Name: 역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 DNA-마그네틱 입자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 배우세요 동적 및 전기 이동 산란 분석을 사용하여 DNA-마그네틱 입자 결합을 평가하는 방법을. 입자 크기와 제타 전위 측정을 통해 결합 효율성을 분석하고 생물의학 응용을 위한 최적화 방안을 제시합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

체코 과학 재단 (프로젝트가 CR 17-12816S) 및 CEITEC 2020 (LQ1601)에 의해 금융 지원은 크게 인정 했다.

1. 마그네틱 나노 입자 합성 <ol><ol><li>FeCl 3의 추가 20 mmol 시트르산 (MNPs)와 자성 나노 입자의 합성 안정화 <li>&#8729; 6 H 2 O (5.406 g) 및 FeCl의 10 mmol 2 &#8729; 4 H 2 O (1.988 g) deoxygenated 이중 증 류 물 (ddd) 20 mL에. 투명 한 솔루션을 얻을 때까지 기계적인 교 반기를 사용 하 여 N 2 분위기에서 비 커에 적극적으로 솔루션을 얻은 볶음.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 150 mL의 1 M NH 4 오, 드롭 들러 떨어지고 퍼 널 (1 시간 또는 더 필요한 경우)를 사용 하 여 추가. 모든 NH 4 오 추가 되는 솔루션 screwable 그릇에 전송 합니다. 30 분에 75 ° C에서 선박 및 열 솔루션을 스크류 
		주의: NH 4 오는으로 분류 부식성 환경에 대 한 위험. 
		참고: 높은 학년 28% NH 4 deoxygenated 물을 사용 하 여 물에 오에서에서 NH 4 오 솔루션 준비.</li>
		<li>수집 및 사용 하 여 자석 세척 ddd 물 100 mL를 사용 하 여 검은 침전. 3 회 반복 한다. 0.5 M 트라이-나트륨 시트르산이 수화물 침전을 50 mL를 추가 합니다. 배 나사. 
		참고: 트라이-나트륨 시트르산이 수화물의 deoxygenated 솔루션 사용.</li>
		<li>쥡니다 (35 kHz, 100%의 진폭)와 1 h. 80 ° C에서 열 배를 통해 다시 분산 된 침전 
		참고: 충분 한 힘의 sonicator 필요.</li>
		<li>실내 온도에 솔루션 식힙니다. 침전 한 자석을 사용 하 여 수집 하 고 상쾌한 제거. 다시 검은 진흙 sonicator (35 kHz, 100%의 진폭)를 사용 하 여 ddd 물 50 mL에 분산.</li>
		<li>50 mL 원심 분리기 튜브에 aliquots (25 mL)을 전송 하 고 아세톤 20 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 2400 x g에서 원심과 supernatants 제거.</li>
		<li>다시 침전을 분산 하 고 24 헤에 대 한 적합 한 볼륨의 낮은 분자량 컷오프 투 석 장치 (500-1000 다)를 사용 하 여 물에 대 한 솔루션 dialyze 
		참고: 준비 제조 업체에 따르면 투 석 장치 &#39; s 요구.</li>
	</ol></li> <li>분기 polyethylenimine (MNPs_PEI)로 자성 나노 입자의 합성 <ol><li>유리 비 커에 얻은 MNPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 2 개 mL를 추가. Ddd 물 38 mL을 추가 하 고 sonicate (35 kHz, 100%의 진폭) 서 스 펜 션 (10 분).</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 추가 10%의 10 mL 분기 polyethylenimine (평균 25 kDa). 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>수집 자석을 사용 하 여 침전 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 다시 침전 20 mL ddd 물에 분산. 5 회 반복 후 마지막 정지 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>자성 나노 입자의 합성 실리 카 (MNPs_TEOS) 수정 <ol><li>유리 비 커에 10 mL 취득된 MNPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 추가. 물과 에탄올의 130 mL 60 mL를 추가 합니다. 28% NH 4 오 6 mL을 추가 하 고 솔루션을 sonicate.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 tetraethyl orthosilicate의 1 mL을 추가. 이후 12 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). Ddd 10 mL에 다시 분산 입자 물와 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>아미노 그룹 (MNPs_APTES)로 자성 나노 입자의 합성 <ol><li>유리 비 커에 얻은 MNPs_TEOS 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. 45 mL 물과 에탄올의 50 mL를 추가 합니다. (35 kHz, 100%의 진폭) 솔루션을 sonicate.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 따라 0.5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane의 추가. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). 다시 분산 입자의 ddd 5 mL에 물과 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)를 sonicate.</li>
	</ol></li></ol> 2. 마그네틱 미 합성 <ol><li><ol><li>2 M 알 것 3, 1 M 코의 12.5 mL 및 screwable 그릇에 ddd 물 205.875 mL의 추가 25 mL 자기 미의 합성 시트르산 (MMPs)와 안정. 자석 교 반 중 1 M FeSO 4 6.675 mL를 추가 합니다. 2 헤에 대 한 따뜻한 물 목욕 (90 ° C)에 즉시 전송 선박 
		참고: 알 3와 ddd에서 코 솔루션 준비 물.</li>
		<li>실내 온도에 솔루션 식힙니다. 사용 하 여 자석 및 세척 ddd 물 50 mL (5 번)을 사용 하 여 검은 침전을 수집 합니다. 0.5 M 트라이-나트륨 시트르산이 수화물 침전을 50 mL를 추가 합니다. 배 나사.</li>
		<li>쥡니다 (35 kHz, 100%의 진폭)와 1 h. 수집 검은 침전 자석 및 세척 (10 번) ddd 물 50 mL를 사용 하 여 그것을 사용에 대 한 80 ° C에서 열 배를 통해 침전 redisperse.</li>
		<li>수정 MMPs 분기 polyethylenimine (MMPs_PEI)와 실리 카 (MMPs_TEOS) 및 아미노 그룹 (MMPs_APTES) MNPs 프로토콜에 비슷합니다. 2.2, 2.3, 2.4, 각각에 대 한 자세한 내용은 섹션을 참조 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>분기 polyethylenimine (MMPs_PEI)로 자기 미의 합성 <ol><li>유리 비 커에 MMPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. Ddd 물 38 mL을 추가 하 고 (35 kHz, 100%, 10 분의 진폭) 솔루션을 sonicate. 빠른 기계 교에서 10%의 10 mL 분기 polyethylenimine (평균 25 kDa) 추가 합니다. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>침전 한 자석을 사용 하 여 수집 하 고 상쾌한 제거. 두 배 증류수 20ml에 침전 redisperse 5 회 반복 후 (35 kHz, 100%의 진폭) 최종 솔루션을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>합성 실리 카 (MMPs_TEOS)로 자기 미의 <ol><li>유리 비 커에 MMPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. 물과 에탄올의 130 mL 60 mL를 추가 합니다. 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)를 sonicate 고 추가 28% NH 4 오 6 mL.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 tetraethyl orthosilicate의 1 mL을 추가. 이후 12 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). Ddd 물 5 mL에 입자 redisperse 고 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>아미노 그룹 (MMPs_APTES)로 자기 미의 합성 <ol><li>유리 비 커에 MMPs_TEOS 솔루션 (~0.1 g/mL)의 3 개 mL를 추가. 45 mL 물과 에탄올의 50 mL를 추가 합니다. 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 따라 0.5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane의 추가. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회)과 물 (3 시간) 50 mL에 그것을 씻어. Ddd 물 3 ml에서 입자 redisperse 고 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li></ol> 3. 자석 입자 크기 분석을 사용 하 여 DL 다시 산란 검출기 각도 (173 °) 및 633의 빔 파장 적용 되는 <ol><li>물에서 입자 크기 <ol><li>는 DL 사용 하 여 악기 nm. 
		참고: 다시 산란 DL 여러 분산을 피할 수 있다 집중된 샘플에 적합 하다. 사이드 산란 (검출기 각도 90 °) 앞으로 산란 (검출기 각도 15 °) DL 적합 작은 입자 및 입자를 각각 혼합.</li>
		<li>이전 측정 물에 3 분에 대 한 입자 sonicate 
		참고: 입자의 희석된 솔루션을 사용 합니다. 이 위해 입자의 9.6 µ L 96 µ L의 물 혼합.</li>
		<li>신중 하 게에 폴리스 티 렌 라텍스 입자 솔루션의 50 µ L를 플라스틱 큐 벳 거품의 형성을 방지 하는 고. 
		참고: 각 샘플 사용 일회용 cuvette (자료 목차 참조).</li>
		<li>참고는 베트의 선명도 광선의 방향. 샘플 홀더에 셀을 삽입 하 고 챔버 닫습니다.</li>
		<li>측정에 대 한 다음 매개 변수를 사용 하 여: 온도: 25 ° C, 분산 단계 (철)의 굴절률: 2.344; 분산 환경 (물)의 굴절률: 1.333 
		참고: 소설 또는 하이브리드 재료를 개발 하는 경우에 특히 더 정확한 결과 얻으려면 한 굴절 계를 사용 하 여 굴절률의 측정 수행.</li>
	</ol></li></ol> 4. DNA, 자석 입자 및 바인딩 버퍼 준비 <ol><li>DNA 주식 <ol><li>사용 10 mM Tris HCL 버퍼 (pH = 8) 희석 및 DNA의 저장. 실험실 (섹션 5.2 반응 설정 및 조건에 대 한 참조)에서 직접 PCR 프로토콜으로 증폭 될 수 있는 표준 DNA 샘플을 사용 합니다. 498 기본적인 쌍 (bp) 살 균 소 λ 컨트롤에서 xis 유전자의 증폭, 다음 프라이 머를 사용 합니다. 뇌관을 앞으로: 5 &#39;-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3Ɔ 반전 뇌관: 5 &#39;-TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC-3 &#39;</li> <li>정화 PCR 제품 상업적 DNA 정제 키트를 사용 하 여. 
		참고: 실리 카 열 기반 프로시저를 사용 하 여 상업적 키트 항복 &#62; 100 ng / µ L 정화 DNA.</li>
		Spectrophotometric 메서드를 사용 하 여 DNA의 <li>측정 농도 (260에서 흡 광도 nm). 10의 작업 솔루션 위의 지시로 10 11 복사본 / µ L의 DNA 재고 희석 10, 10 9, 10, 8 및 10 7 복사본 / µ L. 
		참고: PCR 제품의 복사본의 수 평균 분자량은 각 혈압에 대 한 650 다 가정 다음 방정식에 따르면 산출 될 수 있다: DNA 복사본 / µ L = (ng / µ L에 수량 * 6.022x10 23 복사본/mol) / (498 bp * 혈압의 650 g/mol * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>자석 입자 <ol><li>입자는 자석 없이 토사를 허용 하 고 상쾌한 제거. 1시 20분 믹스 ddd 물 자석 입자의 v/v 비율 (입자: 물). 
		참고: 볼륨 기반 접근 MNPs와 MMPs의 동등한 대 중은 쉽게 비교 하기 어려운 이후 자석 입자의 수량을 설명 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>버퍼 바인딩 <ol><li>0.75 M 나트륨 아세테이트 HCL 솔루션의 빠른 준비에 대 한 (pH = 6), 3m 나트륨 아세테이트의 1 mL의 1 m m HCL 3 mL 혼합. 
		참고: 바인딩에 사용 되는 모든 솔루션은 4에 저장 될 수 있다 ° C. 참고 낮은 온도 크게 에탄올 솔루션의 경우 특히 바인딩 증가. 더 나은 재현성에 대 한 솔루션의 온도 심사의 정확성 제어.</li>
	</ol></li></ol> 5. 효율의 DNA 격리를 사용 하 여 정량 PCR 테스트 <ol><li>수정 MMPs 또는 MNPs DNA 격리 <ol><li>96 잘 접시와 작은 볼륨 실험에 대 한 96 잘 접시에 맞게 자석 사용.</li>
		<li>다음 바인딩 솔루션 혼합물을 사용 하 여: 8 µ L 수정 MMPs MNPs, 10 µ L 나트륨 아세테이트-HCl (0.75 M, pH = 6), 60 µ L 85% 에탄올, 10 µ L DNA의 (10 10 복사본 솔루션).</li>
		<li>믹스 pipetting으로 잘 하 고 3 분에 대 한 자석에 접시를 놓습니다. 자석에 접시를 실행 하는 동안 솔루션을 제거 하 고 세척에 대 한 85% 에타 놀의 100 µ L 추가.</li>
		<li>제거 에탄올. 
		참고: 몇 초 동안 건조 에탄올을 허용 하지만 지나치게 건조 하거나 균열 입자를 두지 마세요. 그들은 입자 이상 건조 하는 경우 차입 솔루션 디졸브 어려울 것 이다.</li>
		<li>자석에서 접시를 제거 하 고 차입 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. Pipetting으로 잘 섞는다. 자석에 다시 접시를 놓고 eluted DNA를 수집 (~ 37 µ L). 추가 분석까지-20 ° C에서 eluent 저장.</li>
	</ol></li> <li>정량 PCR <ol><li>드는 외 프로토콜에 따라 재고 단계 xis 유전자의 복사본을 계량 하기 4.1.1에서에서 DNA를 준비 하는 데 사용 된 뇌관을 사용 하 여. 10</li> <li>마스터 믹스 솔루션 테스트 샘플의 양에 따라 준비 후 PCR 튜브 또는 흰색 배경 96 잘 접시에 혼합물을 배포.</li>
		<li>20 µ L PCR 혼합의 완전 한 볼륨에 대 한 다음 수량을 사용 하 여: 10 µ L 중 합 효소 / 염료 혼합 intercalating (재료의 표 참조), 2 µ L DNA 샘플, 2 µ L 앞으로 뇌관 (10 µ M), 2 µ L 역 뇌관 (10 µ M)</li>
		<li>다음 프로그램에 따르면 thermocycler 설정: 120 95 ° C s, 40 사이클 (15 95 ° C s, 64 ° C 15에 대 한 s, 45 ° C 68 s), 68 ° C 5 분</li>
		<li>표준 및 샘플을 사용 하 여 triplicates 주기 임계값을 계산 하 고 각 샘플에서 검색 하는 DNA의 사본의 수를 추정 하는 표준 곡선을 구성. 여기에 사용 되는 악기가 자동으로 수행 합니다.</li>
		<li>여기, DNA의 사본의 수 총 차입 볼륨 (~ 40 µ L)으로 추정 된다. DNA 솔루션 (완전히 10 11 부)를 바인딩 추가 원래 금액을 해당 검색의 비율 0 ~ 100 간격 넘어 다를 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 6. DNA-마그네틱 입자 바인딩 분석을 사용 하 여 DL <ol><li>DNA 바인딩 <ol><li>큰 볼륨에 대 한 실험 (1.5 mL 튜브)에 다음과 같은 바인딩 솔루션 혼합 사용: 96 µ L MMPs MNPs, 120 µ L 나트륨 아세테이트-HCl의 수정 (0.75 M, pH = 6), 720 85% 에탄올, 120 µ L DNA의 µ L (10 10 복사본 솔루션) 또는 120 µ L Tris HCL 버퍼 (10 m m, pH = 8) 컨트롤.</li>
	</ol></li> <li>제타 잠재력 분석 <ol><li>준비 2 바인딩 솔루션, dna와 Tris HCL 버퍼 제어 단계 6.1.1에서에서 지시. 거품의 형성을 방지 하려면 신중 하 게 일회용 셀에 바인딩 혼합물의 800 µ L를 플라스틱. 
		참고: 표면 제타 잠재적인 (재료의 참조 테이블)의 측정에 대 한 일회용 cuvette 사용.</li>
	</ol></li> <li>DL 계기에 측정에 대 한 다음 매개 변수를 사용 하 여: Smoluchowski 모델은 F(ka) 1.5, 온도: 25 ° C, 분산 단계 (철)의 굴절률: 분산 환경 (물)의 2.344, 굴절률: 1.333. 
	참고: DNA-마그네틱 입자 상호 작용의 속도 직접 복제의 측정을 적용 됩니다. 악기에 의해 단일 측정 60-70 s를 걸립니다. 여기, 악기 1 분 10 측정 지연 간격을 지시 했다. 편의상, 결과 표시 됩니다 시간 = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18 분 첫 번째 독서에서.</li>
</ol>

<ol><li>Kulinski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+module+for+bacterial+lysis+and+isolation+of+DNA+from+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).</li>
<li>Loonen, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Pathogen+DNA+Isolation+Methods+from+Large+Volumes+of+Whole+Blood+to+Improve+Molecular+Diagnosis+of+Bloodstream+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).</li>
<li>Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+from+processed+and+unprocessed+wood%3A+Factors+influencing+the+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).</li>
<li>Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/308698261_Potential_of_Magnetic_Nanoparticles_for_Hepatitis_B_Virus_Detection">Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection.</a> J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).</li>
<li>Ulbrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+with+polymers+and+magnetic+nanoparticles%3A+covalent+and+noncovalent+approaches%2C+release+control%2C+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies.</a> Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).</li>
<li>Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1070/RC2014v083n04ABEH004412/meta">Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems.</a> Rus Chem Rev. 83 (4), 299(2014).</li>
<li>Xu, R. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674200108000357">Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.</a> Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).</li>
<li>Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669017302169">Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements.</a> Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).</li>
<li>Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+DNA+by+Polycharged+Magnetic+Particles%3A+An+Analysis+of+the+Interaction+by+Zeta+Potential+and+Particle+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).</li>
<li>Tenorio-Neto, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+magnetic+core+conducting+polypyrrole+polymer+shell%3A+Preparation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).</li>
<li>Baharvand, H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/272536835_Encapsulation_of_ferromagnetic_iron_oxide_particles_by_polyester_resin">Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin.</a> e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10965-013-0199-0">Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin.</a> J Polym Res. 20 (7), (2013).</li>
<li>Heger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+Nanoparticles+as+a+Platform+for+FRET-Based+Sarcosine+Picomolar+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25451956">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 제타 잠재적인 통해 자기 입자를 DNA 바인딩 설명 하는 이론적 원리 질문에서 했다. 프로토콜 합성 및 자성 나노 입자와 미의 수정에 설명합니다. DNA 제어 및 바인딩 솔루션의 준비를 위한 방법 또한 설명 합니다. 여기에 표시 된 두 가지는 DNA 입자 상호 작용의 심사에 대 한: 양이 많은 PCR 그리고 DL 접근. DL의 입자의 물리 화학적 변화 세 가지 지표를 제공 합니다: 입자 크기, 증가할수록 색인 및 잠재적인 제타. 입자 크기 변화는 직접 집계 또는 분해 작용을 나타냅니다. 증가할수록 인덱스 값 monodispersed에서 배열 하는 시스템에서 입자의 분포에 설명 합니다 (인덱스 &#60; 0.05) 높은 polydispersed를 (색인 &#62; 0.7). 제타 잠재적인 입자 어디 매우 긍정적인 입자 표시 값 보다 30 mV와 매우 부정적인 입자 값 표시-30 보다 큰 표면 충전에 따라 분류할 수 있다 뮤직 비디오. 예측, 상대적으로 솔루션 바인딩 polycharged 자석 입자의 zeta 잠재력...

DNA 분리 분자 생물학에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 핵 산 추출 방법의 개발 유전체학, metagenomics, epigenetics, 및 transcriptomics의 신흥 분야에 큰 영향을가지고. DNA 분리 등 의료 (법의학/진단 도구와 전조 생체), 바이오 응용 프로그램 및 환경 응용 프로그램 (metagenomic 생물 다양성, 병원 체, 정도와 감시)의 넓은 범위가 있다. 정화 하 고 다른 비늘 같은 혈액, 소변, 토양, 나무, 그리고 샘플의 다른 종류와 다른 자료에서 DNA를 분리 하는 수요 증가 되었습니다. 1 , 2 , 3 , 4
나노 및 마이크로 크기의 입자는 DNA 분리 및 특히 그들의 높은 표면적 때문에 적합 때 그들은 자기장에 의해 움직일 수 있다. 입자 크기, 충전 등의 물리 화학적 특성 크게 대상 생체를 바인딩할 그들의 능력을 좌우할 수 있다. 5 추가 바인딩 생체의 향상 그리고 입자를 안정화, 다른 화학 수정 (표면 코팅) 활용할 수 있습니다. 바인딩에 대 한 많은 다른 전략 공유 및 공유 비 상호 작용에 따라 분류 됩니다. 반면 입자 구성의 금속, 합금 또는 그것의 밀도, 다공성, 고 표면에 영향을 미칠 수 있는 다른 자료에 의해 지 어질 수 있다 6 입자의 크기는 직접 그들의 자화 특성 적용 됩니다. 7 거기 방법은 신뢰할 수 있는 측정 하는 작은 입자의 표면 전 하입니다. 대신, 미 끄 러 짐을 비행기 (나노 표면에서 거리)에 전기 잠재력은 측정할 수 있습니다. 8 이 값 이라고 제타 잠재 하며 그것은 DL 통해 나노-및 microparticle 안정성의 평가 위해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 9 의 값 뿐만 아니라 pH 이온 강도 입자의 표면 특성에 뿐만 아니라 분산 환경에 매우 의존 때문에, 그것은 또한 증명할 수이 표면 사이 상호 작용으로 인 한 변화는 입자 그리고 관심사의 분자입니다. 10
다른 한편으로, 탈수 조건 (A DNA 형태) 전시 압축된 conformations 촉진 하는 그것의 강 수 (집계) 비교 하는 경우에 일반적으로에서 DNA 구조 B DNA 형태로 발생 합니다. 정전기 (이오니아와 H-본드) 그들의 sterically 액세스할 수 인산 인해 다른 자료에 DNA의 바인딩을 제어 하는 주요 세력 그리고 질소 기지 (특히 구 아닌). 7 , 10
이 작품에서 자기 나노 입자와 미의 3 개의 대표적인 화학 수정 분석 (그림 1A). 합성 방법 및 나노 입자와 미의 화학 수정 설명 합니다. 바인딩 솔루션, DNA 강 수 (pH, 이온 강도, 그리고 탈수)의 이론적인 원리에 그 협정 DNA 바인딩 및 차입을 평가 하는 데 사용 됩니다. 정량 PCR는 대표적인 나노 입자와 미 (그림 1B)에서 DNA의 차입 효율성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 입자 크기, 증가할수록 색인, 및 잠재적인 제타는 입자 표면 (그림 1C)에 발생 하는 물리 화학적 변화를 시각화 하는 데 사용 되는 중요 한 매개 변수. 그것은 자성 입자 표면의 화학 특성에 강조 해야 합니다. 이 프로토콜의 범위를 넘어이 단계 동안, 몇 가지 현대 기술은 화학 수정의 효율성 조사에 적용할 수 있습니다. 11 , 12 , 13 , 14 입자 표면의 적외선 스펙트럼을 평가 하 고 무료로 화학 한정자의 스펙트럼을 비교 하는 푸리에 변환 적외선 분광학 (FTIR)을 사용할 수 있습니다. 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 소재 표면 원소 구성 식별 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 기술입니다. 다른 전기, 현미경, 분 광 방법 입자 합성의 품질에 빛을 발산 하 게 사용할 수 있습니다. 이 작품 DL 통해 DNA-마그네틱 입자 상호 작용을 분석 하는 새로운 관점을 강조 한다.

<table><tbody><tr><td>철 (III) 염화물 육수화물</td><td>시그마 -알드리치</td><td>207926</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>철 (II) 염화물 사수화물</td><td>시그마 -알드리치</td><td>380024</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>철 (II) 황산 헵타 하이드레이트</td><td>시그마 -알드리치</td><td>F8263</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>펜타</td><td>10060-11000</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>구연산나트륨 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>W302600</td><td>자분립 합성</td></tr><tr><td>테트라에틸 오르토실리케이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>131903</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>(3-아미노프로필)트리에톡시실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>440140</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민, 분지, 평균 Mw ~25,000</td><td>시그마-알드리치</td><td>408727</td><td>자성 입자 합성</td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp;</td><td>자분 입자 합성</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>질산 칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>수산화 칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td><td>Spectrum labs</td><td>G235063</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>오버헤드 교반기</td><td>witeg Labortechnik GmbH</td><td>DH. WOS01035</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>자분 합성</td></tr><tr><td>BRAND UV 큐벳 마이크로</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>크기 측정용 큐벳</td></tr><tr><td>UV 큐벳 마이크로 용 브랜드</td><td>캡 Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>크기 측정용 큐벳 캡</td></tr><tr><td>접힌 모세관 제타 셀</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td>제타 전위 측정을 위한 큐벳</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>크기 및 제타 전위 측정을 위한 장치</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO NanoQuant 기기</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>DNA 농도 측정을 위한 장치</td></tr><tr><td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S 기기</td><td>: Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Thermocycler</td></tr>, <tr><td>MinElute 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>, 아세트산나트륨</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>S7670</td>, <td>DNA 결합</td></tr></tbody></table>

역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 dna-마그네틱 입자

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

자성 입자를 사용 하 여 DNA의 분리는 생명 공학 및 분자 생물학 연구에 높은 중요성의 필드입니다. 이 프로토콜 통해 동적 산란 (DL) 및 전기 이동 산란 (ELS) 바인딩 DNA-마그네틱 입자의 평가 설명 합니다. DL 분석 입자 크기, 증가할수록, 잠재적인 제타 등 입자의 물리 화학적 특성에 귀중 한 정보를 제공 합니다. 후자의 설명 표면 입자는 DNA와 같은 재료의 정전기 바인딩에 주요 역할을 담당을 합니다. 여기, 비교 분석 3 화학 수정 미, 나노 입자와 DNA 바인딩 및 차입에 대 한 그들의 효과 이용 한다. 화학 수정에 의해 분기 polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate 및 (3-aminopropyl) triethoxysilane 조사. 이후 DNA 음 전 전시, 입자 표면의 제타 전위의 DNA 바인딩 시 줄어 전망 이다. 클러스터의 형성 입자 크기에 영향을 또한 한다. 격리에서 이러한 입자의 효율성과 DNA의 차입을 조사 하기 위하여 입자는 낮은 pH (~ 6), 이온 강도 및 탈수 환경에 DNA와 혼합 됩니다. 입자는 자석에 세척 되 고 다음 DNA는 eluted Tris HCl 버퍼에 의해 (pH = 8). DNA 복사 번호 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 추정 된다. 제타 전위, 입자 크기, 증가할수록 및 PCR 양적 평가 하 고 비교 됩니다. DL는 통찰력과 지원 DNA 격리에 대 한 입자의 심사 과정에 새로운 관점을 추가 하는 분석 방법 이다.

화학 합성 및 자성 입자의 수정에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 6 마그네틱 입자 합성 되었고 DNA 바인딩 분석. 분석 요약 표 1에 표시 됩니다. 바인딩 솔루션과 물에서 입자의 크기를 비교 하 여 그것은 분명 모든 입자 2-22 겹으로 솔루션 바인딩 집계. 어떤 입자는 더 DNA;의 더 많은 주름을 집계 그러나이 되지 직접 상관 DNA 검색 양이 많은 PCR (표 1)에 의해 감지. 제타 잠재적인 (10 ~ 2 분 간격으로 측정) 세 입자; 보여주었다 DNA 날카로운 드롭 대 컨트롤에 입자의 비교 즉: MNPs_APTES, MMPs_TEOS 및 MMPs_APTES (그림 2). 시간이 지남에 따라 잠재적인 제타 동향도 전에 그들은 대부분의 경우 (그림 3) 안정화는 처음 세 개의 수치...

이 프로토콜 자석 입자의 합성 및 역동적이 고 전기 이동 산란을 통해 그들의 DNA 바인딩 속성의 평가 설명합니다. 이 방법은 그들의 증가할수록 입자 크기에서 변화를 모니터링에 집중 하 고는 입자 표면의 제타 전위 주요 바인딩에 DNA와 같은 재료의 역할.

역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 DNA-마그네틱 입자

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

이 실험의 전반적인 목표는 동적 및 전기 영동 광 산란을 통해 DNA와 자성 입자의 결합을 분석하는 것입니다.이 방법은 핵산과 자성 입자 사이의 결합이 얼마나 빠르고 강한지와 같은 생명 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 크기, 다분산성 또는 제타 전위와 같은 입자의 물리적-화학적 변화를 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 빠르고 민감한 DNA 분리에 대한 수요가 증가함에 따라 분자 진단으로 확장됩니다. 이 절차에서는, 20 밀리리터의 탈산소화 이중 증류수에 20 밀리몰의 염화 제2 철과 염화 철 10 밀리몰을 첨가하고, 투명한 용액이 얻어질 때까지 기계적 교반기를 사용하여 질소 가스 분위기의 비이커에서 얻은 용액을 격렬하게 교반합니다. 그런 다음 빠른 기계적 교반 하에서 1 시간 동안 적하 깔때기를 사용하여 1 몰의 수성 암모니아 1 몰 150 밀리리터를 한 방울씩 첨가합니다. 그 후, 용액을 나사식 용기로 옮기고 용액을 75도로 가열합니다.

dna-magnetic-particle-binding-analysis-dynamic-electrophoretic-light

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 그것은 한 손으로 그리고 다른 한편으로는 태그를 단백질과 두 번째 레이블이 붙은 단백질 (예 : poliovirus) 간의 친화력에 자석 구슬 및 태그 단백질 (예 : nanobodies) 사이의 상호 작용을 기반으로 안정적인 기술입니다.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

평면 샘플 자성 입자를 이미지화하는 스캐너는 자기 검출 기법 혼합 평탄한 주파수를 이용하여 개발되었다. 입자의 비선형 nonhysteretic 자화에서 자기 상호 변조 응답은 두 개의 주파수 대역 여기에 기록된다. 얇은 생물학적 시료의 2 차원 영상을 위해 사용될 수있다.

평면 샘플에 자석 입자 이미징에 대한 자기 인식 스캐너를 혼합 주파수

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

여기에서는 개개의 나노 입자의 제타 포텐셜을 결정하는데 사용될 수있다 입자 전위 속도의 측정을 통해 나노 입자의 표면 화학을 특징 저항 펄스 감지 기술에 통합 된 폴리 우레탄 동조 나노 기공을 사용한다.

조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여

여기, 안정 동위 원소와 핵 자기 공명 (NMR) 분광학 및 눈금을 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용의 후속 묘사는 생산 및 분류는 단백질의 정화에 대 한 프로토콜 선물이 Thermophoresis (MST) 실험입니다.

핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

당사는 광학 트랩에 고정된 선형 DNA 분자에서 형광 라벨링되고 완전히 재구성된 Cdc45/Mcm2-7/GINS(CMG) 헬리카제의 움직임을 직접 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다.

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

부동액 단백질(AfP)은 얼음 의 특정 평면에 결합하여 얼음 성장을 방지하거나 느리게 합니다. 형광계 얼음 비행기 선호도(FIPA) 분석은 AFP 바인딩 된 얼음 비행기의 측정을위한 원래 얼음 에칭 방법을 수정한 것입니다. AFP는 형광으로 표시되고, 거시적 단일 얼음 결정에 통합되고, UV 빛 아래에서 시각화됩니다.

형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

콜로이드 프로브 나노스코피는 다양한 분야에서 사용하여 콜로이드 시스템의 물리적 안정성과 응고 역학에 대한 통찰력을 얻고 생물학적 시스템을 사용하여 약물 발견 및 제형 과학을 지원할 수 있습니다. 에 설명된 방법은 이러한 시스템을 연구하기 위한 양적 및 질적 수단을 제공합니다.

콜로이드 프로브 Nanoscopy을 사용하여 입자 간 상호 작용의 양적 및 질적 시험

배우세요 동적 및 전기 이동 산란 분석을 사용하여 DNA-마그네틱 입자 결합을 평가하는 방법을. 입자 크기와 제타 전위 측정을 통해 결합 효율성을 분석하고 생물의학 응용을 위한 최적화 방안을 제시합니다.

역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 DNA-마그네틱 입자

더 많은 동영상 탐색