Name: 리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 학습하세요 리보솜 프로파일링을 이용한 Saccharomyces cerevisiae의 게놈 전체 번역 정량화 방법입니다. 이 기술은 번역 조절 메커니즘 연구와 단백질 합성 이해에 높은 민감도를 제공합니다.

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이 작품은 AG040191 및 AG054566 VML에 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 이 연구는 VML 노화 연구를 위한 미국 연맹에서 멀리 연구 보조금 받는 동안 실시 됐다.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Ribo-Seq 접근 mRNA 번역에서 vivo에서 게놈 넓은 레벨 3에서 분석을 위한 강력한 기술로 떠오르고 있다. 연구 모니터링 단일 codon 해상도 번역에서는이 방법을 사용 하는 변환 규칙에 대 한 우리의 이해에 기여 했다. 자사의 장점에도 불구 하 고 Ribo-Seq는 몇 가지 제한이 있습니다. 리보솜 RNA (rRNA) 조각 리보솜 보호 발자국 Ribo-Seq 실험 9,25에서 얻을 수 있는 유용한 연속 읽기의 수확량 감소의 격리 중 공동 순화 항상 있습니다. 우리의 데이터 rRNA 오염 모든 읽기 (그림 8)의 40-50%에 기여할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 이 한계를 극복 하는 방법 중 하나는 시퀀싱 깊이 증가 하는. 시퀀싱의 추가 라운드 분석된 샘플의 각 연속 읽기의 필요한 수를 얻을 때까지 수...

mRNA의 번역 단백질 식의 규칙에 있는 중요 한 역할 셀에 기본적인 프로세스 중 하나입니다. 따라서, mRNA 번역은 밀접 하 게 다른 내부 및 외부 생리 자극 1,2에 대 한 응답 제어 됩니다. 그러나, 변환 규칙의 메커니즘 understudied 남아 있습니다. 여기, 우리는 리보솜 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 리보솜 프로 파일링 기법의 전반적인 목표는 연구 하 고 계량 다른 세포질 조건 하에서 특정 한 mRNAs의 번역입니다. 이 기술은 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 게놈에 걸쳐 리보솜 인 양적 분석을 하며 단백질 합성에서 vivo에서 단일 codon 해상도 3,4속도 모니터링 현재,이 방법은 단백질 번역의 수준을 측정 하는 가장 고급 방법을 이며 다른 현재 사용할 수 있는 기술, 예를 들면 microarrays에 의해 밝혀질 수 없는 정보를 제공 하는 유용한 검색 도구 입증 또는 번역 상태 배열 분석 (TSAA) 5. 성적 수준 및 변환 출력에 결합 된 변화에 대 한 보고서를 프로 파일링 하는 리보솜으로 그것은 또한 다른 방법에 비해 훨씬 더 큰 감도를 제공 합니다.
이 방법은 mRNA 파편 리보솜 보호 3의 깊은 시퀀싱을 기반으로 합니다. 리보솜 단백질 번역 동안 보호 ~ 28 nt 부분의 mRNA (발자국 이라고 함) 6. 리보솜 보호 조각의 순서를 결정 하 여 Ribo-Seq 번역된 mRNA에 리보솜의 위치를 지도 하 고 적극적으로 단백질 3,7로 번역 될 것 mRNA의 어떤 영역을 식별할 수 있습니다. 또한, 우리 양적 발자국을 주어진된 mRNA 사본 수를 계산 하 여 mRNA의 번역을 측정할 수 있습니다.
리보솜 보호 조각을 분리 하기 위하여 세포 lysates 처음 ribonuclease 소화 다음 리보솜에 번역 억제제 처리 됩니다. 반면 무료 mRNA, 리보솜에 의해 보호 되지 않는 번역 된 mRNAs의 일부는 ribonuclease에 의해 타락, 리보솜 보호 mRNA 파편 그대로 리보솜-풋프린트 단지 정화 하 여 복구할 수 있습니다. 이 mRNA 발자국 cDNA 도서관으로 변환 그리고 깊은 시퀀싱 (그림 1)에 의해 분석 됩니다. 리보솜 프로 파일링을 병렬로 그대로 mRNA는 동일한 샘플에서 추출 하 고 시퀀스. MRNA 풍부 측정 Ribo-Seq로 식별 하는 번역의 수준을 비교 하 여 특별히 업 또는 다운-규제 번역의 수준에는 유전자를 식별 하 고 게놈 넓은 수준에서 mRNA의 번역 효율을 계산할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 프로토콜은 효 모에 대 한 구체적인, 하는 동안 그것은 유용 해야 한다 또한 연구자 다른 시스템에서 Ribo-Seq 프로토콜을 설정 하려고 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 &무; M 멤브레인 필터</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 원심 필터 (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4&deg; C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE 완충액</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-요소 겔</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-요소 겔</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-요소 샘플 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5.5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' 데데닐라제(10 U/&mu; L)</td> <td>진앙</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X 핵산 샘플 로딩 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8 % TBE 젤</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>산 - 페놀 : 클로로포름, pH 4.5 (IAA 포함, 125 : 24 : 1)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>블루 라이트 트랜스 루미네이터</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>크롬 스틸 비드, 3.2mm</td><td>BioSpec 제품</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>극저온 분쇄기</td><td>Biospec 제품</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>사이클로헥시미드</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물(10mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>인비트로젠</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>그래디언트 분획 시스템</td>: <td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr>, <tr><td>High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td>, <td>5X Phusion HF Buffer와 함께 제공,</td></tr><tr><td>차세대 염기서열분석 라이브러리, 정량 분석 키트</td><td>, Kapa Biosystems</td>, <td>KK4824</td><td></td></tr>, <tr><td>핵산 겔 염색</td>, <td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr>, <tr><td>Optima XE-90, 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) mRNA 분리 키트</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J 엑소뉴클레아제(10 U/&mu; L)</td><td>진원지</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>역전사효소 (200 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>5X first-strand buffer 및 0.1 M DTT</td></tr><tr><td>RNA 단편화 완충액</td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor (20 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무 캡</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA 리가제(100 U/&mu; L)</td><td>진원지</td><td>CL9021K</td><td>10X CircLigase II 완충액 및 50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 마이크로바이알, 1.8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(10,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>10X T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액</td></tr><tr><td>T4 RNA 리가아제 2 절단 KQ(200,000 U/mL)</td>와 함께 제공<td>NEB</td><td>M0373S</td><td>10X T4 RNA 리가제 완충액 및 50% PEG8000</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td>와 함께 제공<td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall 폴리알로머 튜브, 13.2 mL</td><td>벡크만 쿨터</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>UV 모니터</td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae 균주 BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

단백질으로 mRNA의 번역 규칙의 여러 레이어를 포함 하는 복잡 한 공정 이다. 그것은 종종 가정 mRNA 녹음 방송에 있는 변화 단백질 합성, 변화를 반영 하지만 많은 예외 관찰 되었습니다. 최근, 리보솜 프로 파일링 (또는 Ribo-Seq) 이라는 기술을 mRNA의 어떤 영역 단백질 및 게놈 넓은 수준에서 번역의 정량화로 번역 된다 높은 정확도 식별, 수 있도록 강력한 방법으로 떠오르고 있다. 여기, 선물이 신진 효 모에 Ribo-Seq를 사용 하 여 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 일반화 된 프로토콜. 또한, mRNA 풍부 측정 Ribo-Seq 데이터를 결합 수 있습니다 동일한 샘플에서 mRNA 사본의 수천의 번역 효율을 동시에 계량 하 여 비교 실험에 대 한 응답에서 이러한 매개 변수에서 변경 조작 또는 다른 생리 적인 상태에서. 우리는 리보솜 발자국 nuclease 소화, 자당 그라데이션 분류를 통해 그대로 리보솜-풋프린트 단지의 고립과 DNA 라이브러리의 준비를 사용 하 여 적절 한 함께 깊은 시퀀싱에 대 한의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 설명 vivo에서 번역의 정확한 분석을 위해 필요한 품질 제어 합니다.

데이터를 프로 파일링 하는 리보솜의 bioinformatic 분석에 대 한 자세한 파이프라인 되었습니다 8,9위에서 설명한. 또한, 여러 연구 그룹 차동 유전자 표정 분석 및 시퀀싱 데이터를 프로 파일링 방법 10,11,12 리보솜에 대 한 특정의 처리를 위한 생물 정보학 도구 개발 ,13,14,15,,16<sup class="xref...

변환 규칙 단백질 풍부의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리는 높은 처리량 방법 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 번역의 정량 분석에 대 한 설명.

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

이 절차의 전반적인 목표는 mRNA의 어느 영역이 단백질로 번역되는지 확인하고, 게놈 전체 수준에서 신진 효모 saccharomyces cerevisiae의 단백질 번역을 정량적으로 측정하는 것입니다. 리보솜 프로파일링은 단백질과 질병의 속도를 모니터링하고 번역 조절의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법에 비해 훨씬 더 높은 감도를 추가한다는 것이며, 그 중 단일 접촉 해상도에서 생체 내에서 단백질과 질병을 측정할 수 있다는 것입니다.이 프로토콜은 발아 효모에 특정되어 있지만, 포유류 세포 및 조직과 같은 다른 모델 시스템에서 리보솜 프로파일링을 확립하려는 연구자에게도 유용합니다. 추출물은 중간 로그 단계까지 성장한 효모 세포에서 준비됩니다. 유리 홀더 필터 어셈블리를 사용하여 0.45 마이크로멤브레인 필터를 통해 배양물을 여과합니다.주걱으로 펠릿을 긁어내고 액체 질소에서 급속 동결한 다음 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 3.2mm 크롬 스틸 비드 3개를 1.8mm 스테인리스 스틸 튜브에 넣고 튜브를 액체 질소로 미리 냉각합니다. 얼린 펠릿을 넣고 강철 튜브를 실리콘 고무 캡으로 덮습니다.4200rpm에서 10초 동안 극저온 분쇄를 통해 시료를 균질화합니다. 전체 분쇄 절차 동안 샘플을 냉동 상태로 유지하려면 각 분쇄 사이에 최소 10초 동안 액체 질소로 튜브를 냉각하는 것이 중요합니다. 균질화가 완료되면 시클로헥시미드가 포함된 용해 완충액 1ml를 샘플에 추가합니다.피펫팅으로 잘 혼합하고 샘플을 새 1.5 ml 튜브로 옮깁니다. 20, 000 번 g에서 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기. 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.폴리(A)mRNA 분리를 위해 100마이크로리터의 용해물을 다른 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 액체 질소에서 발자국 추출에 사용될 나머지 용해물에 mRNA 샘플이 있는 튜브를 급속 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 발자국 추출 전날 밤, 해동은 이전에 섭씨 4도에서 자당 구배를 준비했습니다.다음 날, 얼음에서 세포 용해물을 해동합니다. 50 OD260 단위를 포함하는 세포 용해물의 분취액을 새로운 1.5 millil tube로 옮기고, 최대 1 ml의 새로운 lysis buffer와 10 microlit의 RNase 1을 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 발뒤꿈치 로테이터에 머리를 대고 부드럽게 회전시키면서 배양합니다.다음으로, 폴리머 튜브의 10%에서 50% 자당 구배 위에 용해물 샘플을 부드럽게 층을 이룹니다. SW41 ti 로터를 사용하여 35, 000rpm에서 섭씨 4도에서 3시간 동안 울트라 원심분리기. 울트라 세트리분리(ultra cetrifugation) 중에 그래디언트 분획 시스템을 설정합니다.구성 요소를 켜고 UV 모니터가 최소 30분 동안 예열되도록 합니다. 주사기에 체이스 용액을 채우고 주사기와 캐뉼러 내부의 기포를 제거합니다. 초원심분리가 완료되면 자당 구배가 포함된 초원심분리 튜브를 설치하고 뚫습니다.분당 1밀리리터로 주사기 펌프를 시작하고 A254 값을 모니터링하면서 1밀리리터 분획을 수집합니다. ADS 모노솜 피크를 나타내는 분획이 수집되고 풀링됩니다. 12, 000 시간 g에서 0.5 밀리리터 원심 필터를 통해 분획을 4 섭씨 온도에서 10 분 동안 필터링하고 흐름을 버리고 부피가 100 마이크로 리터 미만이 될 때까지 반복합니다.피펫팅으로 혼합된 400마이크로리터의 방출 버퍼에서 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후 장치를 새 수집 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 12, 000회 g으로 원심분리합니다. 플로우 스루를 수집합니다. 그 후, 발자국 단편을 정제하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 침전을 사용하여 샘플을 침전시킵니다.이 절차를 시작하기 위해, 침전된 발자국과 단편화된 mRNA 샘플을 20, 000 번 g 및 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 에탄올을 제거하고 펠릿을 공기 건조시킨 후 각 펠릿을 7.75마이크로리터의 물에 현탁시킵니다. 각 펠릿에 1마이크로리터의 10XT4 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액, 1마이크로리터의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 0.25마이크로리터의 RNase 억제제를 추가합니다.섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 10마이크로리터의 2X TBE 요소 시료 완충액을 10마이크로리터의 각 풋프린트 및 mRNA 시료에 추가합니다. 샘플과 적절한 대조군을 섭씨 75도에서 3분 동안 배양한 후 스핀다운하고 1분 동안 얼음 위에 올려 놓습니다.각 샘플을 15% TBE 요소 겔의 두 웰에 로드하고 1시간 동안 180볼트에서 겔 전기영동으로 RNA 단편을 분리합니다. 5분 동안 빛으로부터 보호된 핵산 젤 얼룩으로 젤을 염색합니다. 청색광 투과광 아래에서 겔을 시각화하는 동안 발자국 샘플의 경우 28-32개의 뉴클레오티드, mRNA 샘플의 경우 약 50-70개의 뉴클레오티드 사이의 적절한 띠를 절제합니다.폴리아크릴아미드 겔에서 RNA를 추출하기 전에 절제된 폴리아크릴아미드 겔 조각을 섭씨 영하 80도에서 최소 10분 동안 동결합니다. 역전사 전에 3개의 프라임 어댑터 접합을 수행하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 침전시킵니다. 각 펠릿을 11.5마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁합니다.그런 다음 0.5마이크로리터의 8마이크로몰 역전사 프라이머와 1마이크로리터의 dNTP 믹스를 추가합니다. 섭씨 65도에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에 놓습니다. 각 샘플에 4마이크로리터의 5x 1차 가닥 완충액, 2마이크로리터의 0.1몰 DTT, 0.5마이크로리터의 RNase 억제제 및 0.5마이크로리터의 역전사효소를 추가합니다.섭씨 48도에서 30분, 섭씨 65도에서 1분, 섭씨 80도에서 5분 동안 배양합니다. 각 샘플에 0.8마이크로리터의 2몰 수산화나트륨을 첨가하고 섭씨 98도에서 30분 동안 배양하여 RNA의 가수분해를 즉시 진행합니다. 0.8 마이크로 리터의 2 몰 염화수소를 첨가하여 반응을 중화시킵니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 침전시킨 후, 각 펠릿을 5마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시키고 5마이크로리터의 2x TBE 요소 샘플 버퍼를 추가합니다. 섭씨 75도에서 3분 동안 배양한 후 스핀다운하고 1분 동안 얼음을 찜질합니다. 10% TBE 요소 겔의 한 웰에 샘플을 로드합니다.50 분 동안 젤 전기 이동법 180 볼트에 의하여 역전사 반응의 생성물을 분리하십시오. 빛으로부터 보호된 핵산 젤 얼룩으로 젤을 5분 동안 염색합니다. 청색광 투과광기를 사용하여 약 128개의 뉴클레오티드 이상을 절단합니다.폴리아크릴아미드 겔에서 DNA를 추출하기 전에 폴리아크릴아미드 겔 조각을 섭씨 영하 80도에서 최소 10분 동안 동결합니다. DNA를 순환화하려면 각 DNA 펠릿을 16.75마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁합니다. 2마이크로리터의 10x 단일 가닥 DNA 리가제 완충액, 1마이크로리터의 50밀리몰 망간 클로라이드 및 0.25마이크로리터의 단일 가닥 DNA 리가아제를 추가합니다.섭씨 60도에서 1시간 동안 배양한 다음 섭씨 80도에서 10분 동안 배양합니다. 침전시키지 않고 단일 가닥 DNA 결찰 반응 생성물을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 PCR 라이브러리 증폭을 수행한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이브러리 정량화 및 고처리량 염기서열분석을 수행합니다.PCR 증폭 발자국 라이브러리와 mRNA 샘플에 대해 얻은 염기서열분석 라이브러리의 대표적인 바이오 분석기 프로필이 표시됩니다. 발자국 라이브러리의 예상 평균 크기는 148 - 152 뉴클레오티드이며, mRNA 라이브러리의 예상 크기는 170 - 190 뉴클레오티드입니다. 이 그래프는 야생형 샘플과 hbs1 결실 돌연변이의 두 개의 독립적인 생물학적 복제에 대해 얻은 mRNA, 발자국 및 rRNA 판독의 결합된 수를 보여줍니다.footprint 라이브러리에서 모든 sequenced read의 50%에서 60%가 ribosome-protected footprint fragments에 해당했습니다. 대조적으로, mRNA 라이브러리에서 rRNA 단편의 3%만이 관찰되었으며, 이는 폴리(A)mRNA 분리가 rRNA 판독을 효과적으로 제거할 수 있음을 보여줍니다. 발자국 및 mRNA 샘플 라이브러리 모두 일치하는 샘플 간에 약 0.99의 Pearson 상관 계수로 표시된 바와 같이 우수한 재현성을 보여줍니다.mRNA 존재비 측정과 결합하면 리보솜 프로파일링을 통해 실험 조건 간의 번역 효율 변화를 측정할 수 있습니다. hbs1 결실 돌연변이에서 유의하게 상향 조절된 유전자와 하향 조절된 유전자는 mRNA 전사의 변화, 번역 효율 또는 공통 효과의 영향을 받는지 여부에 따라 그룹화됩니다. 마스터하면 전체 프로토콜을 약 11일 내에 수행할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 RNase 오염을 방지하고 샘플의 RNA 분해 위험을 낮추기 위해 장갑을 착용하고 RNase free 시약 및 소모품을 사용하여 모든 단계를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 뉴클레아제 분해를 사용하여 리보솜 발자국을 생성하고, 자당 구배 분획을 통해 온전한 리보솜 발자국 복합체를 분리하고, 심층 염기서열분석을 위해 DNA 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 액체 질소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 매우 차가운 물질을 취급할 때는 항상 보안경과 냉동 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

스트레스에 적응하는 세포의 능력은 세포의 생존에 매우 중요합니다. mRNA 번역의 조절은 그러한 적응 전략 중 하나로, 단백질체의 빠른 조절을 제공합니다. 여기에서는 스트레스 조건에서 선택적으로 번역되는 특정 mRNA를 식별하기 위해 표준화된 폴리솜 프로파일링 프로토콜을 제공합니다.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

여기에서 우리는 박테리아에 있는 RIBO-seq를 위한 견본 수집 및 준비의 단계를 기술합니다. 이러한 지침에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 간단하고 표준 실험실 장비를 사용하며 리시스에서 라이브러리 획득까지 7 일이 걸립니다.

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

리보솜을 번역하면 코돈 당 세 개의 뉴클레오티드를 펩티드로 해독합니다. 리보솜 프로파일링에 의해 포착된 mRNA를 따른 그들의 움직임은 특징적인 삼중항 주기성을 나타내는 발자국을 생성한다. 이 프로토콜은 RiboCode를 사용하여 리보솜 프로파일링 데이터에서 이 두드러진 기능을 해독하여 전체 전사체 수준에서 활발하게 번역된 열린 판독 프레임을 식별하는 방법을 설명합니다.

데 노보 리보솜 프로파일링 데이터를 사용하여 능동적으로 번역된 오픈 리딩 프레임 식별

학습하세요 리보솜 프로파일링을 이용한 Saccharomyces cerevisiae의 게놈 전체 번역 정량화 방법입니다. 이 기술은 번역 조절 메커니즘 연구와 단백질 합성 이해에 높은 민감도를 제공합니다.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

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