Name: 강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: 학습하세요 표본관 식물 표본에서 DNA를 분리하고 고처리량 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 방법을. 이 기술은 퇴화된 샘플에서도 견고한 DNA 분리를 가능하게 하여 계통유전체학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 테일러 AuBuchon-엘 더, 요르단 Teisher, 및 샘플링 표 본관 표본에 크리스티나 Zudock와 미주리 식물원 표 본관 표본에 파괴적인 샘플링에 대 한 액세스에 대 한 감사합니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457748)에서 교부 금에 의해 지원 이었다.

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<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

여기에 제시 된 프로토콜 DNA 고립과 말린된 식물 견본에서 라이브러리 준비 시퀀싱에 대 한 포괄적이 고 강력한 방법입니다. 방법과 그것을 변경 하는 최소한의 필요가 일관성 기반 견본 품질에 큰 표 본관 기반 시퀀싱 프로젝트에 대 한 확장 가능한 그것. 낮은 수익률 라이브러리에 대 한 선택적 reamplification 단계 포함을 낮은 품질, 낮은 수량, 드문, 또는 시퀀싱에 적합 되지 않을 역사적으로 중요 한 샘플의 포함을 허용 한다.
초기 DNA 수율의 중요성 표 본관 파생 DNA 종종 저하 초기 견본 보존11, dna 견본의 결과로 미만 300 년 오래 된 동물 남아 있는 몇 백 년 된31 의 수천에서 고립 된 DNA로 저하 때문 , 32. 따라서, 초기 DNA 수율의 최적화는 성공적인 시퀀...

표 본관 컬렉션은 종 및 계통학1,2,3, 인구 유전학4,5, 보존을 포함 하 여 연구에 대 한 게놈 다양성의 잠재적으로 귀중 한 소스 생물학6, 침략 적인 종의 생물학7, 그리고 특성 진화8. 다양 한 종, 인구, 지리적 위치, 및 시간 포인트를 얻을 수 있는 식물 표본 상자 "보물 상자"9 를 강조 표시 합니다. 역사적으로, 표 본관 파생 DNA의 저하 자연 PCR 기반 프로젝트, 종종 높은 복사, 엽록체 게놈 또는 ribosomal의 내부 베낀된 스페이서 (ITS)의 지역 등에 마커를 사용 하 여 연구자를 일하고 방해 했다 RNA입니다. 표본 및 DNA의 품질 보존9,10, 더블-좌초 나누기와 손상의 가장 흔한 형태 되 고, 건조 과정에서 사용 되는 열에서 조각화의 방법에 광범위 하 게 따라 다는 소위 90 %DNA 잠금 업 된 PCR 기반 연구11지 장 있다. 조각화, 외 표 본관 유전체학에서 두 번째로 가장 널리 퍼진 문제는 오염, 그13 endophytic 균 류 파생 된 또는 수집 후 하지만 그래도 표 본관12에 장착 하기 전에 곰 팡이 사후 인수 이 문제 해결된 bioinformatically 바로 곰 팡이 데이터베이스 (아래 참조) 제공 될 수 있습니다. 세 번째, 및 보다 적게 일반적인 문제는 비록 표 본관 표본11(~ 0.03%) 낮은 것으로 추정 된다 시 토 신 탈 (C/G→T/A)14, 통해 시퀀스 수정 이다. 높은 처리량 시퀀싱 (HTS)의 출현, 조각의 문제는 짧은 읽기 및 시퀀싱 깊이12,15, 낮은 질을 가진 수많은 표본에서 게놈 수준의 데이터 수집을 허용으로 극복할 수 있습니다. DNA, 그리고 때로는 심지어 전체 게놈 시퀀싱15허용.
식물 표본 상자 견본 더 자주 사용 되 고 있으며 계통 발생 프로젝트16의 큰 구성 요소. HTS에 대 한 식물 표본 상자 견본을 사용 하 여 현재 도전 개인에 대 한 메서드를 최적화 하지 않고도 충분 한 더블 좌초 DNA 시퀀싱 프로토콜에 대 한 필요한 필수 적절 한 시기에 수많은 종에서 얻는 지속적으로 표본입니다. 이 논문에서는, DNA 추출 및 표 본관 표본 라이브러리 준비에 대 한 프로토콜을 기존의 방법의 활용 및 결과 신속 하 고 복제할 수 있도록 그들을 수정 시연입니다. 이 방법은 완전 한 13 h 8 h 실습 시간, 또는 9 h 실습 시간 때 옵션 reamplification 단계는 필요와 함께 16 h 24 샘플 라이브러리에 견본에서 처리 수 있습니다. 더 많은 샘플의 동시 처리는 달성, 비록 제한 요소는 원심 분리기 용량 및 기술. 프로토콜은 DNA를 전단에 대 한만 전형적인 실험실 장비 (thermocycler, 원심 분리기, 마그네틱 스탠드) 대신 분무기 또는 sonicator, 특수 장비를 요구 하도록 설계 되었습니다.
DNA 품질, 조각 크기 및 수량 표 본관 표본 높은 처리량 시퀀싱 실험에서의 사용에 대 한 요인 제한. 식물 표본 상자 DNA를 분리 하 고 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 만들기 위한 다른 방법을 10 만큼 약간을 사용 하 여 유틸리티를 증명 하고있다 ng의 DNA16; 그러나 라이브러리 준비에 필요한 사이클 그들은 실험적으로 PCR의 최적 수를 결정 해야 합니다. 이것은 된다 허무 다루는 상당히 적은 양의 가능한 더블 좌초 DNA (dsDNA) 때 일부 표 본관 표본 단일 라이브러리 준비에 대 한 충분 한 DNA를 생산. 여기에 제시 된 방법 아무 DNA 라이브러리 최적화 단계에서 분실 된다 그래서 샘플 품질에 사이클의 단일 번호를 사용 합니다. 대신, reamplification 단계 라이브러리 시퀀싱에 필요한 최소 금액을 충족 하지 않는 경우 호출 됩니다. 많은 식물 표본 상자 견본 드물다 고 많은 경우에 파괴적인 샘플링을 정당화 하기 어려운 작은 재료를가지고. 이 카운터, 제시 프로토콜 허용 dsDNA 입력 크기 미만 1.25 ng 도서관 준비 과정, 높은 처리량 시퀀싱 및 표본의 파괴적인 샘플링에 대 한 필요를 최소화에 대 한 실행 가능한 샘플의 범위를 확대.
다음 프로토콜 잔디에 최적화 되었고 비록 우리가 기대 하는 다른 많은 식물 그룹에 프로토콜을 적용할 수 있는 식물 표본 상자 견본에서 다른 종의 수백에 테스트. 그것은 낮은 품질 및 희귀 표본 저장 하는 데 사용할 수 있는 선택적 복구 단계를 포함 합니다. 이상 2 백 표 본관 표본 테스트에 따라,이 프로토콜 표본 낮은 조직 입력 및 품질, 최소한의 파괴적인 샘플링을 통해 희귀 한 표본의 보존에 대 한 허용에 작동 합니다. 여기이 프로토콜 phylogenomics 기반 프로젝트에 대 한 시퀀싱 할 수 있는 높은 품질 라이브러리를 제공할 수 있습니다 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 웰&nbsp;</td></tr><tr><td>젤 이미징 시스템</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 시리즈</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>디지털 건조 배스</td><td>벤치마크 과학</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 시스템</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (초순수)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 튜브&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>모르타르</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>도자기</td></tr><tr><td>유봉</td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td><td>도자기</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0.2ml 스트립 튜브 및 PCR용</td><td>캡 VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광계</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>밸런스</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 단기 보관</td><td>Nalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱-링 스탠드&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 웰&nbsp;</td></tr><tr><td>수조</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트 교반기</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>에어 가스</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 X TE 버퍼</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>리보 뉴클레아제 A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml 용액</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free water</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>이소아밀 알코올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 트리하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 디소듐</td><td>솔 IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>초순수</td></tr><tr><td>젤 로딩 염료 퍼플 (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEB넥스트 Q5 핫 스타트 HiFi PCR 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>페놀 용액</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Silica sand</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>재증폭 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>텍스트</td> <td>참조</td></tr><tr><td>시퀀처 v.5.0.1</td><td>유전자 코드</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

강력한 dna 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria는 다양 한 생물 학적 연구에에서 사용할 수 있는 공장 설비 재료의 귀중 한 소스. 표 본관 표본을 사용 하 여 샘플 보존 품질, 성능이 저하 된 DNA 및 희귀 표본의 파괴적인 샘플링을 포함 하 여 과제의 번호와 연결 됩니다. 큰 시퀀싱 프로젝트에서 식물 표본 상자 물자를 더 효과적으로 사용 하려면 DNA 고립과 라이브러리 준비는 신뢰할만 하 고 확장 가능한 방법 필요 합니다. 이 종이 DNA 분리 및 높은 처리량 도서관 건설 표 본관 표본에서 개별 샘플에 대 한 수정 요구 하지 않는 대 한 강력 하 고, 시작-투-엔드 프로토콜을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 기존 방법의 낮은 질 건조 식물 재료와 소요 장점에 대 한 최적화, 조직 분쇄 라이브러리 크기 선택, 수정 하 고 낮은 수율 라이브러리에 대 한 선택적 reamplification 단계를 도입 하 여 지어진 다. 낮은 수익률 DNA 라이브러리의 reamplification 샘플 인지할 시퀀싱 바이어스 공통에 대 한 소개 없이 추가 파괴적인 샘플링에 대 한 필요성을 negating 대신할 및 잠재적으로 귀중 한 식물 표본 상자 견본에서 파생 된 구조 수 있습니다. 계통 발생 응용 프로그램입니다. 프로토콜 잔디 종, 수백에서 테스트 되었습니다 하지만 확인 후 다른 식물 계보에 사용 하기 위해 적응 될 것으로 예상 된다. 이 프로토콜 어디 조각 원하는 크기로 범위에 존재 하지 않는, 매우 저하 DNA와 보조 metabolites 일부 공장 설비 재료에 깨끗 한 DNA 분리를 억제 하는 제한 될 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜 DNA 분리 및 활성 실습 시간 최소한의 수정만 8 h 13 h 24 샘플 라이브러리 준비 수 신속 하 고 포괄적인 방법을 소개 합니다.

DNA 분리 및 최종 라이브러리 수율 본이 연구에서는 표 본관 DNA의 고립과 고품질 시퀀싱 라이브러리의 복구에 대 한 프로토콜의 효능은 50 다른 샘플을 사용 하 여 1920 년에서 가장 오래 된와 2012 (표 2)에서 최 연소 시연 했다. 각 샘플에 대 한 약 10 mg의 잎 조직 DNA 격리 사용 되었다. 가능한 경우, 녹색 잎 조직이 선호 했다 그리고 확실 한 곰 팡이 오염 없는 조직 선정 되었다. 성공적인 격리 만들 수 있습니다 노란색 또는 갈색 조직를 사용 하 여 비록 낮은 수익률을 예상 한다. 이중 총 3.56에서 ranged 초기 격리에서 DNA (dsDNA) 좌초 2610에 ng ng. 예상 했던 대로, 표 본관 표본에서 얻은 DNA 매우 저하 했다 (그림 1A, Supplemental <strong cl...

이 문서에서는 DNA 분리 및 매우 가난한 품질 DNA의 구조를 포함 하 여 식물 표본 상자 물자에서 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축을 위한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 식물 표본 표본에서 분리된 이중 가닥 DNA와 그에 따른 고처리량 염기서열분석 라이브러리의 수량을 증가시켜 계통유전체학 연구에서 유용성을 극대화하는 것입니다. 이 방법은 광범위한 샘플 분해로 인해 게놈 염기서열분석(genomic sequence)으로 프로젝트를 시퀀싱하는 데 유용하지 않은 식물 표본 표본의 잠재력을 실현합니다. 이 기술의 주요 장점은 희귀하고 역사적으로 중요한 식물 표본 표본을 광범위한 파괴 샘플링 없이 사용할 수 있을 만큼 충분히 견고하다는 것입니다.이 기술은 체계적인 간격 프로젝트에서 분류군 표본 추출의 깊이를 확장합니다. 종 획득은 제한적인 단계이지만 이 프로토콜을 사용하면 과거 수집을 이러한 연구에 쉽게 사용할 수 있습니다. 액체 질소와 30-50mg의 멸균 모래를 첨가하여 미리 선택된 식물 표본 조직 1cm를 미리 냉각된 모르타르와 절굿공이에 담긴 미세한 가루로 분쇄합니다.성공적인 DNA 분리를 위해서는 적절한 분쇄가 필수적입니다. 그리고 샘플이 완전히 분쇄되도록 주의해야 합니다. 다음으로, 얼린 분말을 2개의 2밀리리터 튜브에 넣고 튜브 부피의 절반 이상을 채웁니다.그런 다음 각 튜브에 600마이크로리터의 따뜻한 CTAB 용액을 추가합니다. 반전과 볼텍싱으로 분말을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 65도로 유지되는 수조에서 1시간에서 1.5시간 동안 샘플을 배양합니다.그 동안 15분마다 소용돌이가 일어납니다. 다음 10, 실내 온도에 5 분 동안 000 g에 표본을 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 약 500마이크로리터의 상등액을 새로운 라벨이 부착된 튜브 세트로 옮깁니다.상등액에 RNase A의 밀리리터당 10밀리그램 4마이크로리터를 각 곡에 추가합니다. 그런 다음 뒤집거나 피펫팅하여 튜브의 내용물을 혼합합니다. 섭씨 37도로 유지되는 열 블록 또는 수조에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.튜브가 실온에 도달하면 약 500마이크로리터의 25:24:1 페놀, 클로로포름, 이소아밀 알코올 혼합물을 샘플에 추가합니다. 그런 다음 뒤집거나 반복적인 피펫팅으로 튜브의 내용물을 혼합합니다. 다음 12, 실내 온도에 15 분 동안 000 g에 표본을 원심 분리하십시오.약 400마이크로리터인 상부 수성층을 라벨링된 새로운 튜브 세트로 옮깁니다. 각 튜브의 수성층에 약 400마이크로리터의 24:1 클로로포름, 이소아밀 알코올 혼합물을 추가합니다. 반복적인 피펫팅 또는 반전으로 샘플을 철저히 혼합합니다.다음 12, 5 분 동안 000 g에 관을 원심 분리하고 대략 300 마이크로리터의 위 수성 층을 pre-chilled, 레테르를 붙인 관으로 옮깁니다. 다음으로, 300마이크로리터의 미리 냉각된 이소프로판올과 12마이크로리터의 2.5몰 아세트산나트륨을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 30-60분 동안 튜브를 배양합니다.배양 후 냉동실에서 샘플을 꺼냅니다. 다음으로, 실온에서 15분 동안 12, 000g에서 샘플을 원심분리합니다. 원심 분리 후, 약 300-500 마이크로 리터의 70 % 에탄올로 펠릿을 세척하십시오.다시, 12, 000 g에 10 분 동안 관을 원심 분리하십시오. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하십시오. 다음으로, 펠릿을 자연 건조시키고 DNA를 50 마이크로 리터의 1X Tris-EDTA 완충액에 용해시킵니다.0.2ml 중합효소 연쇄 반응 튜브에 1-16마이크로리터의 분리된 DNA와 2마이크로리터의 단편화 반응 완충액을 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물로 최종 부피를 18마이크로리터로 조정합니다. 다음으로, 2마이크로리터의 이중 가닥 DNA 단편화 효소를 추가하고 혼합물을 몇 초 동안 잠시 와류로 회전시킵니다.그런 다음 thermocycler에서 섭씨 37도에서 8.5분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 튜브에 5마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 추가합니다. 25마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 전단된 DNA의 총 부피를 50마이크로리터로 조정합니다.그런 다음 실온에서 유지되는 45마이크로리터의 SPRI 비드를 전단된 DNA 50마이크로리터에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 두 비드를 완전히 혼합합니다. 튜브가 들어있는 샘플을 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 자성판에 튜브를 옮기고 5분 더 기다립니다.상층액을 조심스럽게 배출하십시오. 그런 다음 마그네틱 스탠드의 튜브에 200마이크로리터의 신선한 80% 에탄올을 추가하고 실온에서 30초 더 기다립니다. 30초 후 상층액을 조심스럽게 제거합니다.튜브의 뚜껑을 열어 두고, 마그네틱 스탠드에서 비드를 5분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 마그넷 스탠드에서 튜브를 제거하고 55마이크로리터의 0.1X Tris-EDTA 완충액에 비드의 DNA를 용출합니다. 반복적인 피펫팅으로 DNA를 철저히 혼합합니다.그런 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다시 한 번, 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 약 2분 후에 용액이 제거될 때까지 기다립니다. 52마이크로리터의 상층액을 제거한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 정량 분석을 수행합니다.세척 및 전단된 DNA 50마이크로리터에 3마이크로리터의 엔도뉴클레아제, 인산염 테일링 효소 및 7마이크로리터의 반응 완충액을 추가합니다. DNA와 다른 성분을 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 돌려 거품을 제거합니다.회전 후 샘플을 thermocycler로 옮기고 프로그램을 설정하십시오. 어댑터를 25-50배 희석하여 0.6-0.3마이크로몰의 작업 농도를 얻습니다. 고처리량 short-read 염기서열분석을 위해 30마이크로리터의 라이게이션 마스터 믹스, 1마이크로리터의 라이게이션 인핸서, 2.5마이크로리터의 어댑터를 튜브에 추가합니다.위아래로 피펫팅하여 튜브의 내용물을 철저히 혼합합니다. 다시 튜브를 돌려 거품을 제거합니다. 그런 다음 섭씨 20도에서 15분 동안 튜브를 배양합니다.튜브에 uracil-DNA glycosylase 및 DNA glycosylase lyase endonuclease VIII의 상업용 혼합물 3 마이크로 리터를 추가합니다. 총 부피를 96.5마이크로리터로 조정합니다. 성분을 철저히 혼합하고 써모사이클러에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.튜브에서 세척된 어댑터 결찰 DNA에 모든 시약을 첨가하여 중합효소 연쇄 반응 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 와류로 반응을 잘 혼합하십시오. 와류가 끝나면 샘플을 thermocycler에 넣고 thermocycler 증폭 설정을 시작합니다.실온에서 유지되는 약 25마이크로리터의 마그네틱 비드를 샘플에 첨가하고 반복적인 피펫팅으로 혼합합니다. 샘플을 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드에 튜브를 옮기고 5분 더 기다립니다.5분 후, 상층액을 라벨이 부착된 새 튜브 세트로 제거합니다. 다음으로, 상등액에 실온에서 유지되는 SPRI 비드 6 마이크로 리터를 넣고 철저히 혼합합니다. 샘플을 5분 동안 배양한 후 마그네틱 플레이트에 튜브를 옮기고 5분 더 기다립니다.상층액을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 신선한 80% 에탄올을 마그네틱 스탠드의 튜브에 추가합니다. 다음으로, 튜브를 실온에서 30초 동안 배양합니다.30초 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 마그네틱 스탠드에 올려 놓은 상태에서 튜브의 뚜껑을 연 상태에서 비드를 5분 동안 자연 건조합니다. 이제 자석에서 튜브를 제거합니다. 비드의 표적 DNA를 33마이크로리터의 0.1X Tris-EDTA 완충액으로 용리하고 철저히 혼합합니다.적절한 혼합 후 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 옮기고 용액이 투명해질 때까지 약 2분 동안 기다립니다. 보관을 위해 30 마이크로 리터의 상등액을 2 밀리리터 튜브로 피펫합니다.식물 표본 DNA의 분리를 보여주기 위해 서로 다른 식물 표본에서 분리된 이중 가닥 DNA로 아가로스 겔을 실행했습니다. 10 밀리그램의 잎 조직을 사용하여 거의 3.56 내지 2, 610 나노그램의 이중 가닥 DNA를 아가로스 겔에 적재하였다. 겔은 모든 레인에서 분해된 식물 표본 DNA를 도말 형태로 보여줍니다.다음으로, 10개의 식물 표본에서 분리된 DNA로부터 고품질 염기서열분석 라이브러리의 회수를 보여주기 위해 아가로스 겔을 실행했습니다. 아가로스 겔에 로딩하기 전에, 약 1.26 - 464 나노그램의 분리된 식물 표본 DNA를 효소 전단을 실시하고 90% bead volume으로 세척했습니다. 아가로스 겔은 10개의 식물 표본의 DNA에서 고품질 염기서열분석 라이브러리의 회수를 보여줍니다.최종 염기서열분석 라이브러리는 300에서 500 염기쌍 사이의 기본 대역을 보여줍니다. 그런 다음 식물 표본 유래 DNA의 샷건 서열을 보여주기 위해 TK 686 엽록체 게놈의 원형 플롯을 얻었습니다. 이 염기서열은 DNA의 전체 길이, 반전된 반복 영역, 크고 작은 단일 복제 영역의 존재 여부를 보여줍니다.이 기법을 마스터하면 13시간 이내에 24개의 샘플에 대해 수행할 수 있으며 실제 실습 시간은 약 8시간밖에 걸리지 않습니다. 이 절차 후, 결과 라이브러리에서 염기서열 캡처와 같은 다른 방법을 수행하여 계통발생 연구를 위한 핵 데이터를 생성할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

2 가지 plant organellar DNA 농축 방법의 비교 및 ​​최적화가 제시됩니다 : 전통적인 차동 원심 분리 및 메틸화 상태에 기초한 총 gDNA 분획. 우리는 결과로 나오는 DNA 양과 품질을 평가하고, 짧은 읽기 차세대 시퀀싱에서의 성능을 시연하며, 장시간 읽기 단일 분자 시퀀싱에서의 사용 가능성에 대해 논의합니다.

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

젤-seq 연구자를 준비가 동시에 라이브러리에 대 한 두 DNA-및 RNA-seq 간단한 히드로 장치를 사용 하 여 100-1000 셀에서 시작 하는 무시할 수 추가 비용 있습니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다.

젤-seq: DNA와 RNA 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법

미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

긴 읽기 시퀀스는 크게 복잡 한 유전자 및 구조 변화의 특성의 어셈블리를 촉진 한다. 연속 nanopore 기반 플랫폼으로 매우 긴 시퀀스를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 최적화 된 DNA 추출이 수정된 라이브러리 준비 인간 세포에서 kilobase 읽기 적당 한 보도 수백을 생성 하 여 다음을 채택 한다.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

이 프로토콜은 오줌 박테리아의 배양, 시퀀싱 및 드 노보 하이브리드 게놈 조립에 대한 포괄적 인 접근 방식을 자세히 설명합니다. 그것은 오줌 식민지, 병기 발생 및 항균 저항 보급에 기여하는 염색체 및 외염색체 유전 요소 둘 다 공부에 유용한 완전하고 원형 게놈 서열의 생성을 위한 재현 가능한 절차를 제공합니다.

짧고 긴 읽기 시퀀싱 기술을 사용하여 요로나박테리아의 완전한 게놈 생성을 위한 하이브리드 드 노보 게놈 조립

고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

본 프로토콜은 식물 기반 의약 물질을 인증하기 위해 DNA 바코드 기술을 사용하는 것을 설명하고 있으며, 약용 식물 Angelica sinensis (Oliv.) Diels가 그 예로 확인되었습니다.

약용 식물을 식별하기 위한 DNA 바코드 적용

학습하세요 표본관 식물 표본에서 DNA를 분리하고 고처리량 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 방법을. 이 기술은 퇴화된 샘플에서도 견고한 DNA 분리를 가능하게 하여 계통유전체학 연구에 활용할 수 있습니다.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

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