기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

초기 RNA-FISH를 바이러스 잠재 단백질의 아미노 염색과 결합하는 전반적인 목표는 바이러스 전사 공장 형성과 결합된 활성 전사를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 유전학, 세포 생물학, 바이러스학 및 세포 생물학 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유도 가능한 바이러스 미니 염색체 모델을 활용하여 게놈 구조 변화의 이면에 있는 분자 세부 사항을 연구한다는 것입니다.

1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다. 200V 중력에서 2분 동안 셀을 원심분리합니다. 1ml의 멸균 DEPC PBS로 세포를 세 번 세척합니다.

다음으로, 1.2ml의 DEPC PBS에 셀을 다시 현탁시킵니다. 덮개 슬립을 6웰 플레이트의 바닥에 놓습니다. 피펫 200 마이크로 리터의 셀 DEPC PBS 혼합물을 각 커버 슬립에 넣습니다.

세포가 2분 동안 정착한 후 과도한 DEPC PBS를 흡인하여 얇은 세포층만 남깁니다. 각 커버 슬립에 1ml의 고정 용액을 조심스럽게 추가하십시오. 10분 동안 세포가 고정되도록 합니다.

DEPC PBS로 커버 슬립을 세 번 세척합니다. 세척 후 각 커버 슬립에 100밀리몰의 글리신 최종 농도에 1밀리리터의 글리신 DEPC PBS를 조심스럽게 추가합니다. 세포가 5분 동안 담금질되도록 합니다.

DEPC PBS 1.5ml를 넣고 셰이커에 5분 동안 놓고 손에 들고 1분 동안 단단하지만 부드럽게 흔듭니다. 과도한 DEPC PBS를 흡인하고 세포를 파괴하지 않도록 주의하십시오. 각 커버 슬립에 1ml의 투과 용액을 조심스럽게 첨가하십시오.

세포가 15분 동안 투과화되도록 합니다. DEPC PBS 1.5밀리리터를 추가합니다. 세포를 셰이커에 5분 동안 놓고 1분 동안 손에 들고 단단하지만 부드럽게 흔듭니다.

과도한 DEPC PBS를 흡인하고 세포를 파괴하지 않도록 주의하십시오. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 종이 타월을 적신 다음 밀봉 가능한 플라스틱 용기 바닥에 타월을 깔아줍니다. 다음으로, 1차 항체 용액을 준비하고 존재하는 각 커버 슬립에 대한 레시피를 곱합니다.

30마이크로리터의 1차 항체 용액을 라벨이 부착된 각 현미경 슬라이드에 놓습니다. 커버 슬립의 모서리를 잡고 부드럽게 튕겨 1차 항체 농도가 올바른지 확인합니다. 또한 조직의 모서리를 사용하여 과도한 수분을 흡수할 수 있습니다.

그런 다음 라벨이 부착된 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 놓고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 용기 외부를 플라스틱 랩으로 덮습니다. 용기를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터로 1시간 동안 옮깁니다.

배양 중에 필요한 시약을 준비하십시오. 배양 후 6웰 플레이트에서 DEPC PBS로 세포를 각각 5분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 FISH 세척 버퍼로 세포를 각각 5분씩 3회 세척합니다.

그리고 2차 항체인 인트론 프로브 혼합물이 준비될 때까지 커버 슬립을 FISH 세척 버퍼에 유지합니다. 다음으로, 비눗물과의 혼성화를 위한 1차 항체 배양을 위해 유리 슬라이드를 세척합니다. 건조된 후에는 에탄올과 실험실 티슈로 세척한다.

40마이크로리터의 2차 항체와 용액이 있는 FISH 인트론 프로브를 각 유리 슬라이드에 놓습니다. 셀이 있는 커버 슬립을 셀 면이 버퍼 위에 아래를 향하도록 하여 슬라이드에 놓습니다. 그리고 거품이 생기지 않도록 주의하세요.

바닥에 축축한 종이 타월이 있는 플라스틱 용기에 슬라이드를 넣습니다. 플라스틱 용기를 먼저 플라스틱 랩으로 감싼 다음 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그리고 슬라이드와 함께 용기를 배양합니다.

배양 후 유리 슬라이드의 가장자리에서 커버 슬립을 조심스럽게 밀어 위로 향하게 하여 6웰 플레이트에 다시 놓습니다. FISH 세척 버퍼로 세포를 6웰 플레이트에서 각각 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, 2중 SSC로 세포를 두 번 세척합니다.

1에서 1000 농도의 DAPI를 2중 SSC에 추가하고 용액을 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다. 2중 SSC로 세포를 두 번 세척합니다. 하이브리드화에 사용되는 유리 슬라이드를 청소하고 유리 슬라이드에 10마이크로리터의 장착 용액을 추가합니다.

덮개 슬립을 앞면이 아래로 향하게 하여 장착 솔루션에 놓습니다. 실험실 조직으로 여분의 장착 용액을 부드럽게 제거하고 세포가 찌그러지지 않도록주의하십시오. 매니큐어를 사용하여 커버 슬립 가장자리 주위에 충분한 층을 바르고 매니큐어가 건조되도록 합니다.

이제 샘플은 형광 현미경 검사를 위한 준비가 되었습니다. BCBL-1 세포를 LANA 및 K-RTA RNA에 대해 염색하여 활발하게 전사하는 바이러스 에피솜이 있는 위치와 Kaposi의 육종 관련 헤르페스 바이러스 또는 KSHV 재활성화 자극에 대한 반응의 이질성을 조사했습니다. 바이러스 에피솜의 분포와 밀접하게 일치하는 영역에서 뚜렷한 K-Rta 형광은 KSHV 게놈 가까이에서 활발한 전사가 일어나고 있다는 증거입니다.

동일한 샘플에서 LANA와 크게 겹치지 않는 훨씬 더 약하고 확산된 K-Rta 형광을 보이는 세포를 관찰할 수 있으며, 이는 세포 집단 내에서 상당한 변동과 재활성화 자극에 대한 반응 정도를 보여줍니다. 다음으로, 바이러스 단백질의 발현을 시각화하여 티미딘 동기화의 효과를 조사했는데, 이는 동기화된 세포가 동기화되지 않은 집단보다 재활성화 자극에 더 많이 반응한다는 것을 명확하게 보여주었습니다. DAPI 염색은 여러 기능을 수행할 수 있으며, 이 예는 하나가 아닌 세 개의 개별 셀이 있음을 명확하게 보여줍니다.

이 기술과 함께 3D 현미경을 사용하면 주변에 점재하는 KSHV 게놈에서 볼 수 있는 고리 모양의 RNA PII 구조가 밝혀졌습니다. 이 개발과 함께, 미니 바이러스 염색체는 연구자들이 유전자 발현의 특별한 시간적 조직과 세포핵의 퇴행을 탐구할 수 있는 독특한 도구를 제공할 것입니다.