Name: 조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 제브라피시 태아의 조혈 줄기세포와 전구세포를 정량화하는 생체 외 메틸셀룰로스 배양법. 이 방법은 혈액 발생 메커니즘 연구와 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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건강의 국가 학회에 의해 제공 된 자금 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S.에), 생명 공학에서 연구 및 교육을 위한 캘리포니아 주립 대학 프로그램 (CSUPERB: D.L.S. 척추 조 혈 틈새의 분자 제어) 캘리포니아 주립 대학 치 코 (A.C.B.) 하에서 대학원 사무실에서.

캘리포니아 주립 대학, 치 코, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문 위원회는 모든 방법을 아래에 설명 된 승인.
1. 블리치 48 hpf Zebrafish 태아
<ol><li>와 함께 15 cm (w) x 15 c m (l) x 7 cm (h) 플라스틱 용기 3 세척 스테이션 만들기: 1) 1000 mL 배아 매체 (E3, 표 1참조) 표 백제 5%의 1 mL, 2)와 함께 살 균 E3와 함께 3) 살 균 E3. 각 컨테이너에 배아 잠수함 솔루션의 500 mL 있는지 확인 하십시오. 참고: 테스트 각 조건에 대해 적어도 10 배아 필요할 것 이다. 이 세척 절차는 최대 200 배아를 수용할 수 있습니다.</li>
	<li>전송 피 펫과 배아 차 여과기에 놓고 5 분 (내부 배아)와 차 여과기를 제거 하 고 세척 역 5 분;에 대 한 # 2에 대 한 세척 역 # 1에에서 계란을 잠수함 마지막 5 분 동안 세척 역 # 3를 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 세척 후 깨끗 한 10 cm 배양 접시에 거꾸로 그것을 선회 하 고 부드럽게 배아를 rinsing 하 여 차 여과기에서 린스 배아에서 살 균 e 3와 차 여과기 및 전송 피 펫.</li>
</ol>2. Dechorionate 배아
<ol><li>전송 피 펫와 함께 제거와 페 트리 접시에서 가능한 많은 e 3를 삭제 하 고 추가 dechorionation 프로 테아 제 (10mg/mL)의 500 μ 배아. 5 분 부드럽게 누릅니다 완전히 제거 하는 chorions를 페 트리 접시의 측면에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫으로 메 마른 E3 효소 희석의 20 mL를 추가 합니다. 정착, 배아를 허용 하 고 전송 피 펫으로 E3를 제거 합니다. 3 번 dechorionation 효소의 모든 흔적을 제거 하려면이 세 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>3. 배아 샘플 준비
<ol><li>P1000 피 펫을 사용 하 여 단일 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 10 배아를 놓습니다.</li>
	<li>피 펫과 e 3를 제거 하 고 삭제. 주의: 플라스틱 주의 배아 수 쉽게 전치 하 고 다음 세척 단계 삭제.</li>
</ol>4. 배아를 분리에 대 한 준비
<ol><li>층 류 두건에 샘플을 전송 하 고 1 mL을 추가 하 여 태아를 씻어 살 균 E3. 배아 튜브의 하단에 정착 하 고 상쾌한 P1000 피 펫과 제거를 허용 합니다. 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 세척 후 e 3를 제거 하 고 삭제 합니다. E3 점액 코팅 (및 포자, 효 모, 또는 박테리아에 갇혀 있을 수 있습니다) 배아 zebrafish를 둘러싼 제거 하에 10 m m dithiothreitol (DTT)의 1 mL를 추가 합니다. Microcentrifuge 튜브 가로로 층 류 두건은 25 분에 실 온에서 품 어.</li>
</ol>5. 배아 분리
<ol><li>샘플 3 번 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 살 균 DPBS의 1 mL로 씻는 다. 마지막 세척 후 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 DPBS의 500 μ를 추가 하 고 추가 5 mg/mL (26 U/mL) 분리 효소의 5 μ. 주의:이 효소 필요 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 그래서는 DPBS 이러한 이온을 포함 하는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>층 류 두건에서 60 분 장소 샘플에 대 한 180 rpm에서 수평 궤도 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어와 샘플은 완전히 해리까지 한 P1000와 배아를 triturate. 주의: 주기적으로 그들은 해리 될 때 결정 하는 배아를 확인 합니다. 배아 솔루션 있어야 어느 정도의 조직. 그것은 완전히 동질적인 해서는 안됩니다. 수-다이제스트 ( 보충 그림 1참조) HSPCs 파괴 됩니다.</li>
</ol>6입니다. 천연된 배아의 준비
<ol><li>5 mL 폴리스 티 렌의 최고 저수지에 피 펫 10 해리 배아 라운드 35 μ m 셀 스 트레이너 캡 하단 튜브.</li>
	<li>피 펫와 린스 (Ca2 + 나 가진 Mg2 +) 살 균 PBS와 전송 솔루션 5 mL를 포함 하는 폴리스 티 렌 관을 배양 튜브 단계 6.1에서에서 셀 필터링. 액체의 4 mL 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 존재 하는 때까지 반복 합니다. 참고: PBS, DPBS, 또는 다른 isotonic 버퍼 솔루션 사용할 수 있습니다이 단계에서 그들은 포함 되지 않은 Ca2 + 또는 Mg2 + 로
</li>
	<li>4 ° C와 5 분 무 균된 셀 샘플을 펠 렛 300g x 튜브 원심 피 펫, 제거와 상쾌한 라운드 하단 튜브에서 삭제. 튜브의 하단에 수송과 세포를 방해 하지 않는 주의 하십시오. PBS의 100 μ 셀 resuspend</li>
</ol>7입니다. 스 준비
<ol><li>완전 한 스 (표 1) 재고 솔루션 x 1을 생성 하 고 메 마른 라운드-하단 14 mL 튜브 3 mL 주사기와 바늘 16 G 2.5 mL을 추가. 한 튜브를 사용 하 여 테스트 하는 각 조건에 대 한.</li>
	<li>
Cytokines, 작은 분자, 또는 다른 에이전트 각 샘플에 조사를 추가 합니다.
	<ol>
<li>골수성 차별화에 대 한 1% 잉어 혈 청 및 0.3 mg/mL 재조합 zebrafish granulocyte 콜로 니 자극 인자 (Gcsf)34 스 매체를 추가 합니다. 참조 Svoboda 외. 37 잉어 혈 청 및 재조합 cytokines 생성 하는 방법에 전체 설명</li>
		<li>Erythroid 차별 화를 위한 스 보통 1% 잉어 혈 청 및 0.1 mg/mL 재조합 zebrafish erythropoietin (Epo)38 을 추가 합니다.</li>
		<li>Multilineage 창시자 검사, Epo, Gcsf를 추가 합니다. 주의: Cytokines 및 첨가제 해야 하지 총 총 볼륨의 10% 이상으로 매체 개별 식민지 분별 충분히 점성 되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8입니다. 스 천연된 배아의 추가
<ol><li>피 펫을 사용 하 여, 재조합 cytokines와 잉어 혈 청을 준비 스의 표면에 해리 10 태아의 100 μ를 추가 합니다. 캡 뚜껑 하 고 완벽 하 게 균질 샘플을 부드럽게 소용돌이. 각 튜브는 이제 10 배아의 천연된 조직이 있어야 합니다.</li>
	<li>3 mL 주사기와 바늘 16 G, 2 별도 35 mm 페 트리 접시에 샘플의 aliquot 1 mL을 사용 하 여. 샘플 페 트리 접시에 걸쳐 완전히 분산 된 다는 것을 확인 하십시오. 각 샘플에 대해 반복 합니다.</li>
	<li>15 cm 배양 접시에 스에 셀 35 m m 접시를 놓습니다. 각 15 cm 접시 한 35mm 페 트리 접시를 샘플 축이다 살 균 물 5 mL를 추가 합니다. 7-10 일 동안 32 ° C, 5% CO2 에서 품 어.</li>
</ol>9. HSPC 파생 된 콜로 니 형성 단위 (CFUs)의 시각화
<ol><li>7 일 잠복기 후 시각화 및 열거형에 대 한 40-100 X에는 거꾸로 한 현미경에 샘플을 배치 합니다. 이 시점에서 개별 식민지 절연 한 피 펫을 하 고 얼룩 및 유전자 분석 대상이 될 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Zebrafish 모델 시스템은 원시적이 고 확실 한 척추 조 공부, 효과적, 효율적이 고 저렴 한 모델이 되었다. 빠르고, 저렴 한, 그리고 몇 가지 기술적인 어려움을 제시 하는 분석 실험의 세대는 작은 분자를 테스트, 돌연변이 배아를 분석 하 고 분자 경로 HSPC 생물학에 대 한 중요 한 elucidating 활용할 수 있습니다. 생체 외에서 도금 HSPCs의 성인 제 브라에서 mutagenesis, cytokines, 그리고 조 혈 결함을 공부 하는 효과적인 방법입니다. 이 프로토콜은 그 연구를 구축 하지만 배아 zebrafish를 활용 하 여. 배아 zebrafish에 이러한 분석을 적용 빠른 데이터 수집, 적은 물리적 공간, (마약), 스크린에 대 한 더 적은 약물의 사용의 사용과 테스트 mRNA overexpression 또는 특정 유전 통로의 morpholino (MO) 최저 허용 합니다. 중요 한 것은, 그것은 또한 조만 초기 척추 개발 하는 동안 발생 하는 단계의 연구 수 있습니다.
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조는 다양 한 생명체의 생존에 필요한 성숙한 혈액 세포를 만드는 과정입니다. 성숙한 혈액을 구성 하는 발달 제한 된 세포 유형의 다양 한으로 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 분화에 관련 된 주요 발달 과정 이다. 이러한 HSCs 시스템은 결코 소진 하 고 그들은 죽을 때까지 초기 배아 개발에서 유지 해야 갱신 자가 해야 합니다. 척추 동물, 지속적인 차별화 및 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)의 확산 하는 데 필요한 포스트 mitotic 혈액 세포의 대부분을 보충 적절 하 게 매일 재활용 되 고. HSCs 제한 조상 세포;의 하위 집합에 첫 번째 차별화 하 여 성숙한 혈액 세포 생성 일반적인 림프 창시자 (CLPs)1, 결국 T, B, NK 세포를 생산, 그리고 granulocytes, 적혈구, macrophages, 및 없으며 생성 하는 일반적인 골수성 창시자 (CMPs)2 . 이러한 창시자 특정 세포 계보를 생성 하는 최선을 다하고 있습니다 및 추가 골수성 erythroid 창시자 (Mep) 적혈구와 혈소판, 또는 granulocyte 생성 하는 등 더 발달 제한 조상 세포로 분화 대 식 세포 창시자 (GMPs) basophils, 호 산 구는 고 대 식 세포, 호 중구,2를 생성 하는. 식별 하 고 이러한 창시자 분리 중요 한 분자 경로 식별 조 혈 분화에 관련 된 있으며이 조상 세포를 제대로 하지 못할 때 발생 하는 백혈병 등 많은 조 혈 질환 차별화.
지난 몇 년간 zebrafish (Danio rerio) 모델 시스템 배아 및 성인 조 혈 연구에 대 한 주요 연구 도구 되고있다. Zebrafish 순종 유전자 분석 하 고 비슷한 맥 관 구조와 인 간에 게 조 혈 시스템 phylogenetically 낮은 척추 모델 종. Zebrafish 태아 전 utero, 개발 하 고 48 시간 게시물 내 수정 (hpf) 생성 HSPCs3,,45,6,,78. Zebrafish는 또한 높은 다 산, 여 성과 단일 클러치에 100 달걀에 누워 큰 샘플 크기와 실험적인 복제 허용. Zebrafish 태아는 광학 투명, 조 혈 시스템의 미세한 시각화에 대 한 허용 합니다. HSCs runx1같은 표시 zebrafish의 여러 형광 유전자 변형 라인: EGFP 물고기9, cd41: EGFP 물고기10및 kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 더블 양성 동물, HSC 출현과 확장 vivo에서3,4,7,8,의 라이브, 실시간 시각화를 위한 허용 9. Zebrafish의 빠른 생성 시간 및 개발 utero 전 을 주도하 고 있다 mutagenesis 연구11,12,13,,1415 에 약물의 사용 16,17,18,,1920 인간의 혈액 질환에 대 한 치료 약속을 잡고 화합물에 대 한 검사. 전반적으로, 조 혈 시스템, 존재의 유전자 변형, 선과 빠른 재생 시간을 쉽게 개발의 보존이 했다는 제 브라는 저렴, 신속 하 고, 유연 하 고 이상적인 조 혈 연구에 대 한 모델을.
포유류 조 혈 시스템에서 분리 하 고 테스트 HSCs의 수많은 방법이 개발 되었습니다. 수사 경과 염료25,26에 HSCs의 능력을 악용 뿐만 아니라 마크 HSCs21,22,,2324, 세포 표면 수용 체의 결합을 이용할 수 있다. 후에 그들은 분류는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 그들의 물리적 분리 수 있습니다. 셀은 HSC 임을 증명 해 내 생 HSPCs, 상 상속 HSCs, 이식 장기, 다중 계보 재구성 모든 혈액 세포 유형 성숙 관찰 하 고 파괴 하는 호스트 동물 필요 합니다. 조 혈 모 세포 및 면역 이식에 대 한 일치를 촉진 하는 타고 난된 마우스 긴장에 대하여 수많은 세포 표면 항 체는이 분석 실험 쥐에서 잘 작동 합니다. 그러나, 몇 가지 zebrafish 조 혈 모 세포 표면 항 체 생성 된27, 식별 및 격리 HSCs의 방해 되었습니다. Zebrafish HSCs를 분리 하 고 하는 가장 일반적인 방법은 유전자 변형 동물, 그것에 의하여 셀 특정 발기인 순서 운전 형광 단백질의 표정은. 연구 시각 있고이 기술을3,4,,89를 이용 하 여 현미경으로 등 쪽 대동맥의 복 부 벽에 HSCs를 열거. 다른 실험실 zebrafish28,29 의 클론 변종 생성 하 고 일치 하는 MHC 동물30성공적인 이주를 수행 했습니다. 그러나, 이러한 기술은 비용 많은 실험실에 금지, 기술적으로 어려운 이며 시간이 소요. 이러한 문제를 해결 하기 위해 실험실 여러 생체 외에서 분석 실험을 존재, 확산 속도, 그리고 HSPCs31,,3233의 분화 능력에 대 한 테스트 생성 34,,3536. 이 분석 실험 쇼 확산 및 HSPCs 시험관에31,32,33,,3435,36의 구조의 차별화 조 혈 결함36, 그리고 발견 하 고 cytokines33,,3435테스트는 효율적인 방법. 그들은 또한 유전자 HSPC 생물학31,32에 대 한 책임을 식별 하기 위해 활용 되었습니다. 이 연구에서 우리 걸릴이 분석 한 단계 더 나아가, 발전 zebrafish 태아에 있는 HSPCs의 정량 수 있도록. 이 분석 실험 또한 돌연변이 동물에 HSPCs의 수를 quantitate에 이용 될 수 있다 고 동물 조 혈 파괴 약물 치료. 본질적으로,이 분석 실험은 빠르고, 현재 몇 가지 기술 과제, 되며 quantitate HSPC 숫자, 그들의 확산을 시험 하 고 차별화에 블록을 조사 하는 저렴 한 방법.

<table><tbody><tr><td>Iscove의 MDM StemCell Technologies에 함유된 소 혈청 알부민 10%</td><td>&nbsp;</td><td>9300</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM 500 mL</td><td>코닝 셀그로우</td><td>10-017-CV&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Ham's F12 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 100 mL (1 M)</td><td>Gibco life technologies</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(5000 U/mL 및 5000 mg/mL) with L-글루타민(200 mM)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이트 10 mL (50 mg/mL)</td><td>코닝 Mediatech</td><td>30-005-CR</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL MCF 튜브</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>3mL 23gx1 주사 바늘(Luer Lock 포함</td>) <td>BD Safety Glide</td><td>305905</td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>Corning Falcon</td><td></td> 352235 <td></td></tr><tr><td>Methocel MC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64630</td><td></td></tr><tr><td>14mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>코닝 팔콘</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>10mm 폴리스티렌 easygrip 페트리 접시</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Librease TM</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>해리 프로테아제</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>dechorionation 프로테아제</td></tr><tr><td>15cm 페트리 접시</td><td>Corning Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>AB</td><td>제브라피쉬 국제자원센터(ZIRC)</td><td>ZL1</td><td>제브라피쉬 균주 사용</td></tr><tr><td>디티올트레이톨(DTT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>646563</td><td></td></tr></tbody></table>

조 혈 줄기와 뿌리를 quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (hspcs) zebrafish 태아를 개발

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

조는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 성숙한 혈액을 구성 하는 다른 세포 계보의 무리로 분화 하는 필수적인 세포 프로세스입니다. 격리 및 식별이이 HSPCs의 어렵습니다 때문에 정의 된 전 게시물 사실상; 그들은 특정 세포 계보에 그들의 감 별 법 후만 정의할 수 있습니다. 지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 조 연구에 모델 생물 되고있다. Zebrafish 태아 utero 전, 개발 하 고 48 h 후 수정 (hpf)에 의해 확실 한 HSPCs. 분석 HSPC 차별화를 평가 하기 위해 생성 된 이식 활용 확산 기능 개발 된 이후 confocal 현미경 검사 법으로 특수 유전자 변형 라인 시각화 뿐만 아니라 조 혈 시스템의 재구성. 그러나, 이러한 분석 비용 금지, 기술적으로, 어렵고 많은 실험실에 대 한 시간이 소모 되는. HSPCs를 평가 하기 위해 생체 외에서 모델의 개발 비용 효과적이 고, 빨리, 그리고 이전에 비해 적은 어려움 설명 방법, 신속 하 게 HSPC 생물학에 영향을 주는 mutagenesis와 약 스크린을 평가 하기 위해 실험실을 수 있도록. 이 소설 체 외에서 분석 결과 HSPCs를 평가 하는 도금 해리 전체 zebrafish 태아 및 HSPC 차별화 및 확산 촉진 추가 외 인 요인에 의해 수행 됩니다. 배아는 단일 세포로 해리 하 고 단일 조상 세포에서 발생 하는 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 생성 하는 그들을 원인이 HSPC 지원 식민지 자극 요인으로 도금. 이 분석 실험 분자 통로의 더 주의 깊은 검사 HSPC 확산, 차별화, 및 그것의 dysregulation 척추 조의 토대를 이해 하는 연구자 수 있도록 규칙에 대 한 책임을 허용 해야 동안에 질병.

배아 zebrafish에 HSPC 숫자를 평가 하기 위해 48 hpf 배아 소화, exogenous 지원 조 혈 성장 인자, 스에 도금 되었고 7 일 (그림 1A)에 대 한 인 큐베이 팅. 7 일 후, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 열거 (그림 1B)과 이미지 (그림 1C) 했다. 제어 함으로써 추가 다른 cytokines, 한 식민지 생산의 종류를 제어할 수 있습니다: Epo erythroid 차별 화를 위한 필요는 및 Gcsf는 골수성 차별화 필요. 혈 청 잉어는 태아 둔감 한 혈 청의 사용 포유류 조직 문화; 그것은 일반적인 성장 요인의 소스입니다. 그림 1, E...

여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

이 분석의 전반적인 목표는 발달 중인 제브라피시 배아에서 조혈전구세포의 분화를 열거하고 조사하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 제브라피시 배아에 실제로 얼마나 많은 줄기 세포와 전구 세포가 있는지와 같은 조혈 분야에서 매우 중요한 몇 가지 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 빠르고, 상대적으로 저렴하며, 수행하기 쉽다는 것입니다.이 방법은 발달 중인 제브라피시에 존재하는 전구 세포의 수에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 연구자들은 약물 또는 유전적 돌연변이가 혈액 전구 세포 형성에 미치는 기능적 영향을 측정할 수도 있습니다. 우리는 이 방법에 대한 아이디어를 가지고 있었는데, 우리가 혈액 발달에 중요하다고 가정한 유전자를 무너뜨리고 있을 때였습니다. 우리는 이 분석을 통해 정상적으로 발달하는 배아와 형태체인 배아 간의 차이를 측정할 수 있을 것으로 예측했습니다.제브라피시 배아를 표백하려면 플라스틱 용기를 사용하여 3개의 세척 스테이션을 만들며, 그 중 하나는 E3 1리터당 1밀리리터의 5% 표백제가 들어 있고 2개는 멸균 E3가 들어 있습니다. 전사 피펫을 사용하여 배아를 차 여과기에 넣고 1번 세척 스테이션에 5분 동안 담급니다. 그런 다음 배아가 있는 차 여과기를 5분 동안 2번 세척 스테이션으로 옮깁니다. 마지막 5분 동안 3번 세척 스테이션에 대해 반복합니다.마지막 세척 후 깨끗한 10cm 페트리 접시 위에 거꾸로 뒤집어 차 여과기에서 배아를 제거하고 전사 피펫과 멸균 E3를 사용하여 여과기에서 배아를 부드럽게 헹굽니다. 배아를 제거하려면, 전사 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 가능한 한 많은 E3를 제거하고 폐기하십시오. 그런 다음 500마이크로리터의 디코리오네이션 프로데아를 배아에 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 페트리 접시의 측면을 부드럽게 두드려 융모를 완전히 제거합니다. 그런 다음 혈청학 피펫으로 20ml의 멸균 E3를 첨가하여 프로데아를 희석합니다. 배아가 정착하도록 하고 피펫을 사용하여 E3를 제거합니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하여 디코리온 프로데아의 모든 흔적을 제거합니다.배아 샘플을 준비하려면 피펫을 사용하여 10개의 배아를 하나의 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 E3를 조심스럽게 피펫으로 꺼내 버립니다. 샘플을 층류 후드로 옮기고 1ml의 멸균 E3를 첨가하여 배아를 세척하여 배아가 튜브 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 총 세 번 씻는 동안 반복합니다. 마지막 세척 후 E3를 제거하고 폐기합니다.그런 다음 E3에 10밀리몰 DTT 1ml를 첨가하여 점액 코팅과 배아 주변에 갇혀 있을 수 있는 포자, 효모 또는 박테리아를 제거합니다. 이제 마이크로 원심분리기 튜브를 수평으로 놓고 실온에서 25분 동안 배양합니다. 배아를 해리하려면 1ml의 멸균 DPBS를 사용하여 샘플을 세 번 세척합니다.마지막 세척 후 칼슘과 마그네슘이 함유된 DPBS 500마이크로리터와 밀리리터당 5밀리그램의 해리 프로데아 5마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도의 수평 오비탈 셰이커에서 180rpm으로 60분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 샘플과 층류 후드를 놓고 P1000을 사용하여 샘플이 완전히 해리될 때까지 배아를 분쇄합니다.주의를 기울이고 배아가 언제 해리되는지 확인하기 위해 주기적으로 배아를 확인하십시오. 당신은 약간의 조직이 존재하기를 원합니다. 배아를 과도하게 소화시켜 전구 세포를 파괴할 수 있습니다.10개의 해리된 배아를 35마이크로미터 세포 여과기 캡이 있는 5밀리리터 폴리 스티렌 원형 바닥 튜브의 상단 저장소에 피펫팅합니다. 피펫과 멸균 PBS를 사용하여 배아 튜브를 헹구고 용액을 여과된 세포가 들어 있는 5mL 폴리 스티렌 튜브로 옮깁니다. 튜브에 4ml의 액체가 나타날 때까지 헹굼을 반복합니다.중력의 300배와 섭씨 4도의 온도에서 튜브를 5분 동안 원심분리하여 균질화된 세포 샘플을 팔레트화합니다. 피펫을 사용하여 둥근 바닥 튜브에서 상층액을 제거하고 버리고 바닥에서 펠릿화된 세포를 방해하지 않도록 주의합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 다시 현탁시킵니다.하나의 X 완전한 메틸셀룰로오스 스톡 용액을 준비하고 3밀리리터 주사기와 16개의 게이지 바늘을 사용하여 2.5밀리리터의 멸균 둥근 바닥 14밀리리터 튜브를 추가합니다. 테스트된 각 조건에 대해 하나의 튜브를 사용하십시오. 골수성 분화를 위해 메틸 셀룰로오스 배지에 잉어 혈청 1%와 재조합 제브라피시 과립구 집락 자극 인자(GCSF) 0.3mg을 첨가합니다.적혈구 분화를 위해 메틸 셀룰로오스 배지에 잉어 혈청 1%와 재조합 제브라피시 에리트로포이에틴 또는 EPO 0.1mg을 첨가합니다. 다중 계통 전구 세포를 검사하려면 EPO 및 GCSF를 추가합니다. 피펫을 사용하여 10개의 해리된 배아 100마이크로리터를 잉어 혈청의 재조합 사이토카인과 함께 준비된 메틸 셀룰로오스의 표면에 추가합니다.뚜껑을 덮고 부드럽게 와류를 일으켜 샘플을 완전히 균질화합니다. 이제 각 튜브에는 10개 배아의 해리된 조직이 포함되어야 합니다. 3밀리리터 주사기와 16개의 게이지 바늘을 사용하여 1밀리리터의 샘플을 2개의 35mm 페트리 접시에 분취합니다.샘플이 페트리 접시 전체에 완전히 분산되어 있는지 확인하십시오. 각 샘플에 대해 반복합니다. 세포와 메틸 셀룰로오스가 있는 35mm 페트리 접시를 15cm 페트리 접시에 넣습니다.각 큰 접시에 35mm 접시 하나에 5ml의 멸균수를 넣어 샘플을 가습합니다. 섭씨 32도에서 이산화탄소 5%를 함유한 온도에서 7일에서 10일 동안 접시를 배양합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 군체 형성 단위를 시각화합니다.조혈 지지 인자와 함께 배양한 지 7일 후, 48마리의 HPF 배아 제브라피시의 전구 세포를 세고 이미지화했습니다. 중요한 것은 사용된 CF의 양이 도금된 배아의 수와 직접적인 상관관계가 있다는 것입니다. 실험 시작 시 10개 또는 20개의 배아로 시작하는 것과 관련된 밀리리터당 4개 또는 8개의 배아를 도금하면 각각 약 1200 또는 2400 CFU가 생성됩니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아를 과도하게 소화하면 전구 세포가 파괴될 수 있으므로 배아를 과도하게 소화하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 서로 다른 시점에 존재하는 선조의 수를 비교할 수 있습니다.돌연변이 동물과 야생형 동물을 비교할 수 있을 뿐만 아니라 약물이 혈액 발달에 미치는 영향을 테스트할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 메틸 셀룰로오스 분석을 수행하여 제브라피시 조혈 전구 세포를 계수하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 특정 사이토카인 테스트와 같은 특정 실험 요구 사항에 맞게 이 절차를 변경할 수 있습니다.척추동물의 혈액과 주삿바늘로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 분석을 수행할 때 항상 주의를 기울여야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아 유전자 변형의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템의 개발을보고합니다. 이것은 Fibroblast 성장 팩터 리포터 유전자의 표현에 작은 분자, BCI의 복용 부양 효과를 측정하고 높은 처리량 zebrafish 화학 화면 설립을위한 기술을 제공하는 능력을 보여줍니다.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

제브라피쉬는 고등 척추동물과의 유전적 유사성으로 인해 발생 생물학 및 인간 질병 연구를 위한 강력한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 초기 배발생에 필수적인 유전자의 열성 돌연변이를 식별하기 위한 전방 스크리닝 전략에 활용할 수 있는 반수체 제브라피시 배아를 만드는 방법론을 설명합니다.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 서로 다른 유전적 배경을 가진 기생충 제브라피시 배아를 생성하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 제브라피시 배아의 탁월한 이미징 기능과 결합하면 이 방법은 관심 후보 유전자에 대한 세포 자율 기능과 비세포 자율 기능을 조사할 수 있는 독특하고 강력한 수단을 제공합니다.

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

여기서 제시된 것은 혈관 형성에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포에서 제브라피쉬 및 튜브 형성 분석에서 의 제브라피시 및 튜브 형성 분석에서 전체 마운트에 대한 프로토콜이다.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

이 작품은 적절한 노출 방법에서 배아 처리 및 에탄올 분석에 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피쉬 배아에서 에탄올 수준을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

이 분석법은 배아 제브라피시를 개발하는 데 혈토포이성 세포를 양수화하는 간단한 방법입니다. 해리된 제브라피시로부터의 혈액세포는 혈류 세포측정 분석을 받게 된다. 이것은 돌연변이 동물및 유전 수정 후에 혈액 결점의 검출을 허용합니다.

유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

여기에서 우리는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)의 스페로이드 형성을 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 간 제브라피쉬 세포주의 스페로이드에 대한 3D 배양 방법

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 저비용 광학 현미경 방법을 설명하여 고급 이미징 시스템 없이도 발달 심장 독성을 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

표준 현미경 및 비디오 분석을 사용한 제브라피쉬 배아의 기능적 심장 영상: 환경 및 생물 의학 연구에서의 응용

배우세요 제브라피시 태아의 조혈 줄기세포와 전구세포를 정량화하는 생체 외 메틸셀룰로스 배양법. 이 방법은 혈액 발생 메커니즘 연구와 약물 스크리닝에 활용됩니다.

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

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