조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

이 분석의 전반적인 목표는 발달 중인 제브라피시 배아에서 조혈전구세포의 분화를 열거하고 조사하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 제브라피시 배아에 실제로 얼마나 많은 줄기 세포와 전구 세포가 있는지와 같은 조혈 분야에서 매우 중요한 몇 가지 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 빠르고, 상대적으로 저렴하며, 수행하기 쉽다는 것입니다.

이 방법은 발달 중인 제브라피시에 존재하는 전구 세포의 수에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 연구자들은 약물 또는 유전적 돌연변이가 혈액 전구 세포 형성에 미치는 기능적 영향을 측정할 수도 있습니다. 우리는 이 방법에 대한 아이디어를 가지고 있었는데, 우리가 혈액 발달에 중요하다고 가정한 유전자를 무너뜨리고 있을 때였습니다. 우리는 이 분석을 통해 정상적으로 발달하는 배아와 형태체인 배아 간의 차이를 측정할 수

제브라피시 배아를 표백하려면 플라스틱 용기를 사용하여 3개의 세척 스테이션을 만들며, 그 중 하나는 E3 1리터당 1밀리리터의 5% 표백제가 들어 있고 2개는 멸균 E3가 들어 있습니다. 전사 피펫을 사용하여 배아를 차 여과기에 넣고 1번 세척 스테이션에 5분 동안 담급니다. 그런 다음 배아가 있는 차 여과기를 5분 동안 2번 세척 스테이션으로 옮깁니다. 마지막 5분 동안 3번 세척 스테이션에 대해 반복합니다.

마지막 세척 후 깨끗한 10cm 페트리 접시 위에 거꾸로 뒤집어 차 여과기에서 배아를 제거하고 전사 피펫과 멸균 E3를 사용하여 여과기에서 배아를 부드럽게 헹굽니다. 배아를 제거하려면, 전사 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 가능한 한 많은 E3를 제거하고 폐기하십시오. 그런 다음 500마이크로리터의 디코리오네이션 프로데아를 배아에 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 페트리 접시의 측면을 부드럽게 두드려 융모를 완전히 제거합니다. 그런 다음 혈청학 피펫으로 20ml의 멸균 E3를 첨가하여 프로데아를 희석합니다. 배아가 정착하도록 하고 피펫을 사용하여 E3를 제거합니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하여 디코리온 프로데아의 모든 흔적을 제거합니다.

배아 샘플을 준비하려면 피펫을 사용하여 10개의 배아를 하나의 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 E3를 조심스럽게 피펫으로 꺼내 버립니다. 샘플을 층류 후드로 옮기고 1ml의 멸균 E3를 첨가하여 배아를 세척하여 배아가 튜브 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.

그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 총 세 번 씻는 동안 반복합니다. 마지막 세척 후 E3를 제거하고 폐기합니다.

그런 다음 E3에 10밀리몰 DTT 1ml를 첨가하여 점액 코팅과 배아 주변에 갇혀 있을 수 있는 포자, 효모 또는 박테리아를 제거합니다. 이제 마이크로 원심분리기 튜브를 수평으로 놓고 실온에서 25분 동안 배양합니다. 배아를 해리하려면 1ml의 멸균 DPBS를 사용하여 샘플을 세 번 세척합니다.

마지막 세척 후 칼슘과 마그네슘이 함유된 DPBS 500마이크로리터와 밀리리터당 5밀리그램의 해리 프로데아 5마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도의 수평 오비탈 셰이커에서 180rpm으로 60분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 샘플과 층류 후드를 놓고 P1000을 사용하여 샘플이 완전히 해리될 때까지 배아를 분쇄합니다.

주의를 기울이고 배아가 언제 해리되는지 확인하기 위해 주기적으로 배아를 확인하십시오. 당신은 약간의 조직이 존재하기를 원합니다. 배아를 과도하게 소화시켜 전구 세포를 파괴할 수 있습니다.

10개의 해리된 배아를 35마이크로미터 세포 여과기 캡이 있는 5밀리리터 폴리 스티렌 원형 바닥 튜브의 상단 저장소에 피펫팅합니다. 피펫과 멸균 PBS를 사용하여 배아 튜브를 헹구고 용액을 여과된 세포가 들어 있는 5mL 폴리 스티렌 튜브로 옮깁니다. 튜브에 4ml의 액체가 나타날 때까지 헹굼을 반복합니다.

중력의 300배와 섭씨 4도의 온도에서 튜브를 5분 동안 원심분리하여 균질화된 세포 샘플을 팔레트화합니다. 피펫을 사용하여 둥근 바닥 튜브에서 상층액을 제거하고 버리고 바닥에서 펠릿화된 세포를 방해하지 않도록 주의합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 다시 현탁시킵니다.

하나의 X 완전한 메틸셀룰로오스 스톡 용액을 준비하고 3밀리리터 주사기와 16개의 게이지 바늘을 사용하여 2.5밀리리터의 멸균 둥근 바닥 14밀리리터 튜브를 추가합니다. 테스트된 각 조건에 대해 하나의 튜브를 사용하십시오. 골수성 분화를 위해 메틸 셀룰로오스 배지에 잉어 혈청 1%와 재조합 제브라피시 과립구 집락 자극 인자(GCSF) 0.3mg을 첨가합니다.

적혈구 분화를 위해 메틸 셀룰로오스 배지에 잉어 혈청 1%와 재조합 제브라피시 에리트로포이에틴 또는 EPO 0.1mg을 첨가합니다. 다중 계통 전구 세포를 검사하려면 EPO 및 GCSF를 추가합니다. 피펫을 사용하여 10개의 해리된 배아 100마이크로리터를 잉어 혈청의 재조합 사이토카인과 함께 준비된 메틸 셀룰로오스의 표면에 추가합니다.

뚜껑을 덮고 부드럽게 와류를 일으켜 샘플을 완전히 균질화합니다. 이제 각 튜브에는 10개 배아의 해리된 조직이 포함되어야 합니다. 3밀리리터 주사기와 16개의 게이지 바늘을 사용하여 1밀리리터의 샘플을 2개의 35mm 페트리 접시에 분취합니다.

샘플이 페트리 접시 전체에 완전히 분산되어 있는지 확인하십시오. 각 샘플에 대해 반복합니다. 세포와 메틸 셀룰로오스가 있는 35mm 페트리 접시를 15cm 페트리 접시에 넣습니다.

각 큰 접시에 35mm 접시 하나에 5ml의 멸균수를 넣어 샘플을 가습합니다. 섭씨 32도에서 이산화탄소 5%를 함유한 온도에서 7일에서 10일 동안 접시를 배양합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 군체 형성 단위를 시각화합니다.

조혈 지지 인자와 함께 배양한 지 7일 후, 48마리의 HPF 배아 제브라피시의 전구 세포를 세고 이미지화했습니다. 중요한 것은 사용된 CF의 양이 도금된 배아의 수와 직접적인 상관관계가 있다는 것입니다. 실험 시작 시 10개 또는 20개의 배아로 시작하는 것과 관련된 밀리리터당 4개 또는 8개의 배아를 도금하면 각각 약 1200 또는 2400 CFU가 생성됩니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아를 과도하게 소화하면 전구 세포가 파괴될 수 있으므로 배아를 과도하게 소화하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 서로 다른 시점에 존재하는 선조의 수를 비교할 수 있습니다.

돌연변이 동물과 야생형 동물을 비교할 수 있을 뿐만 아니라 약물이 혈액 발달에 미치는 영향을 테스트할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 메틸 셀룰로오스 분석을 수행하여 제브라피시 조혈 전구 세포를 계수하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 특정 사이토카인 테스트와 같은 특정 실험 요구 사항에 맞게 이 절차를 변경할 수 있습니다.

척추동물의 혈액과 주삿바늘로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 분석을 수행할 때 항상 주의를 기울여야 한다는 점을 잊지 마십시오.