강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

이 프로토콜의 전반적인 목표는 식물 표본 표본에서 분리된 이중 가닥 DNA와 그에 따른 고처리량 염기서열분석 라이브러리의 수량을 증가시켜 계통유전체학 연구에서 유용성을 극대화하는 것입니다. 이 방법은 광범위한 샘플 분해로 인해 게놈 염기서열분석(genomic sequence)으로 프로젝트를 시퀀싱하는 데 유용하지 않은 식물 표본 표본의 잠재력을 실현합니다. 이 기술의 주요 장점은 희귀하고 역사적으로 중요한 식물 표본 표본을 광범위한 파괴 샘플링 없이 사용할 수 있을 만큼 충분히 견고하다는 것입니다.

이 기술은 체계적인 간격 프로젝트에서 분류군 표본 추출의 깊이를 확장합니다. 종 획득은 제한적인 단계이지만 이 프로토콜을 사용하면 과거 수집을 이러한 연구에 쉽게 사용할 수 있습니다. 액체 질소와 30-50mg의 멸균 모래를 첨가하여 미리 선택된 식물 표본 조직 1cm를 미리 냉각된 모르타르와 절굿공이에 담긴 미세한 가루로 분쇄합니다.

성공적인 DNA 분리를 위해서는 적절한 분쇄가 필수적입니다. 그리고 샘플이 완전히 분쇄되도록 주의해야 합니다. 다음으로, 얼린 분말을 2개의 2밀리리터 튜브에 넣고 튜브 부피의 절반 이상을 채웁니다.

그런 다음 각 튜브에 600마이크로리터의 따뜻한 CTAB 용액을 추가합니다. 반전과 볼텍싱으로 분말을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 65도로 유지되는 수조에서 1시간에서 1.5시간 동안 샘플을 배양합니다.

그 동안 15분마다 소용돌이가 일어납니다. 다음 10, 실내 온도에 5 분 동안 000 g에 표본을 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 약 500마이크로리터의 상등액을 새로운 라벨이 부착된 튜브 세트로 옮깁니다.

상등액에 RNase A의 밀리리터당 10밀리그램 4마이크로리터를 각 곡에 추가합니다. 그런 다음 뒤집거나 피펫팅하여 튜브의 내용물을 혼합합니다. 섭씨 37도로 유지되는 열 블록 또는 수조에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

튜브가 실온에 도달하면 약 500마이크로리터의 25:24:1 페놀, 클로로포름, 이소아밀 알코올 혼합물을 샘플에 추가합니다. 그런 다음 뒤집거나 반복적인 피펫팅으로 튜브의 내용물을 혼합합니다. 다음 12, 실내 온도에 15 분 동안 000 g에 표본을 원심 분리하십시오.

약 400마이크로리터인 상부 수성층을 라벨링된 새로운 튜브 세트로 옮깁니다. 각 튜브의 수성층에 약 400마이크로리터의 24:1 클로로포름, 이소아밀 알코올 혼합물을 추가합니다. 반복적인 피펫팅 또는 반전으로 샘플을 철저히 혼합합니다.

다음 12, 5 분 동안 000 g에 관을 원심 분리하고 대략 300 마이크로리터의 위 수성 층을 pre-chilled, 레테르를 붙인 관으로 옮깁니다. 다음으로, 300마이크로리터의 미리 냉각된 이소프로판올과 12마이크로리터의 2.5몰 아세트산나트륨을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 30-60분 동안 튜브를 배양합니다.

배양 후 냉동실에서 샘플을 꺼냅니다. 다음으로, 실온에서 15분 동안 12, 000g에서 샘플을 원심분리합니다. 원심 분리 후, 약 300-500 마이크로 리터의 70 % 에탄올로 펠릿을 세척하십시오.

다시, 12, 000 g에 10 분 동안 관을 원심 분리하십시오. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하십시오. 다음으로, 펠릿을 자연 건조시키고 DNA를 50 마이크로 리터의 1X Tris-EDTA 완충액에 용해시킵니다.

0.2ml 중합효소 연쇄 반응 튜브에 1-16마이크로리터의 분리된 DNA와 2마이크로리터의 단편화 반응 완충액을 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물로 최종 부피를 18마이크로리터로 조정합니다. 다음으로, 2마이크로리터의 이중 가닥 DNA 단편화 효소를 추가하고 혼합물을 몇 초 동안 잠시 와류로 회전시킵니다.

그런 다음 thermocycler에서 섭씨 37도에서 8.5분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 튜브에 5마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 추가합니다. 25마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 전단된 DNA의 총 부피를 50마이크로리터로 조정합니다.

그런 다음 실온에서 유지되는 45마이크로리터의 SPRI 비드를 전단된 DNA 50마이크로리터에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 두 비드를 완전히 혼합합니다. 튜브가 들어있는 샘플을 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 자성판에 튜브를 옮기고 5분 더 기다립니다.

상층액을 조심스럽게 배출하십시오. 그런 다음 마그네틱 스탠드의 튜브에 200마이크로리터의 신선한 80% 에탄올을 추가하고 실온에서 30초 더 기다립니다. 30초 후 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

튜브의 뚜껑을 열어 두고, 마그네틱 스탠드에서 비드를 5분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 마그넷 스탠드에서 튜브를 제거하고 55마이크로리터의 0.1X Tris-EDTA 완충액에 비드의 DNA를 용출합니다. 반복적인 피펫팅으로 DNA를 철저히 혼합합니다.

그런 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다시 한 번, 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 약 2분 후에 용액이 제거될 때까지 기다립니다. 52마이크로리터의 상층액을 제거한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 정량 분석을 수행합니다.

세척 및 전단된 DNA 50마이크로리터에 3마이크로리터의 엔도뉴클레아제, 인산염 테일링 효소 및 7마이크로리터의 반응 완충액을 추가합니다. DNA와 다른 성분을 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 돌려 거품을 제거합니다.

회전 후 샘플을 thermocycler로 옮기고 프로그램을 설정하십시오. 어댑터를 25-50배 희석하여 0.6-0.3마이크로몰의 작업 농도를 얻습니다. 고처리량 short-read 염기서열분석을 위해 30마이크로리터의 라이게이션 마스터 믹스, 1마이크로리터의 라이게이션 인핸서, 2.5마이크로리터의 어댑터를 튜브에 추가합니다.

위아래로 피펫팅하여 튜브의 내용물을 철저히 혼합합니다. 다시 튜브를 돌려 거품을 제거합니다. 그런 다음 섭씨 20도에서 15분 동안 튜브를 배양합니다.

튜브에 uracil-DNA glycosylase 및 DNA glycosylase lyase endonuclease VIII의 상업용 혼합물 3 마이크로 리터를 추가합니다. 총 부피를 96.5마이크로리터로 조정합니다. 성분을 철저히 혼합하고 써모사이클러에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

튜브에서 세척된 어댑터 결찰 DNA에 모든 시약을 첨가하여 중합효소 연쇄 반응 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 와류로 반응을 잘 혼합하십시오. 와류가 끝나면 샘플을 thermocycler에 넣고 thermocycler 증폭 설정을 시작합니다.

실온에서 유지되는 약 25마이크로리터의 마그네틱 비드를 샘플에 첨가하고 반복적인 피펫팅으로 혼합합니다. 샘플을 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드에 튜브를 옮기고 5분 더 기다립니다.

5분 후, 상층액을 라벨이 부착된 새 튜브 세트로 제거합니다. 다음으로, 상등액에 실온에서 유지되는 SPRI 비드 6 마이크로 리터를 넣고 철저히 혼합합니다. 샘플을 5분 동안 배양한 후 마그네틱 플레이트에 튜브를 옮기고 5분 더 기다립니다.

상층액을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 신선한 80% 에탄올을 마그네틱 스탠드의 튜브에 추가합니다. 다음으로, 튜브를 실온에서 30초 동안 배양합니다.

30초 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 마그네틱 스탠드에 올려 놓은 상태에서 튜브의 뚜껑을 연 상태에서 비드를 5분 동안 자연 건조합니다. 이제 자석에서 튜브를 제거합니다. 비드의 표적 DNA를 33마이크로리터의 0.1X Tris-EDTA 완충액으로 용리하고 철저히 혼합합니다.

적절한 혼합 후 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 옮기고 용액이 투명해질 때까지 약 2분 동안 기다립니다. 보관을 위해 30 마이크로 리터의 상등액을 2 밀리리터 튜브로 피펫합니다.

식물 표본 DNA의 분리를 보여주기 위해 서로 다른 식물 표본에서 분리된 이중 가닥 DNA로 아가로스 겔을 실행했습니다. 10 밀리그램의 잎 조직을 사용하여 거의 3.56 내지 2, 610 나노그램의 이중 가닥 DNA를 아가로스 겔에 적재하였다. 겔은 모든 레인에서 분해된 식물 표본 DNA를 도말 형태로 보여줍니다.

다음으로, 10개의 식물 표본에서 분리된 DNA로부터 고품질 염기서열분석 라이브러리의 회수를 보여주기 위해 아가로스 겔을 실행했습니다. 아가로스 겔에 로딩하기 전에, 약 1.26 - 464 나노그램의 분리된 식물 표본 DNA를 효소 전단을 실시하고 90% bead volume으로 세척했습니다. 아가로스 겔은 10개의 식물 표본의 DNA에서 고품질 염기서열분석 라이브러리의 회수를 보여줍니다.

최종 염기서열분석 라이브러리는 300에서 500 염기쌍 사이의 기본 대역을 보여줍니다. 그런 다음 식물 표본 유래 DNA의 샷건 서열을 보여주기 위해 TK 686 엽록체 게놈의 원형 플롯을 얻었습니다. 이 염기서열은 DNA의 전체 길이, 반전된 반복 영역, 크고 작은 단일 복제 영역의 존재 여부를 보여줍니다.

이 기법을 마스터하면 13시간 이내에 24개의 샘플에 대해 수행할 수 있으며 실제 실습 시간은 약 8시간밖에 걸리지 않습니다. 이 절차 후, 결과 라이브러리에서 염기서열 캡처와 같은 다른 방법을 수행하여 계통발생 연구를 위한 핵 데이터를 생성할 수 있습니다.