됩니다.

난모세포가 가라앉도록 한 후 당긴 파스퇴르 피펫으로 액체를 제거합니다. 섭씨 37도 2X SSCT 500마이크로리터와 섭씨 37도에서 50% 포름아미드를 넣고 난모세포를 회전으로 세척합니다. 각 세척 슬래시 회전 단계에 따라 난모세포가 가라앉는 동안 난모세포를 섭씨 37도로 유지합니다.

실온에서 추가 세척 후 너트에서 2X SSCT로 500마이크로리터의 밀리리터당 1마이크로그램 DAPI 용액에서 난모세포를 20분 동안 세척하여 DAPI로 염색합니다. 500마이크로리터의 2X SSCT로 난모세포를 3회 헹군 후, 너트레이터에서 500마이크로리터의 2X SSCT로 난모세포를 각각 10분씩 2회 세척합니다. 샘플은 커버 슬립에 장착할 준비가 될 때까지 어두운 곳에서 실온에서 최대 4시간 동안 보관할 수 있습니다.

BSA 코팅된 P-200 피펫 팁을 사용하여 피펫을 위아래로 움직여 용액 전체에 난모세포를 분산시킵니다. 그런 다음 40마이크로리터의 난모세포 용액을 폴리-L-라이신으로 코팅된 커버 슬립으로 옮깁니다. 난모세포가 커버 슬립에 달라붙지만 여전히 액체로 둘러쌀 때까지 당겨진 파스퇴르 피펫을 사용하여 커버 슬립에서 일부 액체를 제거합니다.

집게로 한쪽의 커버 슬립을 누른 상태에서 텅스텐 바늘을 사용하여 난모세포 덩어리를 부드럽게 해리하여 겹치지 않는 난모세포의 단일 층을 만듭니다. 당겨진 파스퇴르 피펫으로 난모세포 주변의 나머지 액체를 제거합니다. 그런 다음 미디어가 샘플에 닿을 때까지 장착 미디어가 샘플을 향하도록 하여 커버 슬립 쪽으로 슬라이드를 천천히 내립니다.

어둠 속에서 3-5일 동안 슬라이드를 건조시킨 후, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 6배 디지털 줌과 함께 높은 수치 조리개 40배 오일 대물렌즈를 사용하여 레이저 스캐닝 컨포칼 이미지를 획득합니다. 이미지를 보고 응집력 결함을 3차원으로 평가할 수 있는 소프트웨어 패키지는 필수적입니다. 이를 통해 Z 시리즈를 스크롤하여 FISH 스폿을 보고 개별 암 신호의 수를 정확하게 계산할 수 있습니다.

컨포칼 Z 시리즈의 최대 강도 투영은 팔 응집력이 손상되지 않은 난모세포에 대해 표시됩니다. 이 그림에서 암 프로브 신호는 노란색이고 pericentric 프로브 신호는 빨간색입니다. 두 개의 팔 프로브 반점은 자매 염색분체가 함께 있고 팔 응집력이 손상되지 않았음을 나타냅니다.

세 개의 팔 프로브 반점은 한 쌍의 자매 염색분체가 팔 응집력을 조기에 잃었지만 다른 한 쌍의 자매는 그렇지 않음을 나타냅니다. 두 개의 암 프로브 스폿이 스레드로 연결된 경우 자매 염색분체는 분리된 것으로 점수가 매겨지지 않습니다. 그러므로, 이와 같은 감수분열 형상은 팔 탐침 반점이 3개뿐인 것으로 간주되며, 한 쌍의 자매는 팔 응집력의 조기 상실을 보입니다.

자매 염색분체의 두 세트에 대한 팔 응집력의 조기 상실로 인해 4개의 팔 프로브 스폿이 발생합니다. 표시된 4가지 예 모두에서 중심체 응집력은 손상되지 않았습니다. 일단 숙달되면 하나의 유전자형에 대한 난모세포를 굴리는 것이 제대로 수행되면 약 25분 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 난모세포를 굴리는 방법, 암 프로브를 사용하여 FISH를 수행하는 방법, 초파리 난모세포의 감수분열 팔 응집 상태를 결정하기 위한 이미지 스코어링 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 하이브리드화 및 세척을 수행하는 동안 인내심을 갖는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 세척 단계 후에 난모세포가 가라앉을 때까지 충분히 오래 기다리지 않으면 마지막에 이미징을 위한 난모세포의 수율이 감소합니다.

단백질 국소화 또는 감수분열 방추체의 구조에 대한 추가 질문에 답하는 동시에 팔 응집력 상태를 모니터링하기 위해 FISH와 아미노 염색을 결합하도록 이 프로토콜을 최적화하는 것이 가능할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 초파리 감수분열 분야의 연구자들이 감수분열 팔 응집력을 보장하고 방해하고 염색체 분리에 영향을 미치는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다.