Name: 기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 바이러스 전사 공장에서 활성 전사를 시각화하는 nascent RNA-FISH와 아미노 염색 결합 기법을 사용하는 방법을. 유도형 바이러스 미니염색체 모델을 활용하여 바이러스 재활성화 과정의 게놈 구조 변화를 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 미국의 암 사회 연구 학술 상 (RSG-13-383-MPC)와 건강의 국가 학회 교부 금 (R01-DE025985)에 의해 지원 되었다. 이 작품 또한 지원 되었다 미국 농 무부 (2015-67015-23268 및 2014-67015-21787) 및 캘리포니아 대학에서에서 새로운 연구 이니셔티브 부여에서 교부 금에 의해 데이비스.

주의:이 절차에 사용 된 셀 라인 전염 성 바이러스를 포함, 조심 하 고만 레벨 2 BSL 시설 이상 진행.
1. 세포 준비 및 유지 보수
<ol><li>문화 체육-K-RTA BCBL-1 셀 (또는 다른 KSHV 감염 PEL 셀 라인) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린 스 글루타민 솔루션 보충 RPMI1640 매체에.</li>
	<li>지속적으로 성장 하 고 2-4 일 마다 1: 4의 비율에 의해 셀을 분할 하려면 확인 하 고 5% 이산화탄소 (CO2), 37 ° C에서 세포 성장.</li>
	<li>모니터 셀 문화는 가벼운 현미경으로 매일 좋은 세포 성장 및 형태학, 그렇지 않으면 것이 좋습니다 세포 배양을 다시 시작 하거나 셀 문화 조건에 따라 조정할 것인지.</li>
</ol>2. 티 미 딘 동기화 및 용균성 유도
<ol><li>10 cm 배양 접시, 접시 TREx-K-Rta BCBL-1 셀에 갓 준비 미디어 (미디어의 1 x 106 셀/2 mL)</li>
	<li>200mm 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM) 요리, 혼합 하 고 18 h에 품 어.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.</li>
	<li>8 h S-단계를 종료를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM), 혼합 및 16 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.</li>
	<li>바이러스 재 활성화를 유도, 세포 배양에 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, 최종 농도 20 ng/mL)와 아목시실린과 (DOX, 최종 농도가 100 ng/mL)을 추가 하 고 혼합 4 h에 대 한 품 어. K-Rta 유도할 수 있는 카세트 없이 셀 라인, TPA (최종 농도 20 ng/mL 및 나트륨 낙 산 염 (1mm))를 사용 하 여 다시 활성화 자극.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 완전 한 문화 미디어에 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 완전 한 문화 미디어에 resuspend.</li>
	<li>24 h에 대 한 성장 하는 세포 수 있습니다.</li>
</ol>3. 고정 및 Permeabilization
참고: 계속 하기 전에 확인 고정 솔루션 (DEPC 처리 PBS에 3.7% 포름알데히드), diethyl pyrocarbonate 처리 인산 염 버퍼 식 염 수 (DEPC-PBS), 글리신 DEPC PBS (글리신의 최종 농도: 100 m m) permeabilizating 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) 준비 된다. 일반적으로, 각 슬라이드 필요 적어도 0.5 백만 셀, 필요한 경우 증식 되며 포함 다시 추가 셀 위 세포가 건강 한 경우에 특히.
<ol><li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>원심 200 x g. 세척에서 2 분 동안 셀 셀 3 번 살 균 DEPC PBS의 1 mL. DEPC PBS의 1.2 ml에서 resuspend.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 바닥에 coverslips (실험적인 체제에 의해 결정)의 적절 한 수를 놓습니다.</li>
	<li>플라스틱 셀에 각 coverslip DEPC PBS 혼합물의 200 µ L, 각 슬라이드에 적어도 0.5 백만 셀 인지 확인 합니다. 2 분 해결 하기 위해 세포를 허용 하 고 발음만 세포의 얇은 층을 떠나 초과 DEPC PBS. 그것은이 과정에서 제거 되 고 셀에 대 한 정상입니다. 주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.</li>
	<li>신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (DEPC PBS에 3.7% 포름알데히드) 해결의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
	<li>Coverslips DEPC PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>글리신 DEPC PBS의 1 mL를 신중 하 게 추가 (글리신의 최종 농도: 100 mM) 각 커버 슬립. 5 분 동안 담금질 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
	<li>1 분 Aspirate 초과 DEPC PBS에 단단히 하지만 부드럽게 손을 흔들 또는 5 분 통에 DEPC PBS와 어느 곳의 1.5 mL를 추가 합니다. 수 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) permeabilizing의 1 mL를 추가 합니다. 15 분 동안 permeabilize를 셀 수 있습니다. 참고:이 시점에서 coverslips는 더 이상 일주일에 보다는-20 ° C 냉장고에 저장할 수 없습니다. 동결 방지 하거나 이미지 품질을 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 냉동 실에서 보낸 시간을 최소화 합니다. 있는지 확인 그 때 셀 남아 냉장고에에서 젖은 고는 그들이 제대로 리하이드레이션 DEPC PBS를 가진 후 냉장고에서 제거 하 고 메탄올/아세톤에 덮여.</li>
	<li>5 분 통에 어느 장소와 DEPC PBS의 1.5 mL를 추가 또는 단단히 악수 하지만 손에 부드럽게 1 분에 대 한 발음 초과 DEPC PBS, 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 아일랜드와 RNA-물고기
참고: RNA 물고기 프로브 라벨 및 준비에 관한: 대는 K-Rta 959 기본적인 쌍, 31 다른 프로브 intron 했다 생성 약 50%의 콘텐츠 20 기본적인 쌍 각, GC를 포함 했다. 프로브 및 재고 솔루션 각각 100 µ M와 2.5 µ M 농도, aliquoted 했다.
<ol><li>필요한 실험 정보 레이블 현미경 슬라이드 또는 구별할 수 라벨의 일종.</li>
	<li>축축한 종이 수건으로 sealable 플라스틱 컨테이너의 하단 라인.</li>
	<li>
1 차적인 항 체 솔루션을 준비 (1.5 µ L 라 나 항 체, RNA Pol II 항 체의 0.75 µ L, 베이커의 3 µ L의 tRNA, 30 µ L까지 DEPC PBS 효 모), 각 coverslip 존재에 대 한 제조 법을 곱하면. 각에 1 차적인 항 체 솔루션의 장소 30 µ L 현미경 슬라이드 표시.
	<ol>
<li>처음 관심의 1 차적인 항 체를 적정 하 고 최적의 금액을 사용 합니다. 반드시 사용 순화 IgG, 세럼 (ascites 액체) RNase의 다량을 포함할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이블이 지정 된 현미경 슬라이드에 coverslip (셀 솔루션을 직면 하 고)를 놓고 축축한 종이 수건으로 컨테이너에 슬라이드를 이동 합니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다. 커버 플라스틱 랩으로 컨테이너의 외관. 1 시간 동안 37 ° C로 설정 하는 인큐베이터에 컨테이너를 이동 합니다.</li>
	<li>준비 물고기 워시 버퍼 (2 x 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) (최종), 10 %formamide, 90% DEPC dH2O).</li>
	<li>준비 하는 교 잡 버퍼 x 2 (4 x SSC, 20 %dextran 황산).</li>
	<li>이차 항 체와 물고기 intron 프로브 버퍼 준비 (2 교 잡 버퍼 (최종 1 Hyb 버퍼 x) x의 20 µ L, 베이커의 효 모의 4 µ L tRNA (최종 10%), formamide (마지막 10%), K-Rta intron 프로브의 4 µ L (최종 125 nM), 0.8 µ g의 이차 항 체, DEPC dH2 최대 40 µ L O)입니다. 필요한 모든 슬라이드에 대 한 제조 법을 곱하면 됩니다.</li>
	<li>부 화, 후 3 번 5 분 6 잘 플레이트에서 DEPC PBS로 세포 세척.</li>
	<li>3 시간 5 분 대 한 물고기 워시 버퍼 씻어. 물고기 세척까지 버퍼에 유지 coverslip 혼합물의 둘째 항 체와 intron 프로브 (단계 4.7) 준비 완료.</li>
	<li>깨끗 한 유리 슬라이드 교 잡에 대 한 1 차적인 항 체 외피에 대 한 사용.</li>
	<li>이차 항 체와 물고기 intron 프로브 솔루션 각 유리 슬라이드에 포함 된 40 µ L를 배치 합니다.</li>
	<li>거품을 소개를 하지 않도록 주의 수 버퍼, 위에 셀 면 슬라이드에 세포와 coverslips을 놓습니다.</li>
	<li>하단에 축축한 종이 수건으로 플라스틱 용기에 슬라이드를 놓습니다. 최초의 플라스틱 포장 및 알루미늄 호 일 플라스틱 용기 포장.</li>
	<li>16-24 h에 대 한 37 ° C에서 슬라이드와 컨테이너를 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 신중 하 게는 coverslip 유리 슬라이드 가장자리에서 슬라이드 다시 위로 향하도록 6 잘 플레이트에 넣어 그리고 물고기 워시 버퍼 3 회에서 5 분 동안 6 잘 플레이트 세포를 씻어.</li>
	<li>2 번 2와 셀 세척 x SSC.</li>
	<li>2로 DAPI (1:1, 000)를 추가 x SSC 및 실 온에서 5 분 동안 앉아 있게.</li>
	<li>2 번 2와 셀 세척 x SSC.</li>
	<li>교 잡, 사용 유리 슬라이드를 청소 하 고 유리 슬라이드에 솔루션 설치 10 µ L을 추가.</li>
	<li>장착 솔루션에 coverslips 뒤집어를 놓습니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다.</li>
	<li>연구소 조직으로 부드럽게 셀 스쿼시 주의 초과 설치 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>매니큐어를 사용 하는 coverslips의 가장자리 주위에 충분 한 레이어를 적용 하 고 건조를 허용.</li>
	<li>형광 현미경 검사 법 수행을 계속 진행 합니다.</li>
</ol>5. 3D 형광 현미경 검사 법
참고: 프로토콜 사용 하는 형광 현미경 시스템의 유형을 변화할 것 이다, 하는 동안 다음 단계 정량 분석에 대 한 최적의 이미지 데이터의 수집을 위해 도움이 됩니다.
<ol><li>고정된 샘플을 pretreat 고 형광 photobleaching 이미징 동안 지연 방지 페이드 미디어에 탑재.</li>
	<li>모든 셀 (또는 셀 핵)을 캡처할 수 있습니다 (예: 60 X 1.42 한다 기름 침수 렌즈), 높은 품질 목표를 사용 하 여 보기의 필드에.</li>
	<li>노출 매개 변수 (예를 들어, 전원을, 노출 시간 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 각 형광 색 채널에 대 한) 설정 합니다. 형광 이미지를 취득 합니다. 참고: 하나의 형광 라벨을 포함 하는 긍정적인 컨트롤 샘플도 색상 채널 사이 "누화"의 레벨을 사용 해야 합니다. 이미지 고정된 셀 표본에 대 한 형광 전원을 줄일 수 있습니다 (약간 더 긴 노출 시간)와 photobleaching를 최소화 하기 위해.</li>
	<li>이미징 프로토콜 설정 된 후 유지 동일한 노출 매개 변수 연구에서 모든 샘플에 대 한 일관성 있는-이미지 데이터를 정확 하 게 분석 하 고 비교할 수 있도록.</li>
	<li>사후 수집 이미지 처리 및 3 차원 재구성을 수행 합니다. 식별 RNA 물고기 신호 (적색)에 의해 K-Rta 사본, 면역 형광 (녹색), 및 핵 chromatin 라 나 분자 (해당 되는 경우) DAPI (파란색)으로 물. 참고: 있는 K-Rta와 라 나 공동 클러스터는 세포 핵의 지역 따라서 바이러스 성 녹음 방송 공장 및 복잡 한 복제와 관련 된 것으로 믿어진다.</li>
</ol>

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</ol>

이 문서의 저자는 금융 관계 또는 관심사의 경쟁 충돌 있다.

특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.
PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 수 있습니다 경우에 coverslips은 철저 하 게 충분 한 세척 된다, 글리신과 포름알데히드를 냉각 하 고 프로토콜에서 차단 솔루션으로 서 소 혈 청 알 부 민을 사용 하지 않습니다. 파일럿 연구는 RNA 저하 때문에 아마도 약한 RNA 물고기 신호를 보여준 이즈미 야 실험실에서 실시. 1 차 항 체에 대 한 차단, 필요한 경우 RNase 무료 BSA를 사용 하는 것이 좋습니다. 과거의 경험, 그것은 발견 되었다 항 체 특정 경우에, BSA...

그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로1특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간1방법으로 생성 합니다.
그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급2를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ' 점프 '를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵2수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.
생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB) 여전히 존재. 그것은 탠덤 DNA 반복 (핵소체), rRNA (핵소체) 및 coilin (Cajal 몸) 또는 PML 등 구조 단백질 같은 메커니즘의 다양 한 통해 단백질 (PML-NB)는 이러한 구문을 함께3,4,5 . 이러한 구조와 전사 공장 등 다른 교회 역할 뿐만 아니라 필수 구성 요소의 현지 농도 증가 하지만 단백질 및 궁극적으로 만들 그들 내에서 핵 산의 구성 조절 건설 기계는 효율적인 세포 기능6중앙 사이트입니다.
머릿속으로 하는 핵 구조 형태 epigenetics 공부 하는 연구원에 게 풍부한 정보를 제공 언제, 어디. 바이러스학의 관점에서 KSHV, 같은 latently 감염된 바이러스의 재 활성화 크게 변경 핵의 풍경과 전사 세포 유전자에서 주로 바이러스 성 유전자, 궁극적으로 이동 핵 효소의 분포를 완전 한 기능 바이러스 자손7,8생산. KSHV는 바이러스 성 유전자 발현을 촉진 하기 위하여 세포 유전자 식 기계를 어떻게 조작 합니까? 이러한 정보에는 일시적인 세포 유전자 규제 메커니즘에 빛 창 고 수 있습니다.
다른 모든 herpesviruses KSHV는 용균성 복제 및 지연 시간 이라는 두 개의 라이프 사이클. KSHV는 주로 대기 시간 관련 유전자9,10를 제외 하 고는 대부분의 바이러스 성 유전자의 식 입 막 음, 대기 시간 단계에 상주 합니다. KSHV 생산 대기 시간 동안 대기 핵 항 원 (라 나), constitutively 바이러스 성 게놈을 결속 하 고 인간 염색체11에 바이러스 chromatin tethers 관련. 바이러스 성 게놈과 라 나의 친밀 한 관계 때문에 IFA와 DAPI를 사용 하 여 얼룩을 바이러스 성 episomes 호스트 chromatin 관계 했다 찾을 수 있다.
공부 하 고 단일 episome 수준과 감염 된 세포에 바이러스 성 다른 episomes와 협회에 KSHV 재 활성화, 적극적으로 베 끼 기 바이러스 chromatin에 제자리에 찾을 전략 설립 되었습니다. 따라서, 라 나 및 RNAPII IFA intron RNA-물고기와 결합 했다, KSHV K Rta는 주요 바이러스 성 단백질의 intron 지역 (정확한 프로브 시퀀스 이즈미 야 연구소의 최신 간행물8에서 찾을 수 있습니다)에 바인딩되는 RNA-물고기 프로브를 생성 하 여 필수 고 KSHV 다시 활성화-그것은 식별 가능한 충분 한 전사 찍고 실제로 어디 장소8,11,12,,1314,15 . 이 intron RNA-물고기 기술 연구원을 어디 mRNA 접합 이며 세포질16,17수출 직전 변하게 되는 시각화 수 있습니다.
KSHV phorbol 에스테 르 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) 등을 포함 한 다양 한 화학적 자극에 의해 활성화 될 수 있습니다 및 또한 KSHV 낙 산 염 나트륨 같은 히스톤 deacetylase 억제 물의 overexpression에 의해 활성화 유도 될 수 있다 바이러스 성 녹음 방송 인수, K-Rta19입니다. 연구원은 성공적으로 다시 활성화18유도 전에 셀의 사이클을 동기화 하 여 KSHV 재 활성화의 효율성 증가. 따라서, 이러한 특정 연구에 대 한 셀 더블 티 미 딘 블록 (아래에 설명 된 프로토콜)를 사용 하 여 및 짧은 시간에 대 한 TPA와 아목시실린과 (Dox) 알을 품을 동기화 했다. Doxycyline는 이러한 실험에 활용 셀 라인 doxycycline 유도할 수 있는 K-Rta 카세트 cDNA에서 복제 했다 하 고 K-Rta의 intron 지역에 포함 되지 않습니다 때문에 사용 되었다. 다시 활성화할 수 있지만 K-Rta 식 유도 KSHV 사용 하 여, 그것은 입증 된 다른 연구자는 다양 한 다른 생 화 확 적인 요인으로 인해 K-Rta 식 혼자 판명 미약한 재 자극20. 이들의 모두를 결합 하 여, 시간의 짧은 기간에 마약 외피를 제한 하 여 강력한 하지만 지나치게 인공 KSHV 재 이미징 달성 되었다.
라 나, RNAPII, 라벨링 후 K-Rta introns 그리고 DNA로이 문서에 설명 된, 3D 형광 이미징 widefield deconvolution 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 이미징 소프트웨어와 처리 후 활성 바이러스 episomes의 공간적 분포는 제대로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 활성 chromatin 허브 및 다른 핵 구조 형성의 근본적인 성격에 관한 중앙 질문 공부 될 수 있다. 동일한 규제 요소를 처리 하는 단일 셀에 있는 동일한 바이러스 episomes spatiotemporal 유전자 규제 메커니즘의 이해를 깊게 하는 독특한 연구 도구를 나타낼 수 있습니다.
이미징 여러 세포 표본을 다른 시간 지점에서 고정 본질적으로 동적 분자 과정의 특성의 한계는 형광 분포에서 미묘한 또는 소규모 변화 감지 되지 않습니다 또는 하 찮은 것으로 간주. 희소 한 경우에 모든 세포 관찰 같은 미묘한 변화를 표시 하지 않는 한 이것은 사실 이다. 따라서, 활성 바이러스 성 전사 및 다른 핵 구조의 전체 spatiotemporal 관계 비판적으로 계산 해야 고정 된 이미지를 사용 하 여 합니다. 이러한 기술적 과제를 해결 하기 위해 가장 좋은 방법은 이미지 라이브 세포 바이러스 episomes을 표시 하 고 시간이 지남에 주요 세포질 효소의 위치에 따라입니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 매체 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>37°C로 가열해야 합니다. C</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>펜 스트렙 글루타민 (100x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>티미딘&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s 인산염 완충 용액</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>시그마 알드리치</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>소듐 부티레이트&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 솔루션&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>부식성, 독성, 건강 위험</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>급성 독성&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>가연성, 독성</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Advanced Biotechnologies</td>에 대한 가연성, 독성, 건강 위험 쥐 단클론 항체 <td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II 항체 클론 CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleic acid, baker에서 전송' s 효모 (S. cerevisiae)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>식염수 시트르산 나트륨 버퍼 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15557044</tr><tr><td>포름아미드&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% 용액</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold antifade 시약</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D 이미징 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

기능 이미징 3d 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.

BCBL-1 셀 사용 되 고 라 나와 K-Rta RNA (그림 1) 스테인드 했다 약간 요약된 프로토콜 수행 되었다. 이 실험 검사 바이러스 episomes 적극적으로 베 끼고는 및 셀의 인구에 KSHV 재 자극에 응답의이를 수 있습니다. 그림 1에서 화살표로 표시 된 셀에 밀접 하 게 일치 (로 표시 라 나) 바이러스 episomes의 분포 지역에 고유 K Rta 형광 KSHV 게놈 가까이 일어나 활성 전사에 대 한 증거입니다. 동일한 샘플에서는 그림 1 에서 화살촉에 의해 의미 하는 것과 같은 셀 관찰할 수 있습니다, 많은 약한 및 확산 K Rta 형광 크게 중복 되지 않는 그 라 나로 전시 하는. 이것은 일반적인 찾는 내 세포의 인구는 다시 활성화 자극에 응답의 정도에 상당한 변화 보여줍니다.
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바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

초기 RNA-FISH를 바이러스 잠재 단백질의 아미노 염색과 결합하는 전반적인 목표는 바이러스 전사 공장 형성과 결합된 활성 전사를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 유전학, 세포 생물학, 바이러스학 및 세포 생물학 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유도 가능한 바이러스 미니 염색체 모델을 활용하여 게놈 구조 변화의 이면에 있는 분자 세부 사항을 연구한다는 것입니다.1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다. 200V 중력에서 2분 동안 셀을 원심분리합니다. 1ml의 멸균 DEPC PBS로 세포를 세 번 세척합니다.다음으로, 1.2ml의 DEPC PBS에 셀을 다시 현탁시킵니다. 덮개 슬립을 6웰 플레이트의 바닥에 놓습니다. 피펫 200 마이크로 리터의 셀 DEPC PBS 혼합물을 각 커버 슬립에 넣습니다.세포가 2분 동안 정착한 후 과도한 DEPC PBS를 흡인하여 얇은 세포층만 남깁니다. 각 커버 슬립에 1ml의 고정 용액을 조심스럽게 추가하십시오. 10분 동안 세포가 고정되도록 합니다.DEPC PBS로 커버 슬립을 세 번 세척합니다. 세척 후 각 커버 슬립에 100밀리몰의 글리신 최종 농도에 1밀리리터의 글리신 DEPC PBS를 조심스럽게 추가합니다. 세포가 5분 동안 담금질되도록 합니다.DEPC PBS 1.5ml를 넣고 셰이커에 5분 동안 놓고 손에 들고 1분 동안 단단하지만 부드럽게 흔듭니다. 과도한 DEPC PBS를 흡인하고 세포를 파괴하지 않도록 주의하십시오. 각 커버 슬립에 1ml의 투과 용액을 조심스럽게 첨가하십시오.세포가 15분 동안 투과화되도록 합니다. DEPC PBS 1.5밀리리터를 추가합니다. 세포를 셰이커에 5분 동안 놓고 1분 동안 손에 들고 단단하지만 부드럽게 흔듭니다.과도한 DEPC PBS를 흡인하고 세포를 파괴하지 않도록 주의하십시오. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 종이 타월을 적신 다음 밀봉 가능한 플라스틱 용기 바닥에 타월을 깔아줍니다. 다음으로, 1차 항체 용액을 준비하고 존재하는 각 커버 슬립에 대한 레시피를 곱합니다.30마이크로리터의 1차 항체 용액을 라벨이 부착된 각 현미경 슬라이드에 놓습니다. 커버 슬립의 모서리를 잡고 부드럽게 튕겨 1차 항체 농도가 올바른지 확인합니다. 또한 조직의 모서리를 사용하여 과도한 수분을 흡수할 수 있습니다.그런 다음 라벨이 부착된 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 놓고 기포가 생

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

출처: Bratton, B. P. 외, 『박테리아 세포의 3차원 영상 정밀 세포 표현과 단백질 위치 파악』. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 박테리아 세포의 3차원 형광 이미지를 획득하고 분석하여 단일 세포 수준에서 단백질 조직을 연구하는 방법을 시연합니다.

형광 영상을 통한 3차원 박테리아 단백질 분포 시각화

2. 핵 염색: 면역염색 후 핵을 대조 염색한다. PBST를 따라내고 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 또는 선택한 핵 염색제를 실온에서 1분 동안 처리한다. 슬라이드를 PBS로 실온에서 흔들어주며 10분 동안 2회 세척한다. Shah, R., 등바이러스 핵산 및 단백질 시각화와 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염 모니터링을 위한 단일 세포 다중 형광 이미징. J. Vis. Exp. (2020)이 영상에서는 분지형 DNA 하이브리다이제이션과 면역형광법을 사용하여 감염된 인간 림프구 내의 HIV-1 DNA, RNA 및 캡시드 단백질을 동시에 시각화함으로써, 개별 세포 내에서 바이러스 복제 단계에 대한 상세한 분석이 가능함을 보여줍니다.

감염된 인간 림프구 내 바이러스 핵산 및 단백질의 다중 형광 이미징

출처: Kalveram, B. et al. 클릭 화학을 이용한 바이러스 감염이 숙주 세포 RNA 합성에 미치는 영향 측정. J. Vis. Exp. (2013)본 영상에서는 클릭 화학(click chemistry)과 형광 현미경을 사용하여 포유류 세포 내 신생 RNA 전사를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 감염된 세포와 대조군 세포 간의 형광 신호를 비교함으로써, 바이러스 감염이 어떻게 숙주 전사를 억제하는지를 강조하여 설명합니다.

바이러스 감염 세포의 전사 억제 시각화

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

ICP0는 HSV-1 감염 중 핵-세포질 전을 겪 습. 이 이벤트의 분자 메커니즘은 알 수 없습니다. 여기는 HSV-1 감염, 양적 분석 ICP0 전 미래 기계 론 적인 연구에 대 한 기초를 낳는 ICP0 운동 척도를 도구로 confocal 현미경의 사용에 설명 합니다.

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

이 프로토콜은 단일 분자 감도를 가진 DNA 이중 가닥 브레이크에서 전사를 검출하기 위하여 새로운 기자 유전자 시스템 및 실험적인 설치를 제시합니다.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

학습하세요 바이러스 전사 공장에서 활성 전사를 시각화하는 nascent RNA-FISH와 아미노 염색 결합 기법을 사용하는 방법을. 유도형 바이러스 미니염색체 모델을 활용하여 바이러스 재활성화 과정의 게놈 구조 변화를 연구할 수 있습니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

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