Name: 상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 면역조절 펩타이드가 기관지 상피세포 이동에 미치는 영향을 평가하는 새로운 체외 상처 치유 분석법을. 실리콘 배양 인서트와 자동화 이미지 분석을 활용하여 재현성 높은 정량 데이터를 신속하게 얻을 수 있습니다.

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이 작품에서 역사적인 대학 로마와 이탈리아 낭 성 섬유 증 연구 재단 (프로젝트 보기 #11/2014 FFC 대표단 시에 나, 손 드리 오 Valchiavenna, Cerea Il 소리 디 제니와 파 비아에서 채택) 자금에 의해 지원 되었다. 이 작품의 일부 FILAS 그랜트 보호 FILAS RU 2014 1020에 의해 지원 되었다.
우리는 제공 하는 기관지 상피 세포에 대 한 박사로 레 타 포 레 라 (U.O.C. Genetica 메 디카, Istituto Giannina Gaslini, 제노바, 이탈리아)에 감사.

1. 세포 준비
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 항생제 (0.1 mg/mL 페니실린과 스의), 그리고 puromycin 플러스 2.5x106 셀 10 mL의 최소 필수 매체 (MEM) 2mm 글루타민 (MEMg), 보충에 씨앗 (0.5 µ g/l로 선택 및 유지 보수는 셀 라인) T75 플라스 크에. 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어. 시작 하기 전에 실험, 거꾸로 현미경 세포의 합류를 확인 하십시오. 참고: 실험을 위해 사용 하는 셀 불멸 하 게 인간의 기관지 상피 세포 lentiviral 벡터 puromycin 저항을 부여로 불리고 있습니다. 그들은 안정적으로 기능적인 CFTR14,15를 표현 한다.</li>
	<li>세포의 합류에는 90-100%에 도달 했습니다, 일단 플라스 크에서 매체를 발음 하 고 생물 안전 캐비닛 클래스 II에서 폐 병으로 그것을 폐기. 6 mL의 인산 염 버퍼와 셀 씻어 염 분 칼슘 및 마그네슘 (CMF-PBS) 없이. 부드럽게 플라스 크를 수동으로 바위와 CMF PBS를 삭제. 참고:을 피펫으로와 셀 단층을 건드리지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>CMF PBS의 10 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>CMF PBS를 발음 하 고 그것을 폐기. 플라스 크에 트립 신/EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 바위 플라스 크, 셀, 코트 고 셀은 가시 현미경으로 분리 될 때까지 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어 완전히 솔루션을 허용. 참고: 보육 시간의 끝에, 셀 둥근 및 플라스틱 표면에 얽매이지 않는 표시 됩니다. 셀 잘 분리 된 경우, 수동 동요 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>MEMg 플러스 10%의 10 mL을 추가 FBS 트립 신을 비활성화 하 고 플라스 크의 하단을 세척 하 여 세포를 수집. 원뿔 50 mL 튜브에 볼륨을 전송.</li>
	<li>80 x g에 5 분 동안 튜브 원심</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 다시 6 ml MEMg 플러스 10%의 세포를 중단 FBS. 반복적으로 어떤 덩어리 헤어 플라스틱.</li>
	<li>10 µ L는 micropipette와 셀 서 스 펜 션의 밖으로가 고 이전 Burker 또는 Neubauer 챔버에 넣어 커버 유리 아래 볼륨을 주입.</li>
	<li>휴대폰 번호를 계산 합니다.</li>
</ol>2. 세포는 문화에서 시드 삽입
<ol><li>에 12-잘 접시의 각 잘 멸 균 핀셋 (그림 1)으로 문화 삽입 전송. 핀셋을 사용 하 여 격판덮개의 표면에 그들을 해결 하기 위해 삽입 가장자리를 따라 누릅니다. 참고: 삽입 스티커 밑면 접착 수 있다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> 그림 1 : 12-잘 접시의 우물에 넣어 제대로 실리콘 문화 삽입의 도식 대표. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>제대로 MEMg 플러스 10%에 세포 현 탁 액을 희석 FBS. (약 실/3.5x104 셀) 셀 서 스 펜 션의 70 µ L로 삽입의 각 구획을 채우십시오. 참고: 각 구획에 적용 하는 셀의 밀도 세포의 종류에 따라 다릅니다. 합류 24 시간 이내 완료 리드 셀 밀도 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>현미경, 셀 삽입 구획에서 유출 되지 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 12-잘 접시를 품 어 확인 합니다.</li>
</ol>3. 가짜 상처 치유 분석 결과
<ol><li>부 화, 후 confluent 셀 monolayers 형성 되었습니다 확인 하는 거꾸로 한 현미경 아래 셀을 시각화.</li>
	<li>다시 MEMg의 1 mL에 테스트 화합물 (예를 들어, 앰프)를 일시 중단 합니다. 참고:-20 ° c.에 저장 된 재고 솔루션에서 시작 하는 신선한 앰프 희석 준비</li>
	<li>부드럽게 멸 균 핀셋으로 삽입을 제거 합니다. 수 셀 monolayers 휴식 하지 않도록 주의 하십시오. 흡수 성 종이에 삽입 전송. 참고: 다시 사용 하려면 동일한 삽입, 소독 그들 적어도 3 h 70% 에탄올에. 이후에 멀리 그들을 던져 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>비 부착 한 세포를 제거 하는 micropipette를 사용 하 여 잘 당 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 접시를 닫고 부드럽게 바위. 참고: 팬 들은 그들의 혼란을 피하기 위해 셀 monolayers 위에 직접 매체의 정보를 추가 하지 마십시오.</li>
	<li>매체를 발음 하 고 잘 당 MEMg의 1 mL와 함께 그것을 대체. 접시를 닫고 비디오 카메라를 갖춘 4 배 확대에 거꾸로 현미경 (삽입 하 여 만든) 셀 무료 간격을 시각화 합니다. 이미지에서 시간 0 (T0)을.jpg 형식으로 그들을 저장 합니다.</li>
	<li>우물에서 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS와 함께 그들을 씻어 버리십시오.</li>
	<li>우물에 테스트 화합물 (포인트 3.2에서 준비)를 추가 합니다. 치료 컨트롤 샘플에 대 한 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2접시를 품 어.</li>
	<li>15, 20, 24 h 치료 후 셀 마이그레이션에 4 배 확대 현미경을 관찰 하 고 이미지. 참고:이 단계 동안 T0에 관해서는 동일한 지역에서 이미지를 캡처 하려고 합니다. 셀 이동 속도에 따라 이미지 캡처됩니다 시간 간격 선택 합니다.</li>
	<li>공부 하 고 몇 가지 선택적 저 해제의 효과, 즉 AG1478, 셀 마이그레이션에 삽입을 제거 하기 전에 각 삽입 구획에서 중간 발음.<ol>
<li>신선한 MEMg과 각 구획을 세척 하 고 MEMg AG1478와 보충의 70 µ L로 그것을 채우십시오.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2에서 외피의 30 분 후 포인트 3.3에서에서 설명 된 대로 진행 합니다. 참고: 세척 단계 및 특정 억제제와 셀 monolayers의 전처리 하는 동안 수 삽입을 제거 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>완료 되 면 실험, 다양 한 실험적인 그룹의 가장 대표적인 샘플의 이미지를 선택 하 고 T0, T15, T20, 및 T24 h에 단일 이미지를 포함 하는 zip 파일을 만듭니다. 참고: 단일 이미지 모든 샘플에 대 한 선택한 시간 간격에서가지고 간다. 세 번 이상 반복 되는 각 실험에 대 한 triplicates를 실행 합니다. 끝에서 모든 실험 그룹, 최소 3 이미지 ("a", "b", "c", 등등, 각각 독립적인 실험에서 파생)에 대 한 각 시간 지점에서 분석 된다.</li>
	<li>자동으로 선택한 시간 지점에서 (백분율로) 셀 적용 및 스크래치 영역의 실험 데이터를 포함 하는 스프레드시트 요약 파일 이메일로 제공 하는 이미지 분석 소프트웨어에 zip 파일을 업로드 합니다. 참고: 앞 가장자리와 격차 인식 크게 기반 edge 검출 방식 (포인트는 이미지 밝기 급격히 변경 식별 목적).</li>
	<li>데이터를 저장 하 고 그들을 수집 합니다. 시간 0에 평균 값에 따라 모든 데이터를 정상화. 상대 표준 오차 (SEM) 각 시간 지점에서 모든 복제의 정규화 된 데이터의 평균 값을 계산 합니다. 양방향 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어와 통계 분석을 수행 합니다. 펩 티 드 처리 그룹 및 다른 시간 간격 제어 그룹 사이 다름 간주 됩니다 통계적으로 p에 대 한 signiﬁcant &lt; 0.05.</li>
	<li>선택한 시간 간격 모든 샘플 그룹 대 의 셀 적용 영역의 비율을 표시 한 히스토그램으로 얻은 데이터 그래프에 플롯 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 공개할 게 없다

셀 마이그레이션 상처 치유, 배아 개발 및 암 전이 포함 하 여 많은 생리 적 및 병 적인 행사에 필수 과정입니다. 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 기본적인 절차는 포함 한다: (i) 세포 단층, (ii) 셀, confluent 계층에는 의사의 생산의 창조 (iii) 캡처 이미지 상처까지 여러 시간 간격의 폐쇄에 도달 그리고 (iv) 선택한 셀의 마이그레이션 속도 측정 하기 위해 이미지 시퀀스의 분석.
우리의 결과 문화 삽입의 응용 프로그램은 객관적이 고 셀 마이그레이션 특성의 정량적 평가 대 한 신뢰할 수 있는 실험 방법으로 나타났습니다. 이 분석 결과 기본적인 실험실 장비 연구 그룹에 의해 수행할 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜의 재현성을 달성 하기 위해 고려 되어야 한다. 예를 들어 파일럿 실험, 모든 개별 샘플에 합류의 동일한 정도 얻기 위하여 각 구획에 씨앗을 세포의 정확한 수에 의해 정의 하는 것이 중요입니다. 이 목표를 동기화...

동물에서 상처 치유 하는 것이 부상1무결성 및 조직 층의 정상 기능을 다시 설정 하는 기본 프로세스는 크게 알려져 있습니다. 물리적, 화학적 모욕에서 보호 장벽을 형성 상피 표면 외부 환경 (예를 들어, 호흡기, 피부 및 위장 책자)에 노출에 불구 하 고, 상처의 형성 수 있습니다 쉽게 발생 하는, 특히 후 수술 또는 미생물 감염2. 예를 들어, 기회 주의 세균성 병원 체 녹 농 균, 특히 낭 성 섬유 증 (CF) 환자에에서 의해 폐 조직의 식민 이끌어 낸다 필연적인 호흡3, 기도 상피 세포의 손상 4. 상처 치유 부상된 조직5의 정상적인 구조를 복원 하는 복잡 한 호스트 복구 메커니즘입니다. 그것은 초기 염증, 포괄 epithelialization, 신생, 콜라겐 생산 및 세포 분화6,7,8 개장 하는 조직 재생 기간 다음에 의해 특징 . 상피의 무결성을 보장 하 고 미생물 증식 제어 모든 살아있는 유기 체 방어 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어)9,10를 포함 하 여 생산. 상처 치유 과정은 체 외에서 세포 파편 및 다른 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 부족으로 인해 시뮬레이션 하기 매우 어렵습니다. 그러나, 생체 외에서 의 능력 펩 티 드를 자극 하 여 의사는 상처의 폐쇄를 가속 상피 세포의 손상 된 상피 세포를 치유 하는 능력의 지표입니다. 실제로, 셀 마이그레이션 상처 치유, 속도 제한 이벤트 이며 향상 된 상처 치유에 대 한 대상 치료에 도움이 될 것입니다 공부 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 수 있는 요인.
여기, 높은 재현성 실험 분석 결과 셀 마이그레이션 시험관을 평가 하기 위해 특수 실리콘 문화 삽입에 따라 제공 됩니다. 그것은 500 μ m 간격 (의사 상처)에 confluent 셀 단층의 생성을 기반으로 합니다. 인공 "상처" 필드의 가장자리에 셀 셀 없는 지역으로 이주, 새로운 셀 연락처 형성 시작 됩니다. 문화 삽입 빠른 상처 치유 실험을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 500 μ m 벽으로 구분 된 두 개의 저수지 제공 됩니다, 그리고 그들이 배치 될 수 있습니다 제대로 3 cm 접시 접시 또는 12-잘 접시의 우물에서. 세포 현 탁 액으로 삽입의 각 구획을 작성 하면서 삽입의 제거 (분리 벽으로 동일한 폭) 약 500 μ m의 깨끗 한 셀 프리 갭 생기게 됩니다 합류까지 각 지정 된 지역에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 보충 시험 화합물과 적절 한 세포 배양 접시에 다음 추가할 수 접시/잘. 나중에, 간격 폐쇄는 거꾸로 한 현미경, 이미지 수집에 대 한 비디오 카메라를 갖춘 선호 하나에서 다른 시간 간격 구상 될 수 있다. 마지막으로, 웹 기반 자동화 이미지 분석 프로그램에 의해 셀 적용 지역에 있는 변화의 측정 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도의 정량화를 허용할 것 이다. 전반적으로,이 방법은 고아 한 분석 결과, 스크래치를 무 균 바늘 confluent 셀 monolayers incising에 의해 수동으로 이루어집니다 또는 한 피 펫 팁11에 관하여 앞으로 단계입니다. 실제로, 마지막 절차 접시의 플라스틱 바닥을 파괴할 수 있는 플레이트/잘 하 고 주름을 만드는 표면 코팅. 또한, "상처" 지역은 없습니다, 간격의 전체 길이 따라 잘 정의 된 폭이 매우 바늘/팁에 연구원에 의해 적용 된 압력에 따라 달라 집니다. 또한, 빠질된 셀 스크래치;의 가장자리에서 생존 및 죽은 세포의 덩어리를 형성할 수 있다 또한, "상처" 영역으로 살아있는 세포의 확산 방해할 수 있습니다 세포 이동, 재현할 수 없는 결과12생성의 속도.
또한, 스크래치 이미지 분석 플랫폼 덕분에 사용자 빠르게 받을 수 (분) 이내 추가 소프트웨어를 습득의 필요성 없이 선택한 셀의 철새 행동에 양적 데이터. 이 플랫폼은 낮은 (~ 5 배)의 위상 대비 현미경 이미지, 중간 (~ 10 배), 및 높은 (~ 20 X) 확대 분석 가능 하다. Zip 파일 (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff 형식)에서 이미지의 업로드 후 분석 자동으로 실시 셀 적용 지역 및 스크래치 영역 비율 뿐만 아니라 셀의 속도 보여 주는 요약 파일을 생성 하려면 마이그레이션, 고유 시간 간격입니다.
개구리 피부 앰프-파생, 즉 Esc(1-21) 및 그것의 diastereomer Esc(1-21)-1 c13및 표현 기능 CF 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)14,15, 기관지 세포 라인을 사용 하 여이 작품에 치료 (제어) 샘플에 비해 펩타이드-유도 된 세포 이동의 예로 제공 됩니다. 기도 상피 세포 및 CFTR 폐 기능을 유지 하는 중요 한 역할을 재생 및 수리16상처. 또한, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 상기 펩 티 드에 의해 유도 된 기관지 세포의 마이그레이션 EGFR12의 활성화를 포함 하는 증거의 선택적 억제제 (예, AG1478)17 에 의하여 18 보고 됩니다.
요약 하자면,이 절차의 목표는 어떻게 이러한 실리콘 문화 삽입 사용 정확 하 게 부착 세포 (예를 들어, 기관지 상피 세포)와 분자의 결정을 신속 하 고 쉽게 접근할 수 있는 분석 결과 나타냅니다 표시 이러한 이벤트를 제어 하는 메커니즘.

<table><tbody><tr><td>최소 필수 매체(MEM)&nbsp;</td><td>유로클론</td><td>ECB2071L</td><td>37 &deg에서 따뜻하게; 사용 전 C 수욕</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>유로클론</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 태아 소 세럼 (FBS)</td><td>유로클론</td><td>ECS0180DH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>유로클론</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 1X PBS</td><td>유로클론</td><td>ECB3052D</td><td>사용 전 실온에서 따뜻하게</td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS (CMF-PBS)칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 칼슘과 마그네슘 (PBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi 문화-삽입 2 웰</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis 이미지 분석</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>PRISM 소프트웨어&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>버전 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

이 작품의 목표는 일부 immunomodulatory 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어) 셀 마이그레이션 자극 등의 능력을 평가 하는 새로운 방법을 보여줍니다. 중요 한 것은, 셀 마이그레이션은 속도 제한 이벤트를 조직 계층의 일반 기능과 무결성 손상 후 상처 치유 과정. 셀 단층에서 수동으로 만든된 스크래치에 기반은, 고전적인 분석 결과,이 방법의 장점은 특별 한 실리콘 문화의 사용 삽입 필드를 만드는 한 셀-무료 의사 상처 잘 정의 된 폭 (500 μ m 2 개의 구획을 제공 하는 ). 또한, 자동된 이미지 분석 플랫폼으로 그것은 빠르게 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도에 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 더 정확 하 게, 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 두 개구리 피부 앰프의 효과가 표시 됩니다. 또한, 특정 억제제와 이러한 셀의 전처리 등 기본 분자 메커니즘에 정보를 제공 합니다.

이 프로토콜은 상처 치유 기능 CFTR 표현 하는 기관지 상피 세포에서 유도 된 세포 마이그레이션 활동 측면에서 Esc(1-21)와 Esc(1-21)-1 c의 효과 결정 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 결과에서 문화 삽입 12-잘 접시의 우물에 배치 하 고 각 구획은 MEMg 10% 보충에 35000 셀 시드 FBS. 셀 24 h. 이내 완벽 한 합류를 나중에 도달, 500 μ m 간격 생성 된 고 각 잘 다른 농도에서 펩 티 드를 포함 하는 MEMg와 함께 가득 차 있었다. 실험 4 번 반복 되었다. 그림 2에 표시 된 대로 셀 단층에서 생산 하는 가짜 상처 필드의 거의 완전 한 폐쇄 각각 ~ 20 h, Esc(1-21), Esc(1-21)-1 c를 1 μ M, 10 μ M의 최적 농도에서 내 두 개의 펩 티 드에 의해 유도 했다. 이 Esc(1-21)-1 c 기관지 세포에는 의사의 다시 epithelializat...

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

이 절차의 목표는 상처 치유 과정에서 속도를 제한하는 이벤트인 세포 이동을 자극하는 일부 면역 조절 분자(예: 항균펩타이드)의 능력을 평가하는 방법을 보여주는 것입니다. 일반적으로 in vitro에서 세포 이동을 연구하기 위한 기본 절차에는 세포 단층 생성, pseudo-wound 생성, wound 봉합에 도달할 때까지 다른 시간 간격으로 이미지 캡처, 세포 이동을 정량화하기 위한 이미지 시퀀스 분석이 포함됩니다. 이제 수동으로 만든 스크래치를 기반으로 하는 기존 분석에 비해 이 방법의 장점은 특수 실리콘 배양 삽입물을 사용하여 세포가 전혀 없고 매우 잘 정의된 너비인 500마이크로미터의 의사 상처 필드를 생성하기 때문입니다.또한 웹 기반의 자동화된 이미지 분석 프로그램 덕분에 상처 봉합 및 세포 이동 속도에 대한 정량적 데이터를 몇 분 내에 신속하게 수신할 수 있습니다. 따라서 전반적으로 이것은 데이터의 재현성이 매우 높은 모든 종류의 부착 세포에 적용할 수 있는 신뢰할 수 있는 실험 기술입니다. 여기에서는 개구리 피부 항균펩타이드가 기관지 상피 세포의 이동에 미치는 영향과 이러한 세포를 특정 억제제로 전처리하는 방법이 이러한 이벤트의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 정보를 제공할 수 있는 방법을 예로 제공합니다.보다 정확하게는, 펩타이드 유도 세포 이동이 표피 성장 인자 수용체의 활성화를 어떻게 포함하는지 보여줄 것입니다. 실험을 시작하려면 세포 배양 인큐베이터에서 세포가 들어 있는 플라스크를 제거하고 자동 이미지 획득 시스템이 장착된 도립 현미경에서 둘레를 확인합니다. 90%의 완전한 합류점에 도달하면 생물 안전 후드로 이동하고 멸균 상태에서 10ml 플라스틱 피펫을 사용하여 배양 배지를 조심스럽게 흡인하고 배지를 폐기물 병에 부드럽게 버립니다.칼슘과 마그네슘이 없는 6ml PBS, 즉 CMF로 세포를 씻습니다. 플라스크를 수동으로 부드럽게 흔들고 CMF를 버립니다. 그런 다음 다른 10ml CMF를 추가하여 세포 파편과 부착되지 않은 세포를 추가로 제거합니다.이 시점에서 플라스크를 닫고 10분 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 플라스크를 꺼내 CMF를 버리고 2ml의 트립신-EDTA를 부드럽게 첨가하여 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다. 플라스크를 수동으로 부드럽게 흔들어 용액이 세포를 완전히 덮을 수 있도록 하고 플라스크를 추가로 10분 동안 배양합니다.그 후, 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 트립신 첨가 과정이 완료되었는지 확인합니다. 이 경우 세포는 현탁 상태가 되고 현미경 아래에서 둥글게 보입니다. 트립신을 비활성화하려면 10% 열 비활성화 소 혈청이 보충된 10ml 배양 배지를 추가하고 플라스크를 조심스럽게 세척합니다.세포 현탁액을 수집하고, 이 부피를 원뿔형 50ml 튜브로 옮기고, 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 펠릿 형성을 확인하고 상층액을 흡인하고 혈청이 보충된 6ml 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 덩어리 형성을 분해합니다.이 프로세스는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 그 후, 마이크로피펫 팁으로 10마이크로리터를 꺼내 Burker 또는 Neubauer 챔버의 커버 유리 아래에 볼륨을 주입하고 세포 수를 계산합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에 멸균 핀셋을 사용하여 배양 인서트를 넣습니다.각 인서트는 500마이크로미터 벽으로 분리된 두 개의 구획으로 제공되며 접착을 허용하는 끈적한 밑면이 있습니다. 그러나 핀셋을 사용하여 인서트 가장자리를 따라 약간의 압력을 가하여 강판 표면에 고정합니다. 삽입체의 각 구획을 챔버당 약 3.5 x 10 - 4번째 세포를 포함하는 70마이크로리터의 세포 현탁액으로 채웁니다.중요한 것은 각 구획에 적용되는 세포의 농도가 세포의 유형에 따라 달라진다는 것입니다. 24시간 이내에 완전한 합류로 이어지는 세포 밀도를 사용하는 것이 좋습니다. 4배 배율로 현미경으로 삽입 구획에서 세포가 누출되지 않는지 확인한 다음 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.배양 후 세포 단층을 파괴하지 않고 멸균 핀셋으로 삽입물을 부드럽게 제거하고 삽입물을 흡수성 종이에 옮깁니다. 웰당 1밀리리터 배지를 추가하여 세포를 세척합니다. 세포 단층 위에 배지를 직접 추가하지 않도록 주의하여 중단을 방지하십시오.플레이트를 닫고 수동으로 부드럽게 흔듭니다. 배지를 흡인하고 웰당 1ml의 새 배지로 교체하십시오. 현미경으로 cell-free 갭을 시각화하고 시간 제로에서 이미지를 획득합니다.우물에서 매체를 빼내고 칼슘과 마그네슘이 보충된 PBS를 추가합니다. 플레이트를 흔들고 PBS를 제거한 다음 마지막으로 테스트 화합물을 웰에 추가합니다. 처리되지 않은 대조군 샘플의 경우 1mm 배지가 사용됩니다.플레이트를 배양합니다. 각 샘플에 대해 4배 배율로 현미경으로 세포 이동을 관찰하고 15시간, 20시간 및 24시간 배양 후 이미지를 획득합니다. 이 단계에서는 시간 0과 동일한 영역에서 이미지를 캡처해 보십시오.이미지가 캡처되는 시간 간격의 선택은 선택한 세포의 이동 속도에 따라 달라집니다. 실험이 완료되면 서로 다른 시간 간격으로 각 샘플에 대한 이미지를 선택하고 zip 파일을 만듭니다. 각 시간 간격에서 각 샘플에 대해 최소 3번의 반복실험을 갖는 것이 중요합니다.자동화된 이미지 분석 Wimasis 프로그램을 열고 가장 낮은 배율을 사용하여 zip 파일을 업로드합니다. 이 프로그램은 선택한 시점에서 셀로 덮인 영역과 스크래치 영역의 실험 데이터를 각 단일 샘플(예: 샘플 1a 및 2a)의 백분율로 포함하는 요약 파일을 이메일로 자동 제공합니다. 시간 0에서 모든 샘플의 평균값을 계산합니다.시간 0의 평균값을 기준으로 모든 데이터를 정규화합니다. 각 시점에서 모든 샘플의 평균값과 상대 표준 오차를 계산합니다. 양방향 분산 분석 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.얻어진 데이터는 서로 다른 샘플 그룹에 대해 서로 다른 시점에서의 셀 커버 영역의 백분율을 보여주는 히스토그램으로 그래프에 플롯할 수 있습니다. 이 히스토그램은 대조군과 비교하여 항균펩타이드 esculentin 1-21-1c 또는 esculentin 1-21의 농도가 다른 기관지 세포의 15, 20 및 24시간 치료 후 얻은 상처 봉합을 보여줍니다. 히스토그램 및 일부 대표적인 현미경 사진에서 지적한 바와 같이, esculentin 1-21-1c는 1개의 미세소금치에서 약 20시간 이내에 상처 부위의 거의 완전한 봉합으로 유도된 기관지 세포의 가성 상처의 재상피화를 촉진하는 데 더 효율적이며, esculentin 1-21, 즉 10 micromolar에 대해서는 더 높은 농도가 필요합니다.세포 이동에 대한 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor)와 같은 일부 수용체의 역할을 연구하려면 세포 단층을 특정 억제제(예: 화합물 AG1478)로 전처리하십시오. 이를 위해 인서트를 제거하기 전에 각 구획의 매체를 흡인하고 한 번 세척한 다음 5마이크로몰 AG1478이 보충된 70마이크로리터의 매체를 추가합니다. 플레이트를 30분 동안 배양합니다.그런 다음 핀셋으로 인서트를 제거하고 앞에서 설명한 대로 진행합니다. 이는 펩타이드 유도 세포 이동이 표피 성장 인자 수용체의 활성화를 포함한다는 것을 보여주는 최종 데이터입니다. 실제로, 억제제 AG1478로 전처리한 후, 펩타이드를 첨가하기 전에 AG1478로 세포를 사전 배양하지 않았을 때 발견된 결과와 비교하여 모든 시간 간격에서 세포로 덮인 면적의 비율이 크게 감소했습니다.결론적으로, 설명된 방법은 다양한 유형의 세포의 이동 특징에 대한 이해뿐만 아니라 가장 유망한 상처 치유 촉진제 및/또는 억제제의 선택에 대한 이해를 짧은 시간 내에 높은 정확도로 크게 향상시킬 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 쥐 근아세포의 이동 능력을 평가하기 위한 비접촉 공동 배양 상처 치유 분석에 대해 설명합니다. 이는 체외에서 paracrine non-canonical Wnt 신호 상호 작용의 신호 전송 및 신호 수신 구성 요소를 이해하는 데 도움이 됩니다.

공동 배양에서 쥐 근아세포의 이동 능력을 평가하기 위한 상처 분석

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

여기서, 우리는 96 웰 세포 배양 접시에 반 처리량 세포 이동 분석을 수행 할 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 셀 단층에 일관성 스크래치 상처를 만들 수있는, 빠르고 간단하고 경제적 인 방법이다.

96 웰 플레이트에 세포 마이그레이션 / 상처 치유를 수행하기위한 장치

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

이 연구는 상처 치유 (스크래치 분석 결과의) 메커니즘으로 비소 영향 세포 마이그레이션 등 어떻게 환경 오염 물질을 결정 하기 위한 생체 외에서 모델에 중점을 둡니다. 결과이 체 외 분석 결과 제공 신속 하 고 초기 징후 vivo에서 실험 전에 셀룰러 마이그레이션에 대 한 변경 하는 방법을 보여 줍니다.

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.

체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사

배우세요 면역조절 펩타이드가 기관지 상피세포 이동에 미치는 영향을 평가하는 새로운 체외 상처 치유 분석법을. 실리콘 배양 인서트와 자동화 이미지 분석을 활용하여 재현성 높은 정량 데이터를 신속하게 얻을 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

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