Name: 기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 바이러스 전사 공장에서 활성 전사를 시각화하는 nascent RNA-FISH와 아미노 염색 결합 기법을 사용하는 방법을. 유도형 바이러스 미니염색체 모델을 활용하여 바이러스 재활성화 과정의 게놈 구조 변화를 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 미국의 암 사회 연구 학술 상 (RSG-13-383-MPC)와 건강의 국가 학회 교부 금 (R01-DE025985)에 의해 지원 되었다. 이 작품 또한 지원 되었다 미국 농 무부 (2015-67015-23268 및 2014-67015-21787) 및 캘리포니아 대학에서에서 새로운 연구 이니셔티브 부여에서 교부 금에 의해 데이비스.

주의:이 절차에 사용 된 셀 라인 전염 성 바이러스를 포함, 조심 하 고만 레벨 2 BSL 시설 이상 진행.
1. 세포 준비 및 유지 보수
<ol><li>문화 체육-K-RTA BCBL-1 셀 (또는 다른 KSHV 감염 PEL 셀 라인) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린 스 글루타민 솔루션 보충 RPMI1640 매체에.</li>
	<li>지속적으로 성장 하 고 2-4 일 마다 1: 4의 비율에 의해 셀을 분할 하려면 확인 하 고 5% 이산화탄소 (CO2), 37 ° C에서 세포 성장.</li>
	<li>모니터 셀 문화는 가벼운 현미경으로 매일 좋은 세포 성장 및 형태학, 그렇지 않으면 것이 좋습니다 세포 배양을 다시 시작 하거나 셀 문화 조건에 따라 조정할 것인지.</li>
</ol>2. 티 미 딘 동기화 및 용균성 유도
<ol><li>10 cm 배양 접시, 접시 TREx-K-Rta BCBL-1 셀에 갓 준비 미디어 (미디어의 1 x 106 셀/2 mL)</li>
	<li>200mm 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM) 요리, 혼합 하 고 18 h에 품 어.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.</li>
	<li>8 h S-단계를 종료를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM), 혼합 및 16 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.</li>
	<li>바이러스 재 활성화를 유도, 세포 배양에 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, 최종 농도 20 ng/mL)와 아목시실린과 (DOX, 최종 농도가 100 ng/mL)을 추가 하 고 혼합 4 h에 대 한 품 어. K-Rta 유도할 수 있는 카세트 없이 셀 라인, TPA (최종 농도 20 ng/mL 및 나트륨 낙 산 염 (1mm))를 사용 하 여 다시 활성화 자극.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 완전 한 문화 미디어에 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 완전 한 문화 미디어에 resuspend.</li>
	<li>24 h에 대 한 성장 하는 세포 수 있습니다.</li>
</ol>3. 고정 및 Permeabilization
참고: 계속 하기 전에 확인 고정 솔루션 (DEPC 처리 PBS에 3.7% 포름알데히드), diethyl pyrocarbonate 처리 인산 염 버퍼 식 염 수 (DEPC-PBS), 글리신 DEPC PBS (글리신의 최종 농도: 100 m m) permeabilizating 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) 준비 된다. 일반적으로, 각 슬라이드 필요 적어도 0.5 백만 셀, 필요한 경우 증식 되며 포함 다시 추가 셀 위 세포가 건강 한 경우에 특히.
<ol><li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>원심 200 x g. 세척에서 2 분 동안 셀 셀 3 번 살 균 DEPC PBS의 1 mL. DEPC PBS의 1.2 ml에서 resuspend.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 바닥에 coverslips (실험적인 체제에 의해 결정)의 적절 한 수를 놓습니다.</li>
	<li>플라스틱 셀에 각 coverslip DEPC PBS 혼합물의 200 µ L, 각 슬라이드에 적어도 0.5 백만 셀 인지 확인 합니다. 2 분 해결 하기 위해 세포를 허용 하 고 발음만 세포의 얇은 층을 떠나 초과 DEPC PBS. 그것은이 과정에서 제거 되 고 셀에 대 한 정상입니다. 주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.</li>
	<li>신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (DEPC PBS에 3.7% 포름알데히드) 해결의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
	<li>Coverslips DEPC PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>글리신 DEPC PBS의 1 mL를 신중 하 게 추가 (글리신의 최종 농도: 100 mM) 각 커버 슬립. 5 분 동안 담금질 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
	<li>1 분 Aspirate 초과 DEPC PBS에 단단히 하지만 부드럽게 손을 흔들 또는 5 분 통에 DEPC PBS와 어느 곳의 1.5 mL를 추가 합니다. 수 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) permeabilizing의 1 mL를 추가 합니다. 15 분 동안 permeabilize를 셀 수 있습니다. 참고:이 시점에서 coverslips는 더 이상 일주일에 보다는-20 ° C 냉장고에 저장할 수 없습니다. 동결 방지 하거나 이미지 품질을 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 냉동 실에서 보낸 시간을 최소화 합니다. 있는지 확인 그 때 셀 남아 냉장고에에서 젖은 고는 그들이 제대로 리하이드레이션 DEPC PBS를 가진 후 냉장고에서 제거 하 고 메탄올/아세톤에 덮여.</li>
	<li>5 분 통에 어느 장소와 DEPC PBS의 1.5 mL를 추가 또는 단단히 악수 하지만 손에 부드럽게 1 분에 대 한 발음 초과 DEPC PBS, 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 아일랜드와 RNA-물고기
참고: RNA 물고기 프로브 라벨 및 준비에 관한: 대는 K-Rta 959 기본적인 쌍, 31 다른 프로브 intron 했다 생성 약 50%의 콘텐츠 20 기본적인 쌍 각, GC를 포함 했다. 프로브 및 재고 솔루션 각각 100 µ M와 2.5 µ M 농도, aliquoted 했다.
<ol><li>필요한 실험 정보 레이블 현미경 슬라이드 또는 구별할 수 라벨의 일종.</li>
	<li>축축한 종이 수건으로 sealable 플라스틱 컨테이너의 하단 라인.</li>
	<li>
1 차적인 항 체 솔루션을 준비 (1.5 µ L 라 나 항 체, RNA Pol II 항 체의 0.75 µ L, 베이커의 3 µ L의 tRNA, 30 µ L까지 DEPC PBS 효 모), 각 coverslip 존재에 대 한 제조 법을 곱하면. 각에 1 차적인 항 체 솔루션의 장소 30 µ L 현미경 슬라이드 표시.
	<ol>
<li>처음 관심의 1 차적인 항 체를 적정 하 고 최적의 금액을 사용 합니다. 반드시 사용 순화 IgG, 세럼 (ascites 액체) RNase의 다량을 포함할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이블이 지정 된 현미경 슬라이드에 coverslip (셀 솔루션을 직면 하 고)를 놓고 축축한 종이 수건으로 컨테이너에 슬라이드를 이동 합니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다. 커버 플라스틱 랩으로 컨테이너의 외관. 1 시간 동안 37 ° C로 설정 하는 인큐베이터에 컨테이너를 이동 합니다.</li>
	<li>준비 물고기 워시 버퍼 (2 x 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) (최종), 10 %formamide, 90% DEPC dH2O).</li>
	<li>준비 하는 교 잡 버퍼 x 2 (4 x SSC, 20 %dextran 황산).</li>
	<li>이차 항 체와 물고기 intron 프로브 버퍼 준비 (2 교 잡 버퍼 (최종 1 Hyb 버퍼 x) x의 20 µ L, 베이커의 효 모의 4 µ L tRNA (최종 10%), formamide (마지막 10%), K-Rta intron 프로브의 4 µ L (최종 125 nM), 0.8 µ g의 이차 항 체, DEPC dH2 최대 40 µ L O)입니다. 필요한 모든 슬라이드에 대 한 제조 법을 곱하면 됩니다.</li>
	<li>부 화, 후 3 번 5 분 6 잘 플레이트에서 DEPC PBS로 세포 세척.</li>
	<li>3 시간 5 분 대 한 물고기 워시 버퍼 씻어. 물고기 세척까지 버퍼에 유지 coverslip 혼합물의 둘째 항 체와 intron 프로브 (단계 4.7) 준비 완료.</li>
	<li>깨끗 한 유리 슬라이드 교 잡에 대 한 1 차적인 항 체 외피에 대 한 사용.</li>
	<li>이차 항 체와 물고기 intron 프로브 솔루션 각 유리 슬라이드에 포함 된 40 µ L를 배치 합니다.</li>
	<li>거품을 소개를 하지 않도록 주의 수 버퍼, 위에 셀 면 슬라이드에 세포와 coverslips을 놓습니다.</li>
	<li>하단에 축축한 종이 수건으로 플라스틱 용기에 슬라이드를 놓습니다. 최초의 플라스틱 포장 및 알루미늄 호 일 플라스틱 용기 포장.</li>
	<li>16-24 h에 대 한 37 ° C에서 슬라이드와 컨테이너를 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 신중 하 게는 coverslip 유리 슬라이드 가장자리에서 슬라이드 다시 위로 향하도록 6 잘 플레이트에 넣어 그리고 물고기 워시 버퍼 3 회에서 5 분 동안 6 잘 플레이트 세포를 씻어.</li>
	<li>2 번 2와 셀 세척 x SSC.</li>
	<li>2로 DAPI (1:1, 000)를 추가 x SSC 및 실 온에서 5 분 동안 앉아 있게.</li>
	<li>2 번 2와 셀 세척 x SSC.</li>
	<li>교 잡, 사용 유리 슬라이드를 청소 하 고 유리 슬라이드에 솔루션 설치 10 µ L을 추가.</li>
	<li>장착 솔루션에 coverslips 뒤집어를 놓습니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다.</li>
	<li>연구소 조직으로 부드럽게 셀 스쿼시 주의 초과 설치 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>매니큐어를 사용 하는 coverslips의 가장자리 주위에 충분 한 레이어를 적용 하 고 건조를 허용.</li>
	<li>형광 현미경 검사 법 수행을 계속 진행 합니다.</li>
</ol>5. 3D 형광 현미경 검사 법
참고: 프로토콜 사용 하는 형광 현미경 시스템의 유형을 변화할 것 이다, 하는 동안 다음 단계 정량 분석에 대 한 최적의 이미지 데이터의 수집을 위해 도움이 됩니다.
<ol><li>고정된 샘플을 pretreat 고 형광 photobleaching 이미징 동안 지연 방지 페이드 미디어에 탑재.</li>
	<li>모든 셀 (또는 셀 핵)을 캡처할 수 있습니다 (예: 60 X 1.42 한다 기름 침수 렌즈), 높은 품질 목표를 사용 하 여 보기의 필드에.</li>
	<li>노출 매개 변수 (예를 들어, 전원을, 노출 시간 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 각 형광 색 채널에 대 한) 설정 합니다. 형광 이미지를 취득 합니다. 참고: 하나의 형광 라벨을 포함 하는 긍정적인 컨트롤 샘플도 색상 채널 사이 "누화"의 레벨을 사용 해야 합니다. 이미지 고정된 셀 표본에 대 한 형광 전원을 줄일 수 있습니다 (약간 더 긴 노출 시간)와 photobleaching를 최소화 하기 위해.</li>
	<li>이미징 프로토콜 설정 된 후 유지 동일한 노출 매개 변수 연구에서 모든 샘플에 대 한 일관성 있는-이미지 데이터를 정확 하 게 분석 하 고 비교할 수 있도록.</li>
	<li>사후 수집 이미지 처리 및 3 차원 재구성을 수행 합니다. 식별 RNA 물고기 신호 (적색)에 의해 K-Rta 사본, 면역 형광 (녹색), 및 핵 chromatin 라 나 분자 (해당 되는 경우) DAPI (파란색)으로 물. 참고: 있는 K-Rta와 라 나 공동 클러스터는 세포 핵의 지역 따라서 바이러스 성 녹음 방송 공장 및 복잡 한 복제와 관련 된 것으로 믿어진다.</li>
</ol>

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</ol>

이 문서의 저자는 금융 관계 또는 관심사의 경쟁 충돌 있다.

특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.
PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 수 있습니다 경우에 coverslips은 철저 하 게 충분 한 세척 된다, 글리신과 포름알데히드를 냉각 하 고 프로토콜에서 차단 솔루션으로 서 소 혈 청 알 부 민을 사용 하지 않습니다. 파일럿 연구는 RNA 저하 때문에 아마도 약한 RNA 물고기 신호를 보여준 이즈미 야 실험실에서 실시. 1 차 항 체에 대 한 차단, 필요한 경우 RNase 무료 BSA를 사용 하는 것이 좋습니다. 과거의 경험, 그것은 발견 되었다 항 체 특정 경우에, BSA...

그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로1특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간1방법으로 생성 합니다.
그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급2를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ' 점프 '를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵2수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.
생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB) 여전히 존재. 그것은 탠덤 DNA 반복 (핵소체), rRNA (핵소체) 및 coilin (Cajal 몸) 또는 PML 등 구조 단백질 같은 메커니즘의 다양 한 통해 단백질 (PML-NB)는 이러한 구문을 함께3,4,5 . 이러한 구조와 전사 공장 등 다른 교회 역할 뿐만 아니라 필수 구성 요소의 현지 농도 증가 하지만 단백질 및 궁극적으로 만들 그들 내에서 핵 산의 구성 조절 건설 기계는 효율적인 세포 기능6중앙 사이트입니다.
머릿속으로 하는 핵 구조 형태 epigenetics 공부 하는 연구원에 게 풍부한 정보를 제공 언제, 어디. 바이러스학의 관점에서 KSHV, 같은 latently 감염된 바이러스의 재 활성화 크게 변경 핵의 풍경과 전사 세포 유전자에서 주로 바이러스 성 유전자, 궁극적으로 이동 핵 효소의 분포를 완전 한 기능 바이러스 자손7,8생산. KSHV는 바이러스 성 유전자 발현을 촉진 하기 위하여 세포 유전자 식 기계를 어떻게 조작 합니까? 이러한 정보에는 일시적인 세포 유전자 규제 메커니즘에 빛 창 고 수 있습니다.
다른 모든 herpesviruses KSHV는 용균성 복제 및 지연 시간 이라는 두 개의 라이프 사이클. KSHV는 주로 대기 시간 관련 유전자9,10를 제외 하 고는 대부분의 바이러스 성 유전자의 식 입 막 음, 대기 시간 단계에 상주 합니다. KSHV 생산 대기 시간 동안 대기 핵 항 원 (라 나), constitutively 바이러스 성 게놈을 결속 하 고 인간 염색체11에 바이러스 chromatin tethers 관련. 바이러스 성 게놈과 라 나의 친밀 한 관계 때문에 IFA와 DAPI를 사용 하 여 얼룩을 바이러스 성 episomes 호스트 chromatin 관계 했다 찾을 수 있다.
공부 하 고 단일 episome 수준과 감염 된 세포에 바이러스 성 다른 episomes와 협회에 KSHV 재 활성화, 적극적으로 베 끼 기 바이러스 chromatin에 제자리에 찾을 전략 설립 되었습니다. 따라서, 라 나 및 RNAPII IFA intron RNA-물고기와 결합 했다, KSHV K Rta는 주요 바이러스 성 단백질의 intron 지역 (정확한 프로브 시퀀스 이즈미 야 연구소의 최신 간행물8에서 찾을 수 있습니다)에 바인딩되는 RNA-물고기 프로브를 생성 하 여 필수 고 KSHV 다시 활성화-그것은 식별 가능한 충분 한 전사 찍고 실제로 어디 장소8,11,12,,1314,15 . 이 intron RNA-물고기 기술 연구원을 어디 mRNA 접합 이며 세포질16,17수출 직전 변하게 되는 시각화 수 있습니다.
KSHV phorbol 에스테 르 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) 등을 포함 한 다양 한 화학적 자극에 의해 활성화 될 수 있습니다 및 또한 KSHV 낙 산 염 나트륨 같은 히스톤 deacetylase 억제 물의 overexpression에 의해 활성화 유도 될 수 있다 바이러스 성 녹음 방송 인수, K-Rta19입니다. 연구원은 성공적으로 다시 활성화18유도 전에 셀의 사이클을 동기화 하 여 KSHV 재 활성화의 효율성 증가. 따라서, 이러한 특정 연구에 대 한 셀 더블 티 미 딘 블록 (아래에 설명 된 프로토콜)를 사용 하 여 및 짧은 시간에 대 한 TPA와 아목시실린과 (Dox) 알을 품을 동기화 했다. Doxycyline는 이러한 실험에 활용 셀 라인 doxycycline 유도할 수 있는 K-Rta 카세트 cDNA에서 복제 했다 하 고 K-Rta의 intron 지역에 포함 되지 않습니다 때문에 사용 되었다. 다시 활성화할 수 있지만 K-Rta 식 유도 KSHV 사용 하 여, 그것은 입증 된 다른 연구자는 다양 한 다른 생 화 확 적인 요인으로 인해 K-Rta 식 혼자 판명 미약한 재 자극20. 이들의 모두를 결합 하 여, 시간의 짧은 기간에 마약 외피를 제한 하 여 강력한 하지만 지나치게 인공 KSHV 재 이미징 달성 되었다.
라 나, RNAPII, 라벨링 후 K-Rta introns 그리고 DNA로이 문서에 설명 된, 3D 형광 이미징 widefield deconvolution 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 이미징 소프트웨어와 처리 후 활성 바이러스 episomes의 공간적 분포는 제대로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 활성 chromatin 허브 및 다른 핵 구조 형성의 근본적인 성격에 관한 중앙 질문 공부 될 수 있다. 동일한 규제 요소를 처리 하는 단일 셀에 있는 동일한 바이러스 episomes spatiotemporal 유전자 규제 메커니즘의 이해를 깊게 하는 독특한 연구 도구를 나타낼 수 있습니다.
이미징 여러 세포 표본을 다른 시간 지점에서 고정 본질적으로 동적 분자 과정의 특성의 한계는 형광 분포에서 미묘한 또는 소규모 변화 감지 되지 않습니다 또는 하 찮은 것으로 간주. 희소 한 경우에 모든 세포 관찰 같은 미묘한 변화를 표시 하지 않는 한 이것은 사실 이다. 따라서, 활성 바이러스 성 전사 및 다른 핵 구조의 전체 spatiotemporal 관계 비판적으로 계산 해야 고정 된 이미지를 사용 하 여 합니다. 이러한 기술적 과제를 해결 하기 위해 가장 좋은 방법은 이미지 라이브 세포 바이러스 episomes을 표시 하 고 시간이 지남에 주요 세포질 효소의 위치에 따라입니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 매체 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>37°C로 가열해야 합니다. C</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>펜 스트렙 글루타민 (100x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>티미딘&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s 인산염 완충 용액</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>시그마 알드리치</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>소듐 부티레이트&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 솔루션&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>부식성, 독성, 건강 위험</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>급성 독성&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>가연성, 독성</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Advanced Biotechnologies</td>에 대한 가연성, 독성, 건강 위험 쥐 단클론 항체 <td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II 항체 클론 CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleic acid, baker에서 전송' s 효모 (S. cerevisiae)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>식염수 시트르산 나트륨 버퍼 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15557044</tr><tr><td>포름아미드&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% 용액</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold antifade 시약</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D 이미징 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

기능 이미징 3d 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.

BCBL-1 셀 사용 되 고 라 나와 K-Rta RNA (그림 1) 스테인드 했다 약간 요약된 프로토콜 수행 되었다. 이 실험 검사 바이러스 episomes 적극적으로 베 끼고는 및 셀의 인구에 KSHV 재 자극에 응답의이를 수 있습니다. 그림 1에서 화살표로 표시 된 셀에 밀접 하 게 일치 (로 표시 라 나) 바이러스 episomes의 분포 지역에 고유 K Rta 형광 KSHV 게놈 가까이 일어나 활성 전사에 대 한 증거입니다. 동일한 샘플에서는 그림 1 에서 화살촉에 의해 의미 하는 것과 같은 셀 관찰할 수 있습니다, 많은 약한 및 확산 K Rta 형광 크게 중복 되지 않는 그 라 나로 전시 하는. 이것은 일반적인 찾는 내 세포의 인구는 다시 활성화 자극에 응답의 정도에 상당한 변화 보여줍니다.
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바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

초기 RNA-FISH를 바이러스 잠재 단백질의 아미노 염색과 결합하는 전반적인 목표는 바이러스 전사 공장 형성과 결합된 활성 전사를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 유전학, 세포 생물학, 바이러스학 및 세포 생물학 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유도 가능한 바이러스 미니 염색체 모델을 활용하여 게놈 구조 변화의 이면에 있는 분자 세부 사항을 연구한다는 것입니다.1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다. 200V 중력에서 2분 동안 셀을 원심분리합니다. 1ml의 멸균 DEPC PBS로 세포를 세 번 세척합니다.다음으로, 1.2ml의 DEPC PBS에 셀을 다시 현탁시킵니다. 덮개 슬립을 6웰 플레이트의 바닥에 놓습니다. 피펫 200 마이크로 리터의 셀 DEPC PBS 혼합물을 각 커버 슬립에 넣습니다.세포가 2분 동안 정착한 후 과도한 DEPC PBS를 흡인하여 얇은 세포층만 남깁니다. 각 커버 슬립에 1ml의 고정 용액을 조심스럽게 추가하십시오. 10분 동안 세포가 고정되도록 합니다.DEPC PBS로 커버 슬립을 세 번 세척합니다. 세척 후 각 커버 슬립에 100밀리몰의 글리신 최종 농도에 1밀리리터의 글리신 DEPC PBS를 조심스럽게 추가합니다. 세포가 5분 동안 담금질되도록 합니다.DEPC PBS 1.5ml를 넣고 셰이커에 5분 동안 놓고 손에 들고 1분 동안 단단하지만 부드럽게 흔듭니다. 과도한 DEPC PBS를 흡인하고 세포를 파괴하지 않도록 주의하십시오. 각 커버 슬립에 1ml의 투과 용액을 조심스럽게 첨가하십시오.세포가 15분 동안 투과화되도록 합니다. DEPC PBS 1.5밀리리터를 추가합니다. 세포를 셰이커에 5분 동안 놓고 1분 동안 손에 들고 단단하지만 부드럽게 흔듭니다.과도한 DEPC PBS를 흡인하고 세포를 파괴하지 않도록 주의하십시오. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 종이 타월을 적신 다음 밀봉 가능한 플라스틱 용기 바닥에 타월을 깔아줍니다. 다음으로, 1차 항체 용액을 준비하고 존재하는 각 커버 슬립에 대한 레시피를 곱합니다.30마이크로리터의 1차 항체 용액을 라벨이 부착된 각 현미경 슬라이드에 놓습니다. 커버 슬립의 모서리를 잡고 부드럽게 튕겨 1차 항체 농도가 올바른지 확인합니다. 또한 조직의 모서리를 사용하여 과도한 수분을 흡수할 수 있습니다.그런 다음 라벨이 부착된 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 놓고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 용기 외부를 플라스틱 랩으로 덮습니다. 용기를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터로 1시간 동안 옮깁니다.배양 중에 필요한 시약을 준비하십시오. 배양 후 6웰 플레이트에서 DEPC PBS로 세포를 각각 5분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 FISH 세척 버퍼로 세포를 각각 5분씩 3회 세척합니다.그리고 2차 항체인 인트론 프로브 혼합물이 준비될 때까지 커버 슬립을 FISH 세척 버퍼에 유지합니다. 다음으로, 비눗물과의 혼성화를 위한 1차 항체 배양을 위해 유리 슬라이드를 세척합니다. 건조된 후에는 에탄올과 실험실 티슈로 세척한다.40마이크로리터의 2차 항체와 용액이 있는 FISH 인트론 프로브를 각 유리 슬라이드에 놓습니다. 셀이 있는 커버 슬립을 셀 면이 버퍼 위에 아래를 향하도록 하여 슬라이드에 놓습니다. 그리고 거품이 생기지 않도록 주의하세요.바닥에 축축한 종이 타월이 있는 플라스틱 용기에 슬라이드를 넣습니다. 플라스틱 용기를 먼저 플라스틱 랩으로 감싼 다음 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그리고 슬라이드와 함께 용기를 배양합니다.배양 후 유리 슬라이드의 가장자리에서 커버 슬립을 조심스럽게 밀어 위로 향하게 하여 6웰 플레이트에 다시 놓습니다. FISH 세척 버퍼로 세포를 6웰 플레이트에서 각각 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, 2중 SSC로 세포를 두 번 세척합니다.1에서 1000 농도의 DAPI를 2중 SSC에 추가하고 용액을 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다. 2중 SSC로 세포를 두 번 세척합니다. 하이브리드화에 사용되는 유리 슬라이드를 청소하고 유리 슬라이드에 10마이크로리터의 장착 용액을 추가합니다.덮개 슬립을 앞면이 아래로 향하게 하여 장착 솔루션에 놓습니다. 실험실 조직으로 여분의 장착 용액을 부드럽게 제거하고 세포가 찌그러지지 않도록주의하십시오. 매니큐어를 사용하여 커버 슬립 가장자리 주위에 충분한 층을 바르고 매니큐어가 건조되도록 합니다.이제 샘플은 형광 현미경 검사를 위한 준비가 되었습니다. BCBL-1 세포를 LANA 및 K-RTA RNA에 대해 염색하여 활발하게 전사하는 바이러스 에피솜이 있는 위치와 Kaposi의 육종 관련 헤르페스 바이러스 또는 KSHV 재활성화 자극에 대한 반응의 이질성을 조사했습니다. 바이러스 에피솜의 분포와 밀접하게 일치하는 영역에서 뚜렷한 K-Rta 형광은 KSHV 게놈 가까이에서 활발한 전사가 일어나고 있다는 증거입니다.동일한 샘플에서 LANA와 크게 겹치지 않는 훨씬 더 약하고 확산된 K-Rta 형광을 보이는 세포를 관찰할 수 있으며, 이는 세포 집단 내에서 상당한 변동과 재활성화 자극에 대한 반응 정도를 보여줍니다. 다음으로, 바이러스 단백질의 발현을 시각화하여 티미딘 동기화의 효과를 조사했는데, 이는 동기화된 세포가 동기화되지 않은 집단보다 재활성화 자극에 더 많이 반응한다는 것을 명확하게 보여주었습니다. DAPI 염색은 여러 기능을 수행할 수 있으며, 이 예는 하나가 아닌 세 개의 개별 셀이 있음을 명확하게 보여줍니다.이 기술과 함께 3D 현미경을 사용하면 주변에 점재하는 KSHV 게놈에서 볼 수 있는 고리 모양의 RNA PII 구조가 밝혀졌습니다. 이 개발과 함께, 미니 바이러스 염색체는 연구자들이 유전자 발현의 특별한 시간적 조직과 세포핵의 퇴행을 탐구할 수 있는 독특한 도구를 제공할 것입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

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출처: Bratton, B. P. 외, 『박테리아 세포의 3차원 영상 정밀 세포 표현과 단백질 위치 파악』. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 박테리아 세포의 3차원 형광 이미지를 획득하고 분석하여 단일 세포 수준에서 단백질 조직을 연구하는 방법을 시연합니다.

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alphaherpes 바이러스 감염의 라이브 셀 이미징 직접 수송 및 간 스프레드의 동적 이벤트 분석을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 차 신경의 감염시 바이러스 어셈블리의 시각화를 촉진하기 위해 형광 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 변종을 활용 방법론을 제시한다.

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여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

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