리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 mRNA의 어느 영역이 단백질로 번역되는지 확인하고, 게놈 전체 수준에서 신진 효모 saccharomyces cerevisiae의 단백질 번역을 정량적으로 측정하는 것입니다. 리보솜 프로파일링은 단백질과 질병의 속도를 모니터링하고 번역 조절의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법에 비해 훨씬 더 높은 감도를 추가한다는 것이며, 그 중 단일 접촉 해상도에서 생체 내에서 단백질과 질병을 측정할 수 있다는 것입니다.

이 프로토콜은 발아 효모에 특정되어 있지만, 포유류 세포 및 조직과 같은 다른 모델 시스템에서 리보솜 프로파일링을 확립하려는 연구자에게도 유용합니다. 추출물은 중간 로그 단계까지 성장한 효모 세포에서 준비됩니다. 유리 홀더 필터 어셈블리를 사용하여 0.45 마이크로멤브레인 필터를 통해 배양물을 여과합니다.

주걱으로 펠릿을 긁어내고 액체 질소에서 급속 동결한 다음 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 3.2mm 크롬 스틸 비드 3개를 1.8mm 스테인리스 스틸 튜브에 넣고 튜브를 액체 질소로 미리 냉각합니다. 얼린 펠릿을 넣고 강철 튜브를 실리콘 고무 캡으로 덮습니다.

4200rpm에서 10초 동안 극저온 분쇄를 통해 시료를 균질화합니다. 전체 분쇄 절차 동안 샘플을 냉동 상태로 유지하려면 각 분쇄 사이에 최소 10초 동안 액체 질소로 튜브를 냉각하는 것이 중요합니다. 균질화가 완료되면 시클로헥시미드가 포함된 용해 완충액 1ml를 샘플에 추가합니다.

피펫팅으로 잘 혼합하고 샘플을 새 1.5 ml 튜브로 옮깁니다. 20, 000 번 g에서 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기. 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

폴리(A)mRNA 분리를 위해 100마이크로리터의 용해물을 다른 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 액체 질소에서 발자국 추출에 사용될 나머지 용해물에 mRNA 샘플이 있는 튜브를 급속 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 발자국 추출 전날 밤, 해동은 이전에 섭씨 4도에서 자당 구배를 준비했습니다.

다음 날, 얼음에서 세포 용해물을 해동합니다. 50 OD260 단위를 포함하는 세포 용해물의 분취액을 새로운 1.5 millil tube로 옮기고, 최대 1 ml의 새로운 lysis buffer와 10 microlit의 RNase 1을 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 발뒤꿈치 로테이터에 머리를 대고 부드럽게 회전시키면서 배양합니다.

다음으로, 폴리머 튜브의 10%에서 50% 자당 구배 위에 용해물 샘플을 부드럽게 층을 이룹니다. SW41 ti 로터를 사용하여 35, 000rpm에서 섭씨 4도에서 3시간 동안 울트라 원심분리기. 울트라 세트리분리(ultra cetrifugation) 중에 그래디언트 분획 시스템을 설정합니다.

구성 요소를 켜고 UV 모니터가 최소 30분 동안 예열되도록 합니다. 주사기에 체이스 용액을 채우고 주사기와 캐뉼러 내부의 기포를 제거합니다. 초원심분리가 완료되면 자당 구배가 포함된 초원심분리 튜브를 설치하고 뚫습니다.

분당 1밀리리터로 주사기 펌프를 시작하고 A254 값을 모니터링하면서 1밀리리터 분획을 수집합니다. ADS 모노솜 피크를 나타내는 분획이 수집되고 풀링됩니다. 12, 000 시간 g에서 0.5 밀리리터 원심 필터를 통해 분획을 4 섭씨 온도에서 10 분 동안 필터링하고 흐름을 버리고 부피가 100 마이크로 리터 미만이 될 때까지 반복합니다.

피펫팅으로 혼합된 400마이크로리터의 방출 버퍼에서 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후 장치를 새 수집 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 12, 000회 g으로 원심분리합니다. 플로우 스루를 수집합니다. 그 후, 발자국 단편을 정제하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 침전을 사용하여 샘플을 침전시킵니다.

이 절차를 시작하기 위해, 침전된 발자국과 단편화된 mRNA 샘플을 20, 000 번 g 및 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 에탄올을 제거하고 펠릿을 공기 건조시킨 후 각 펠릿을 7.75마이크로리터의 물에 현탁시킵니다. 각 펠릿에 1마이크로리터의 10XT4 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액, 1마이크로리터의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 0.25마이크로리터의 RNase 억제제를 추가합니다.

섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 10마이크로리터의 2X TBE 요소 시료 완충액을 10마이크로리터의 각 풋프린트 및 mRNA 시료에 추가합니다. 샘플과 적절한 대조군을 섭씨 75도에서 3분 동안 배양한 후 스핀다운하고 1분 동안 얼음 위에 올려 놓습니다.

각 샘플을 15% TBE 요소 겔의 두 웰에 로드하고 1시간 동안 180볼트에서 겔 전기영동으로 RNA 단편을 분리합니다. 5분 동안 빛으로부터 보호된 핵산 젤 얼룩으로 젤을 염색합니다. 청색광 투과광 아래에서 겔을 시각화하는 동안 발자국 샘플의 경우 28-32개의 뉴클레오티드, mRNA 샘플의 경우 약 50-70개의 뉴클레오티드 사이의 적절한 띠를 절제합니다.

폴리아크릴아미드 겔에서 RNA를 추출하기 전에 절제된 폴리아크릴아미드 겔 조각을 섭씨 영하 80도에서 최소 10분 동안 동결합니다. 역전사 전에 3개의 프라임 어댑터 접합을 수행하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 침전시킵니다. 각 펠릿을 11.5마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁합니다.

그런 다음 0.5마이크로리터의 8마이크로몰 역전사 프라이머와 1마이크로리터의 dNTP 믹스를 추가합니다. 섭씨 65도에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에 놓습니다. 각 샘플에 4마이크로리터의 5x 1차 가닥 완충액, 2마이크로리터의 0.1몰 DTT, 0.5마이크로리터의 RNase 억제제 및 0.5마이크로리터의 역전사효소를 추가합니다.

섭씨 48도에서 30분, 섭씨 65도에서 1분, 섭씨 80도에서 5분 동안 배양합니다. 각 샘플에 0.8마이크로리터의 2몰 수산화나트륨을 첨가하고 섭씨 98도에서 30분 동안 배양하여 RNA의 가수분해를 즉시 진행합니다. 0.8 마이크로 리터의 2 몰 염화수소를 첨가하여 반응을 중화시킵니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 침전시킨 후, 각 펠릿을 5마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시키고 5마이크로리터의 2x TBE 요소 샘플 버퍼를 추가합니다. 섭씨 75도에서 3분 동안 배양한 후 스핀다운하고 1분 동안 얼음을 찜질합니다. 10% TBE 요소 겔의 한 웰에 샘플을 로드합니다.

50 분 동안 젤 전기 이동법 180 볼트에 의하여 역전사 반응의 생성물을 분리하십시오. 빛으로부터 보호된 핵산 젤 얼룩으로 젤을 5분 동안 염색합니다. 청색광 투과광기를 사용하여 약 128개의 뉴클레오티드 이상을 절단합니다.

폴리아크릴아미드 겔에서 DNA를 추출하기 전에 폴리아크릴아미드 겔 조각을 섭씨 영하 80도에서 최소 10분 동안 동결합니다. DNA를 순환화하려면 각 DNA 펠릿을 16.75마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁합니다. 2마이크로리터의 10x 단일 가닥 DNA 리가제 완충액, 1마이크로리터의 50밀리몰 망간 클로라이드 및 0.25마이크로리터의 단일 가닥 DNA 리가아제를 추가합니다.

섭씨 60도에서 1시간 동안 배양한 다음 섭씨 80도에서 10분 동안 배양합니다. 침전시키지 않고 단일 가닥 DNA 결찰 반응 생성물을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 PCR 라이브러리 증폭을 수행한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이브러리 정량화 및 고처리량 염기서열분석을 수행합니다.

PCR 증폭 발자국 라이브러리와 mRNA 샘플에 대해 얻은 염기서열분석 라이브러리의 대표적인 바이오 분석기 프로필이 표시됩니다. 발자국 라이브러리의 예상 평균 크기는 148 - 152 뉴클레오티드이며, mRNA 라이브러리의 예상 크기는 170 - 190 뉴클레오티드입니다. 이 그래프는 야생형 샘플과 hbs1 결실 돌연변이의 두 개의 독립적인 생물학적 복제에 대해 얻은 mRNA, 발자국 및 rRNA 판독의 결합된 수를 보여줍니다.

footprint 라이브러리에서 모든 sequenced read의 50%에서 60%가 ribosome-protected footprint fragments에 해당했습니다. 대조적으로, mRNA 라이브러리에서 rRNA 단편의 3%만이 관찰되었으며, 이는 폴리(A)mRNA 분리가 rRNA 판독을 효과적으로 제거할 수 있음을 보여줍니다. 발자국 및 mRNA 샘플 라이브러리 모두 일치하는 샘플 간에 약 0.99의 Pearson 상관 계수로 표시된 바와 같이 우수한 재현성을 보여줍니다.

mRNA 존재비 측정과 결합하면 리보솜 프로파일링을 통해 실험 조건 간의 번역 효율 변화를 측정할 수 있습니다. hbs1 결실 돌연변이에서 유의하게 상향 조절된 유전자와 하향 조절된 유전자는 mRNA 전사의 변화, 번역 효율 또는 공통 효과의 영향을 받는지 여부에 따라 그룹화됩니다. 마스터하면 전체 프로토콜을 약 11일 내에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 RNase 오염을 방지하고 샘플의 RNA 분해 위험을 낮추기 위해 장갑을 착용하고 RNase free 시약 및 소모품을 사용하여 모든 단계를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 뉴클레아제 분해를 사용하여 리보솜 발자국을 생성하고, 자당 구배 분획을 통해 온전한 리보솜 발자국 복합체를 분리하고, 심층 염기서열분석을 위해 DNA 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 액체 질소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 매우 차가운 물질을 취급할 때는 항상 보안경과 냉동 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.