Name: 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 쥐의 양측 슬개골 힘줄 결손 모델을 이용한 줄기세포 치료 평가 방법을. 이 모델은 개체 간 변이를 최소화하여 치료 효과를 정확히 비교하고 동물 수를 줄이는 데 기여합니다.

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저자는 데이터의 그녀의 통계 분석에 대 한 수, 박사, 인정 하 고 싶습니다. 저자는 또한에 대 한 그녀의 조언을 마 취 박사 McClure, DVM, 박사 DACLAM, 감사 하 고 통증 관리 프로토콜 연구에 사용. 이 프로젝트는 연구 (12678v)와 USDA 섹션 1433 자금 (2090) 부사장의 웨스턴 대학 보건 과학 사무실에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨스턴 대학 보건 과학에 의해 승인 되었습니다.
1. 격리와 말 탯 매트릭스에서 MSCs의 확장
<ol><li>태 반 (임신) 성인 마 레에서 foaling 관찰 후을 aseptically 탯 태에서 분리 합니다. 탯에에서 계속 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1% 페니실린-스 (P/S)와 4 ° C에서 전송 하는 동안 처리까지.</li>
	<li>실내 온도 PBS 1%로 두 번 탯 워시 50ml 튜브에 P/S. 150 m m와 1 %P / S 50 mL 튜브 2 또는 세 번까지 혈액의 대부분은 밖으로 씻어 서 실내 온도 PBS에 세척에 2 인치 길이의 조각으로 탯 섹션.</li>
	<li>잘라 배를 경도 탯. 2 동맥, 정 맥, 그리고 집게와가 위를 사용 하 여 코드에서 allantoic 줄기를 포함 하 여, 혈관을 제거. 메스로 근 근 의해 150 mm 접시에 젤리 같은 매트릭스 주변 혈관은 탯 매트릭스 (왓슨의 젤리)를 수집 하 고 정밀한 조각으로 젤리를 말하다.</li>
	<li>PBS에서 0.1% (w/v) 콜라 유형 IA 솔루션의 15 mL 50 mL 튜브에 2-3 탯 조각 (약 12-15 g)에서 장소와 튼 젤리 해산 때까지 3-4 h 동안 부드러운 흔들어 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>15 분 동안 300 x g에서 소화 조직 원심 하 고 상쾌한 발음. 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 소화 조직 resuspend P/S, pipetting으로 혼합, 5 분 동안 150 x g에서 원심 및 상쾌한 (세척)을 발음. 세척 두 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>Resuspend 셀 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 세차 P/S, pipetting으로 혼합, 100 µ m 셀 스 트레이너, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기와에 의해 변형 및 상쾌한 발음.</li>
	<li>낮은 포도 당 Dulbecco의 혼합 하 여 배양 (CM) 준비 소 태아 혈 청 (FBS)와 1 %P 수정이 글의 중간 (LG-DMEM) / 미 여과 의해 매체를 소독.</li>
	<li>37 ° C에 미리 데워 CM의 10 mL에 긴장된 셀 resuspend, pipetting으로 혼합, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 전송 및 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 변경 c M 매 3 일 마다 문화 문화 passaged 것 이다 때 70-80%의 합류를 도달할 때까지.</li>
	<li>문화 통로를 플라스 크에서 CM을 발음 하 고 두 번, 실내 온도 PBS의 5 mL로 세척 하 고 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 5 분 동안 37 ° C에서의 3 mL와 분리.</li>
	<li>트립 신/EDTA 37.0 ° C에 미리 데워 CM의 6 mL로 중화 하 고, pipetting으로 혼합 하 고 15 mL 튜브, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 한 상쾌한 발음. Resuspend CM의 1 mL에 분리 된 셀, pipetting으로. Trypan 블루과 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 5, 000 셀/cm2, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 다시 시드해야 하 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어</li>
</ol>2. 키토 산 영화에 교양 UCM MSCs와 Spheroids의 준비
<ol><li>1% (w/v) 키토 산 용액 100 mL를 준비 하려면 99 ml의 증류수 (dH2O), 키토 산의 1 g을 추가 하 고는 자력으로 잘 혼합 합니다.</li>
	<li>빙 초 산의 670 µ L을 추가 하 고 혼합 키토 산 녹이 고 점성 된다 때까지 계속. 이 일반적으로 3-4 시간 걸립니다.</li>
	<li>12 음 조직 배양 플레이트의 각 음에 키토 산 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 접시 키토 산 솔루션을 균등 하 게 배포 하 고 모든 바닥 표면에 소용돌이.</li>
	<li>층 류 24 h에 대 한 하룻밤 커버 없이 캐비닛에서 키토 산 코팅 솔루션 접시 건조. 건조 되 면, 박막 형성 하 격판덮개를 준수 합니다.</li>
	<li>각 우물에 0.5 N 수산화 나트륨 (NaOH) 용액 1 mL를 추가 하 여 키토 산 영화를 중화 하 고 실 온에서 2 h에 품 어. 각 우물에서 NaOH를 발음 하 고 각각을 씻어 세 번 dH2O의 1 mL와 함께 잘. 각 세척 한 번 70% 에탄올 (EtOH)의 1 mL와 함께 잘.</li>
	<li>키토 산 영화를 소독, 층 류 캐비닛에 70 %EtOH 각 잘하고 품 어의 1 mL을 하룻밤 추가 합니다. 다음 날에 각 우물에서 나머지 EtOH를 발음. 각 세척 살 균 PBS의 1 mL 세 번 잘. 키토 산 필름 층 류 커버 없이 하룻밤 캐비닛 아래 자외선으로 소독.</li>
	<li>UCM MSCs의 양식 spheroids, 씨앗 확장 5000 셀/cm2, 각 잘으로 셀 passaged 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 참고: 셀 수 있는 알을 품을 산소 또는 normoxia, 탐정의 관심에 따라.</li>
</ol>3. 표면 마커 Cytometry 통해 분석의 표현
<ol><li>
단일 세포 현 탁 액의 준비
	<ol>
<li>표준 플레이트<ol>
<li>각 우물에서 매체를 제거 하 고 실내 온도 PBS로 두번 세척.</li>
			<li>실 온에서 5-10 분에 대 한 12-잘 접시의 각 음에 셀 분리 시 약의 500 µ L로 세포를 분리 합니다.</li>
			<li>부 화, 후 각 우물에 버퍼 (PBS 0.5 %BSA 포함) 얼룩의 1 ml을 추가 하 고 셀을 분리를 pipetting으로 혼합.</li>
			<li>세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>키토 산 판<ol>
<li>모든 spheroids는 피 펫을 사용 하 여 1000 µ L 팁 발음 매체에 의해 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 수집 된 매체를 전송. 매체를 수집, 후 1 mL PBS의 추가 의해 잘 세척 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 씻어 PBS를 전송 합니다.</li>
			<li>5 분 동안 150 x g에서 spheroids 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
			<li>셀 분리 시 약 (예, accutase)의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 5-10 분 동안 품 어. Pipetting을 사용 하 여 1 mL 팁 spheroids 해리는 더 이상 표시 될 때까지 혼합.</li>
			<li>단일 셀 펜션과 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 얼룩 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀을 세척
	<ol>
<li>상쾌한 원뿔 튜브에서 제거 하 고 다시 감기 버퍼 얼룩의 3 mL에 셀을 일시 중단. 이 단계에서 실험을 통해 아이스 셀을 계속.</li>
		<li>5 분 (세척)에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
		<li>두 번 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포를 얼룩이 지기
	<ol>
<li>5 분 x 300g에 centrifuge 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 다시 일시 중단 1 x 106 셀 50 µ L 차단 (PBS 포함 10% 말 혈 청)를 버퍼링 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>얼음에 1 시간에 대 한 빛에서 보호 품 어 다음 10 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 된 항 체 (CD44, CD90, CD105, CD34, 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 II, 또는 각 항 체 isotype 제어) 및 버퍼, 얼룩의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>감기 버퍼 얼룩의 3 개 mL를 추가 하 고 혼합, 5 분, 300 x g에서 원심 상쾌한 (세척)을 발음.</li>
		<li>두 번 세척을 반복 합니다.</li>
		<li>다시 버퍼를 얼룩이 지기의 0.5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단</li>
		<li>7-AAD (생존 염료)의 5 µ L을 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어</li>
		<li>교류 cytometer에 의해 스테인드 세포 샘플을 분석 합니다. 그들의 작은 SSC와 FSC, 파편을 제외 하 고 7-AAD의 낮은 통풍 관으로 가능한 셀을 식별 합니다. 플롯 FL1 및 FL2에는 y와 x-축, 각각. Isotype 제어를 사용 하 여 대각선 위에 게이트를 만들. 지역에 있는 긍정적으로 얼룩진된 세포의 백분율을 측정 합니다. 적어도 20000 이벤트/샘플 (보충 그림 1)을 계산 합니다.</li>
		<li>실행 가능한 셀 및 자동-형광, 게이팅 하 여 항 체로 얼룩진 셀의 비율 측정 하 고 세포 isotype 제어와 스테인드의 백분율을 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 쥐에서
<ol><li>Sprague Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)을 선택 합니다. 이 모델에 사용 하는 쥐의 비교적 큰 크기 note</li>
	<li>Anesthetize 고 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 쥐 핀치 발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 인공 눈 윤활제를 적용 합니다.</li>
	<li>선제 무 통으로 Meloxicam (1 mg/kg)의 근육 주사를 관리 합니다.</li>
	<li>따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 두 0.5 L 물 병 사이 쥐를 놓습니다. 테이블에 각 말단을 테이프. 저체온증의 위험을 줄이기 위해 버블 랩 (그림 1)와 함께 시체를 커버.</li>
	<li>마 취 5 %sevoflurane 원뿔, 물 난방 패드에 지 recumbency에 동물을 통해 1 L 100% 산소 혼합물에의 지속적인 흐름을 유지 합니다.</li>
	<li>피부 외상을 방지 하려면 수술 사이트를 클립 하지 않습니다. 대신, 두 stifles 이상 머리 제거 크림을 적용 합니다. 혀 억압 물을 사용 하 여 크림 및 머리 제거.</li>
	<li>수술 부위의 액체 digluconate 스크럽, 스크럽 하 고 3 번 70% 에탄올으로 씻어.</li>
	<li>피부는 억압의 craniomedial 측면에 인접 하 원심 방향에서 살 균 #15 메스 블레이드와 incise. 약 1 cm 수준, 슬 개 골의 근 위 절 개를 시작 하 고 약 5 mm tibial 결 절에 원심 확장.</li>
	<li>#15 메스 블레이드와 기본 피하 조직을 확보 하 여 슬 개 골 힘 줄 노출에 피부를 반영 합니다.</li>
	<li>
#15 메스 블레이드를 사용 하 여 소비 세 각 슬 개 골 힘 줄 (1 m m)의 중앙 세 번째 슬 개 골의 원심 부분에서 tibial tuberosity에.
	<ol>
<li>각 사지 (그림 2)에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대해 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어를 맞춥니다.</li>
		<li>힘 줄 (그림 3)의 중앙 부분을 #15 메스 블레이드와 Kirschner 와이어의 각 측에 2 전체 두께 절 개를 확인 합니다. 정밀한 아이리스가 위 (그림 4)와 함께 중앙 섹션 proximally 고 distally resect.</li>
		<li>억압의 근 막을 닫기 전에 5.5에 설명 된 대로 적절 한 치료 그룹에 대 한 응고 (혼합된 셀 펜션과 ACP)를 삽입 합니다. 십자 패턴으로 근 막과 피부 패턴 5-0 polyglactin 910 봉합 (그림 5)를 사용 하 여 피부를 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contralateral 억압에서 절차를 반복 합니다. 참고: 하나의 결함 치료 (줄기 세포 chitosan에 조건 또는 표준 접시에 배양) 무작위로 할당 됩니다. Contralateral 결함은 내부 통제 역할을 빈 남아 있습니다.</li>
	<li>수술 후 관리 enrofloxacin의 4 정제 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) meloxicam의 태블릿 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) 7 일 동안. 이 복용량 실험 동물 수 의사에 의해 권장 되었고 IACUC 프로토콜에 승인.</li>
</ol>5. 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 MSCs의 배달
<ol><li>핀치-발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 슬 개 골 힘 줄 결함 생성에 사용 되지 않는 건강 한 쥐 anesthetize</li>
	<li>수집 5 mL 혈액 심장 펑크에 의해 마 취 Sprague-Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)에서 5 mL 주사기에 산 시트르산 포도 당 (5:1 v/v)의 1 mL를 포함 하는 20 G 바늘.</li>
	<li>Pentobarbital (100 mg/kg), 같은 마 취에서의 intracardial 주입 하 여 심장 펑크와 혈액 수집 후 쥐를 안락사.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 350 x g에서 샘플 원심 상쾌한 전송 및 사용까지 aliquots (120 µ L 각)-20 ° C에서 저장.</li>
	<li>생체 내에 이식 직전 위의 약 수를 녹여 섞어 0.5 x 10와 20 µ L 트립 신/EDTA를 사용 하 여 표준 격판덮개에서 분리 (1.9 또는 3.1.2.1)에서6 MSCs 또는 (PBS/매체)와 홍 조에 의해 키토 산 판에서 수집.</li>
	<li>해 동된 플라즈마는 플라즈마를 활성화 하 고 혈전의 형성을 유발 하 96 잘 접시의 우물에서의 나머지 100 µ L를 6 µ L 10% 칼슘 염화 물 (CaCl2)의 추가 (바른된 플라즈마 활성화: ACP).</li>
	<li>세포 현 탁 액 (20 µ L) 혼합 및 ACP (100 µ L) 형태로 응고 (그림 6). 장소는 억압의 근 막 닫기 전에 만든 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 응고 (단계 4.10.3 참조).</li>
</ol>6. 기능적 결과
<ol><li>통증, 쥐 얼굴을 찡 그리기 규모 (RGS)37,38 에 기반 하 고 이식 사이트 위에 붓기의 표시를 위해 하루에 두 번 쥐를 모니터링 합니다. 참고: 채 점 시스템 (0-6) 보 행 기능 지원 앞 발 타임된 뒷 다리 서 포함 하 여 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) (등반 능력을 초과 표 1)입니다.</li>
	<li>아침에 각 시간 점의 평균 점수를 계산 하기 위해 저녁에 2 개의 뒷 다리 서 활동에 대 한 쥐를 평가.</li>
	<li>성공적으로 도달 상단 두 뒷 다리 사지와 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능에 대 한 쥐를 평가 합니다.</li>
</ol>7. 총 모양 및 슬 개 골 힘 줄의 Histopathology
<ol><li>7 일 (염증 평가)에 쥐를 안락사 또는 (평가 조직 치유)을 28 일 pentobarbital 8 %sevoflurane 2 L 100% 산소 마스크를 통해 전달 마 취 (100 mg/kg)의 intracardial 주입 하 여 치료를 게시.</li>
	<li>안락사 후 슬 개 골-힘 줄-경골 tuberosity 단위 메스와가 위를 걷. 부드러운 조직 및 슬 개 골 힘 줄 제외한 억압, 주위 인 대를 제거 합니다.</li>
	<li>총 모양 및 힘 줄 (그림 7)의 농축에 대 한 각 견본을 검사 합니다.</li>
	<li>힘 줄의 인접 하 고 측면 측면에 5.0 Polydioxanone의 외과 의사 매듭을 배치 하 여 표본 동양. 각 표본 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 용액에 고정 하 고 각 힘 줄의 중간 부분에서 가로 섹션 (5 µ m).</li>
	<li>되며 고 오신, Masson의 Trichrome 표준 프로토콜에 따라 얼룩을 사용 하 여 섹션을 얼룩.</li>
	<li>염증 등 병 적인 변화 뿐 아니라 결함, 내 혈의 존재를 감지 하는 섹션을 검사 합니다.</li>
	<li>콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (표 2)39의 정도에 따라 이전 게시 된 채 점 시스템을 사용 하 여 섹션의 조직학 점수를 평가 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

우리 결국 말에 자연 tendinopathies의 관리에서 후보 접근을 테스트 하는 것 때문에 말 셀이이 프로젝트에 대 한 선정 됐다. 실제로, 말에 힘 줄 부상 있습니다 말 표면 디지털 flexor 및 인간41킬 사이 생물 학적 유사성 때문에 자연 모델 남자에서 tendinopathy의 매력. 세포 표면 마커 CD44, CD90, CD105, CD34와 MHC II immunophenotyping 세포 치료42에 대 한 국제 학회에서 권장 하는 기준에 따라 셀의 선택 했다. 최근 연구에서 eqUCM-MSCs CD44에 대 한 긍정적이 고 부정적인 CD34와 MHC II, 문화 조건에 있었다. 표준 조건 하에서 경작 하는 세포 또한 CD90, CD105, 그로 인하여 표면 마커 표현의 측면에서 MSCs에 대 한 기준을 충족에 대 한 긍정적인 했다. 또한,이 연구 eqUCM-MSCs 키토 산 영화, 인간의 MSCs...

힘 줄 부상 종1에 걸쳐 상당한 통증과 근육 위축 증의 가장 일반적인 원인 중 하나입니다. 수의학, 경주 말에 모든 상해의 82 %musculoskeletal 시스템을 포함 하 고 그의 46%에 영향을 미칠 힘 줄과 인 대2,3말에 특별 한 관심의 힘 줄 및 인 대 부상 있습니다. 흉터 조직 형성과 치료 힘 줄의 biomechanical 속성에 영향을 미치는 flexor의 힘 줄 부상; 후 운동 사용에 반환에 대 한 경비 예 후를 설명 한다 다시 부상 발생에 2 년 이내 최대 말의 67%4신중 하 게 취급 합니다. 재생 의학 도전 전통적인 치료 조건에 새로운 대안을 제공 합니다. 자가 줄기 세포 치료 몇 가지 고무적인 결과5,6 생산 하지만 조직 컬렉션, 지연 처리/프로그래밍으로 인해 셀, 행정과의 영향와 관련 된 병 적 상태에 의해 제한 되는 줄기의 속성 (예: 연령) 환자의 건강 상태7,8세포. 이러한 제한은 상용 해서도 수용자 줄기 세포를 조사 근거를 제공 합니다. 그들은 윤리적 문제 및 기형종의 배아 줄기 세포와 관련 된 위험을 회피 하기 때문에 태아 adnexa 파생 셀 매력적인 후보자 이다. 태아 adnexa 가운데 탯 매트릭스 (UCM)와 튼의 젤리 라는 풍부 하 고 수집 하기 쉬운입니다.
셀 소스에 stemness 강화 allogenic 재생 의학을 위한 세포 은행 확립에 필수적 이다. 기능 관점에서 stemness 자체 갱신 및 다중 계보 분화9에 대 한 가능성으로 정의할 수 있습니다. Stemness의 증거 분석, 유전자 마커 Oct4, Sox2, 및 Nanog9의 식 함께 확산 및 감 별 법에 의존합니다. 한 전략 stemness 향상을 void 필러와 강화 확산 및 UCM MSCs의 차별화로 생체 재료의 사용에 의존 합니다. 이 방법은 유도 만능 세포로 성숙 세포를 재 설 정할 transcriptional 요인의 조작에 관한 우려를 제거 합니다. 생체 줄기 세포에 대 한 잠재적인 운반대로 간주, 중 키토 산 생체 적합성과 분해성10매력적 이다. 이 자연 aminopolysaccharide 카이, 두 번째 가장 풍부한 천연 다 당 류 주로 조개10의 subproduct로 얻은 알칼리 성 deacetylation에 의해 형성 된다. 우리 이전에 MSCs 및 키토 산 건설 기계 사이의 상호 작용을 조사 하 고 spheroids11,12,13,,1415, 의 형성 관찰 16. 우리는 또한 키토 산 행렬12,13,14,15,,1617, chondrogenesis의 우수성에 보고 18. 최근에, 2 개의 독립적인 연구 지방 조직에 의해 spheroids 형성을 설명 하 고 태 반 조직 유래 키토 산 영화19,20에 경작 하는 MSCs. Spheroids의이 형성 뿐만 아니라 stemness, 강화 하지만 또한 생체 내에 이식20후 줄기 세포의 보존을 향상.
정도와 병 종에 걸쳐 tendinopathy의 tendinopathies의 병 태 생리학을 연구 하 고 줄기 세포 주사 등 새로운 치료법을 테스트 실험 모델의 개발 라는 메시지가 있다. 말, 콜라 유도 염증이 생길 수도 힘 줄 수리21에서 MSCs를 사용 하 여 효능을 입증 하는 일반적인 모델입니다. 이 접근의 관련성, 주사는 급성 염증 성 변화를 일으킬, 임상 tendinopathies 만성에서 일반적으로 발생 하는 반면 팽팽하게22,23. 또한, 힘 줄 질환의 화학 유도 치료 응답을 유도 하 고 임상의 경우22,23에 장애인된 치유 과정을 복제 하지 않습니다. 표면 디지털 flexor의 힘 줄의 세그먼트의 절단 말24에 염증이 생길 수도의 외과 모델로 설명 하고있다. 더 최근에, 최소로 침략 접근 표면 디지털 flexor의 힘 줄25의 중앙 코어를 외상 성 손상 제한 하 사용 되었다. 외과 모델 자연 힘 줄 질환으로 이어질 수 있는 손상 만든25의 범위 내에서 재현성 부족 경향이 피로 메커니즘을 시뮬레이션 하지 않습니다. 모델, 병 적 상태 및 힘 줄의 말 모델와 관련 된 비용에 질병 vivo에서 새로운 치료의 평가 대 한 첫 번째 단계로 설치류 모델에 대 한 관심을 정당화 하는 추가 제한이 있습니다.
설치류의 실험 모델의 주요 장점 중 하나 비용과 간 개별 가변성을 제어 하는 기능으로 이루어져 있다. 설치류 그들의 빠른 성장 속도로 인해 다양 한 생리 적인 요인에 관하여 표준화 수 고 상대적으로 짧은 수명을, 변이의 소스를 제한 및 그러므로 차이 감지 하는 데 필요한 동물의 수를 감소. 설치류에 힘 줄 질환을 유도 하는 전략 부분 힘 줄 결함21의 외과 생성 뿐만 아니라 화학 유도에 의존 했습니다. 외과 모델 자연 tendinopathies 화학 모델 보다 더 나은 시뮬레이션 수 있습니다 하지만 더 높은 사망률 및 손상 된 힘 줄의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다. 그 점에서 쥐 조직 치유의 평가 촉진 함으로써 더 큰 결함의 생성을 허용 하는 그들의 크기가이 모델에 대 한 마우스 보다 더 나은 후보를 보인다. 4 주요 힘 줄 그룹에서 tendinopathies의 실험 연구에서 사용 된 Sprague-Dawley 쥐: 회전자, flexor, 아 킬 레 스, 그리고 슬 개 골 심 줄26. 이 중, 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델은이 힘 줄의 더 큰 크기와27에 액세스의 용이성 때문에 특히. 슬 개 골 힘 줄 tibial tuberosity에 quadriceps 근육을 연결합니다. 이 신 근 메커니즘 내에서 슬 개 골은 sesamoid 뼈는 허벅지 근육의 동작을 지시 하 고 슬 개 골 힘 줄의 인접 정도 구분. 슬 개 골 힘 줄의 인접 하 고 말 초 범위에서 뼈 앵커의 존재 biomechanical 테스트를 지원합니다. 일반적으로 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델 contralateral 그대로 힘 줄 컨트롤28,29봉사와 일방적인 외과 결점에 의존 합니다. 가장 일반적인 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에서는 contralateral 슬 개 골 힘 줄은 그대로 동안 tibial tuberosity의 삽입에 슬 개 골의 원심 꼭대기에서 슬 개 골 힘 줄의 중앙 부분 (폭에서 1 m m)를 절 개 합니다. 측정 결과의 조직학, 비-파괴적인 biomechanical 테스트 또는 biomechanical 테스트 실패, 초음파 영상, ex vivo 형광 이미징, 총 관찰, 그리고 기능 테스트28,30 포함 ,31. 일방적인 모델 같은 동물 내에서 유사한 상해의 보수 관리와 제안 된 치료의 비교를 허용 하지 않습니다. 마찬가지로, 여러 치료 간의 비교는 별도 동물을 필요합니다. 양자 모델 간 개별 변이 제거 하 고 연구32에 필요한 동물의 수를 줄일 것 이다. 그러나, 양자 상해 사망률을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 양자 lameness 치료 평가 방해 수 있습니다. 몇 가지 연구 짧게 페리 요원 관리 보다는 오히려 치료의 효과 모델33,34의 병 적에 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 쥐 하지만 초점에의 사용을 보고합니다.
이 연구의 장기 목표는 UCM MSCs allogenic 이식에 운명의 stemness 그리고 vivo에서 생존을 개량 하는 전략을 개발 하는 것입니다. 이 목표를 달성 하기 위해 우리 최근 키토 산 영화와 인큐베이션 hypoxic 환경35아래에 spheroids의 형성에 의해 UCM MSCs의 향상 된 stemness을 보고 있다. 이러한 생체 외에서 속성은 관련 된 슬 개 골 힘 줄 결함 조건된 UCM으로 치료의 향상 된 biomechanical 속성-MSCs. 이러한 결과에 기반, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 후보 테스트에 적합 한 것 힘 줄 부상36에 대 한 치료입니다. 연구의 목적은 여기 격리 및 특성화 UCM MSCs의 줄기 세포, 창조 및 양측 슬 개 골 힘 줄 결함, 그리고 수술 후의 치료에 대 한 생물 학적 전달 시스템의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 보고 복구 및 조직 결함 내 치유의 평가 합니다.

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Collagenase 유형 IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>소모품</td></tr><tr><td>DMEM 낮은 포도당</td><td>Hyclone</td><td>SH30021. FS</td><td></td></tr> 소모품 <tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>소모품</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>소모품</td></tr><tr><td>트립신 0.25%</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>소모품 Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>소모품 Trypan blue</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td>소비가능한</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td>소비가능한</td></tr><tr><td>키토산</td><td>시그마</td><td>C3646</td><td>소비가능한</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>S8045</td><td>소비가능한</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>하이클론</td><td>SH30574.01</td><td>소비가능한</td></tr><tr><td>둥근 바닥 폴리스티렌 튜브</td><td>코닝</td><td>149591A</td><td>소모품</td></tr><tr><td>마우스 anti-horse CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC</td><td>)AbD serotec</td><td>MCA1085F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype</td><td>Control AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>소모품</td></tr><tr><td>마우스 IgG1 (FITC) - Isotype Control</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>소모품</td></tr><tr><td>마우스 anti-human CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>소모품</td></tr><tr><td>마우스 IdG1 kappa (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>소모품</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>소모품</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 유세포 분석기</td><td>BD</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>소모품</td></tr><tr><td>산-구연산염-포도당 시</td><td>그마</td><td>C3821</td><td></td></tr><tr><td>소모품 염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C5670</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>소모품</td></tr><tr><td></td><td>쥐 Charles River</td><td>스트레인 코드: 400</td><td>실험 동물</td></tr><tr><td>쥐 수술 키트</td><td>하버드 장치</td><td>728942</td><td>장비</td></tr><tr><td>수술 블레이드 # 15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>소모품</td></tr><tr><td>쥐 MD 's Baytril (2 mg / 정제), Rimadyl (2 mg / 정제)</td> <td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Eosin alchol shandon</td><td>Thermo 과학적인</td><td>6766007</td><td>소모품</td></tr><tr><td>해리스 Hematoxylin</td><td>열 과학적인</td><td>143907</td><td>소모품</td></tr></tbody></table>

쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

재생 의학 조건 전통적인 치료에 도전 하는 새로운 대안을 제공 합니다. 정도와 종에 걸쳐 tendinopathy의 사망률이 조직의 한정 된 치료 속성 결합, 세포 치료에 대 한 검색 메시지가 있고 그들의 효능을 연구 실험 모델의 개발을 추진. 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSC UCM)는 매력적인 후보 때문에 풍부 하 고, 수집, 윤리적인 우려 및 기형종 형성의 위험 회피 아직 원시적인 배아 줄기 세포를 더 밀접 하 게 닮은 쉽게 보다 성인 조직 유래 MSCs 상당한 관심은 회전 타원 체 형성을 통해 MSCs의 재산을 강화 하는 전략으로 키토 산에 집중 했다. UCM-MSCs을이 종이 세부 기법 키토 산 필름 spheroids를 준비 하 고 표면 마커 식에 회전 타원 체 형성의 효과 분석. 따라서, 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델의 창조는 UCM MSC spheroids 키토 산 필름 형성의 vivo에서 이식에 대 한 설명 되어 있습니다. 아니 합병증 관찰 되었다 병 적 상태에 관하여 연구에서 스트레스 상승 효과, 또는 조직 감염. 7 일 운영된 쥐의 총 기능 점수 정상 쥐 보다 낮은 했지만 수술 후 28 일 이내 정상으로 돌아왔다. 조직 치유의 조직학 점수 7 일 평가 처리 결함에 응고 이물질 반응, 그리고 28 일에 치료 진행의 부재의 존재를 확인 했다. 이 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 각 쥐에는 내부 통제의 창조를 통해 간 개별 변형 제어, 수용 병 적 상태와 관련 된 되었고 치료 힘 줄과 치료의 차이점의 탐지를 허용.

현재 연구에서 결과 ± SD (표준 편차)를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 셀 6 mares의 탯에서 고립 되었다 및 표준 또는 키토 산 컨디셔닝에서 각 세포 표면 마커를 표현 하는 격리 된 셀 라인의 비율 비교 했다 프리드먼 테스트와 함께 비패라메트릭 분산 분석으로 반복 측정 한다입니다. 힘 줄 결함 모델 생성 8 쥐 7 일 수술 후 평가 위해 사용 되었다 및 12 쥐 28 일 평가 위해 사용 되었다. 기능 결과의 결과 ± SEM (뜻의 표준 오류)을 의미 하는 대로 표시 됩니다 하 고 t-검정을 사용 하 여 비교. UCM은 셀룰러 소스 그것의 풍부, 수집, 및 다른 태아 adnexa 소스40기준으로 우수한 확산의 용이성으로 인해로 선정 됐다. UCM 표준 접시에 배양에서 분리 된 세포 확장에 걸쳐 구와 같은 모양을 유지. 셀 키토 산 판 (그림 8)에 경작 하는 때 sph...

이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

이 양측 쥐 모델의 전반적인 목표는 동물 사용을 최적화하고 힘줄 결손에 대한 치료 후보를 평가하는 것입니다. 이 방법은 정형외과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 건병증에 대한 세포 요법 평가와 같은.이 모델의 주요 장점은 개인 간 변동을 제어하여 처리 간의 차이를 감지하는 데 필요한 동물의 수를 줄인다는 것입니다. 쥐에서 양측 표준화 슬개골 힘줄 결손의 생성은 배우기 어렵기 때문에 모델의 시각적 시연이 중요합니다. 이 모델은 국소 해부학에 대한 충분한 지식, 강력한 기본 수술 기술 및 작은 구조물에서 작업하는 동안의 정밀도를 필요로 합니다.먼저 수확한 말 탯줄을 항생제가 함유된 실온 PBS를 사용하여 50ml 튜브에 두 번 세척합니다. 다음으로, 조직을 150mm 플레이트로 옮기고 2인치 길이의 조각으로 절단합니다. 그런 다음 조각을 50ml 튜브에 옮기고 항생제가 함유된 PBS로 씻어 혈액을 제거합니다.실온에서 두세 번 반복하십시오. 다음으로, 탯줄의 조각난 부분을 세로로 잘라 길이가 긴 혈관을 노출시킵니다. 집게와 가위를 사용하여 두 개의 동맥과 정맥을 포함하는 이러한 혈관을 제거합니다.이제 두세 개의 조각에서 혈관을 둘러싼 젤리 같은 매트릭스를 수집합니다. 메스로 긁어내십시오. 그런 다음 Wharton's Jelley라고도 알려진 젤리 같은 매트릭스를 잘게 다집니다.다음으로, PBS에서 15ml의 0.1% 콜라겐 분해 효소 유형 1A가 포함된 50ml 튜브에 젤리를 옮기고 완전히 용해될 때까지 3-4시간 동안 부드럽게 흔들면서 조직을 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음으로, 소화된 조직을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 이제 소화된 조직을 15ml의 PBS에 현탁시키고 피펫팅으로 혼합합니다.그런 다음 더 느린 원심분리를 사용하여 PBS로 이 세척을 세 번 반복합니다. 마지막 세척 후 15ml의 PBS에 세포를 재현탁시킨 다음 100미크론 세포 여과기를 사용하여 세포를 여과하고 150배 g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 섭씨 37도에서 갓 만든 배양 배지 10ml에 세포를 재현탁시킵니다.현탁액을 25제곱센티미터 배양 플라스크로 옮기고 세포를 배양하여 3일마다 배지를 교체합니다. 세포가 70-80% 합류점에 도달하면 계대를 통과시키고 배지를 흡인하고 항생제 없이 실온 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 3ml의 0.25%트립신 edta를 사용하여 세포를 분리합

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