Name: 세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 세균성 지질단백질 추출 및 N말단 리포펩티드 준비 방법을 MALDI-TOF 질량분석을 통해 구조 분석하는 기술입니다. 면역학 연구와 TLR 신호전달 이해에 활용됩니다.

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메러디스 랩에서 연구 비 과학 대학 (펜실베니아 주립 대학)에서 제공 하는 시작 기금에 의해 지원 되었다. 우리는 전문적인 기술 조언과 펜 스테이트 Proteomics와 질량 분석 핵심 시설, 대학 공원, PA, 대량 spectrometric 분석 수행 된 장비에 대 한 액세스에 대 한 박사 타 Laremore 감사 합니다.

1. 세포 성장 및 세포
<ol><li>후반 지 수 단계 (OD600 1.0-1.5의) 15 mL tryptic 간장 국물 (TSB) 또는 유사한 리치 미디어에 박테리아를 성장. 원심 분리에 의해 세포를 수확, Tris 버퍼 식 염 수/EDTA (: TBSE)로 한 번 씻어 프로토콜을 계속 하거나 사용까지 동결. 참고:: TBSE: 20 mM Tris-염 산 (HCl), pH 8.0, 130 m m 염화 나트륨 (NaCl), 그리고 5 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)). 단백 식 수정 성장 조건 (예: 산도, 염 분, 성장 매체) 및 성장 단계15에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 원하는대로, 하지만 15 mL 세포 성장 조절 수 셀은 권장 단백질의 단일 준비에 대 한 초과 바이오 매스 단백 생산량을 줄일 수 있습니다. 한 15 mL 준비는 일반적으로 2 ~ 4의 최적의 로드에 대 한 충분 한 샘플 생성 표준 SDS 페이지 미니 젤에 차선.</li>
	<li>1mm phenylmethyl sulfonyl 불 소 (PMSF)와 0.5 mg/mL lysozyme 800 μ: TBSE 셀 resuspend 솔루션 2.0 mL 스레드 microcentrifuge 튜브 스크류 캡 및 o-링을 전송 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어 참고: 특정 종 lysozyme에 의해 세포에 감염 되지 않습니다. 적절 한 용균성 효소 세포에 도움을 대체 한다.</li>
	<li>튜브 ~ 800 μ 0.1 m m 지 르 코니 아/실리 카 구슬을 추가 하 고 30의 5 사이클는 균질 화기에 최대 속도 (7000 rpm)에서 떨고 하 여 셀을 방해 s 각 사이클 사이 얼음에 각각, 2 분 휴식.</li>
	<li>(작은 구슬 및 손상 되지 않은 세포)에 4 ° C에서 5 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기 샘플. 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송 및 얼음에 계속.</li>
	<li>200 μ: TBSE 나머지 펠 릿을 추가 하 고 추가 주기에 균질 화기 돌아갑니다. (위와) 원심을 상쾌한 이전 상쾌한 (800-1000 μ 총 볼륨 되어야 함)와 결합 합니다.</li>
</ol>2. 텍사스-114 단계 분할 하 여 단백질의 농축
<ol><li>TX-114 2% (vol/vol)의 최종 농도에 계면 활성 제와 함께 상쾌한은 동일한 양의 4% (vol/vol) 얼음 처럼 차가운: TBSE에 계면 활성 제를 추가 하 여 보충 하 고 1 시간 반전에 의해 모든 ~ 15 분을 혼합에 대 한 얼음에 품 어. 참고: 냉장, 계면 활성 제와 상쾌한 됩니다 혼합할 수 있는.</li>
	<li>37 ° C 물 목욕 튜브를 전송 및 상 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어. 샘플 bi phasic 분리를 유지 하기 위해 실내 온도 에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심</li>
	<li>부드럽게 위 수성 단계에서 플라스틱 그리고 삭제. 그것의 원래 볼륨을 튜브 리필 낮은 계면 활성 단계로 얼음: TBSE를 추가 하 고 혼합에 반전. 10 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>37 ° C 물 목욕 튜브 전송 단계 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어 다음 실 온에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>3 별거의 총 단계 2.3-2.4를 한 번 더 반복 합니다. 위 수성 단계를 제거 하 고 삭제.</li>
	<li>계면 활성 제 단계에 차가운: TBSE의 1 볼륨을 추가 하 여 기사 (튜브의 하단에 표시)의 과정에서 형성 된 침전 된 단백질의 펠 릿을 제거 합니다. 불용 성 단백질을 작은 2 분 16000 x g에서 4 ° C에서 원심. 참고: 샘플은 단일 단계를 유지 한다. 단계 분리 발생 하면, 다시 샘플을 진정 하 고 다시 원심. 펠 릿 일반적으로 단백이 아닌 오염 물질의 구성 이지만 추가 분석을 위해 유지 될 수 있습니다.</li>
	<li>즉시 신선한 2.0 mL microcentrifuge 튜브 100% 아세톤의 1250 μ를 포함 하는 상쾌한 전송. 점도 있을 것 이다 팁에서 샘플을 씻어 철저 하 게 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 반전 하 여 혼합 하 고 단백질을 침전에-20 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>샘플 튜브의 방향에 주의와 단백질 pellet을 실 온에서 20 분 16000 x g에서 원심 지 단백질 튜브의 외부 벽을 따라 얇고, 백색 필름을 형성 합니다.</li>
	<li>100% 아세톤과 두 번 펠 릿을 세척. 아세톤을 가만히 따르다 고 공기 샘플을 건조 수 있습니다.</li>
	<li>10 mM Tris HCl, pH 8.0 또는 표준 Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼16 의 20-40 μ를 추가 하 고 철저 하 게 아래로 침전 된 지 단백질으로 벽에 pipetting으로 resuspend. 지 단백질을 꺼내 려 피 펫 팁 튜브의 측면을 다쳤어요. 참고: 단백질 Tris 버퍼에서 분해 되지 않습니다 하지만 오히려 한 현 탁 액을 형성.<ol>
<li>-20 ° C에서 단백질 사용까지 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SDS 페이지, Electroblotting, Ponceau s 얼룩
<ol><li>SDS 페이지 표준 방법16를 사용 하 여 별도 단백질. 참고: 적절 한 젤 아크릴 비율의 용도 단백질의 크기에 따라 달라 집니다. 여기, E. faecalis 단백질 분리 되었다 10% 이상, 트리 스-글리신 젤 16.5% 트리 스 tricine 젤 작은 대장균 단백 Lpp17사용 되었다.</li>
	<li>표준 electroblotting 프로시저를 사용 하 여 니트로 전송 막에는 단백질을 전송 합니다. 참고: 세미 드라이 전송 Bjerrum 란-닐슨 버퍼 플러스 0.1 %SDS 사용 하 여 25 V, 1.3에서 수행한 15 분18mA. 그러나 또는 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 사용할 수, 그것은 니트로 보다 더 소수, 그것은 나중 단계에서 막에서 소수 lipopeptides의 효율적인 차입을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>컨테이너와 커버 Ponceau S 솔루션 (0.2% (w/v) Ponceau S 5% 초 산에서)와 니트로 막 전송. 바위 부드럽게 5 분 또는 때까지 빨강 분홍색 밴드를 볼 수 있습니다.</li>
	<li>Ponceau S 솔루션을 부 어와 신중 하 게 씻어2O를 초과 제거 얼룩 지명 타자로 니트로 막. 참고: Ponceau 스테인드 밴드는 급속 하 게 destain 것입니다. 밴드는 사라지고, 착 색 과정을 반복 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 면도날으로 원하는 밴드와 microcentrifuge 튜브에 소비 세. DH2O를 완전히 밴드 destain의 1 mL로 세 번 세척. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 저장소 삭제 섹션 사용까지-20 ° C에서 물으로 덮여 있습니다.</li>
	<li>깨끗 한 표면에와 깨끗 한 면도날으로 섹션을 전송, 0.5 mL 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브로 조각 작은 조각의 약 1 m m x 1 m m. 수집으로 니트로 스트립 주사위.</li>
	<li>씻어 갓 50 m m 염화 중 탄산염 (NH4HCO3) 0.5 mL로 두 번 조각의 pH 7.8-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 학년 물에.</li>
</ol>4. tryptic 소화, 니트로 막, MALDI 표적, 및 데이터 수집에 증 착에서 Lipopeptide 추출
<ol><li>50mm NH4HCO3, pH 7.8 HPLC 학년 물에서 trypsin의 20 μ g/mL 해결책의 20 μ에 니트로 조각 resuspend. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각을 완전히 trypsin 솔루션에 포함 되도록 짧게 스핀. 파라핀 필름 증발을 방지 하 고 37 ° c.에 하룻밤 다이제스트를 품 어를 사용 하 여 튜브 뚜껑 커버</li>
	<li>스핀에서 16000 x g 30 s 및 제거 pipetting으로 액체에 대 한 샘플. 참고:이 단백질 식별 MALDI TOF MS에 의해 나중에 시험 될 수 있다 trypsinized 친수성 펩 티 드를 제거 합니다.</li>
	<li>HPLC 학년 물에 0.5 %trifluoroacetic 산 (TFA)의 50 μ를 추가 합니다. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각 솔루션 적용 되도록 간단히 샘플을 회전 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. Pipetting으로 액체를 제거 합니다. 주의: TFA는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.</li>
	<li>HPLC 학년 물에 10% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다. 주의: 이기는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.</li>
	<li>HPLC 학년 물에 20% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다. 참고:이 느슨하게는 니트로에 바인딩된 모든 알맞게 소수 성 펩 티 드를 제거 합니다.</li>
	<li>단단히 바인딩된 lipopeptides elute 갓 만든 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 매트릭스 클로 프롬-메탄올 (2:1, v/v)에 용 해의 15 μ를 추가 하 고 간헐적으로 vortexing와 실 온에서 10 분 동안 품 어.<ol>
<li>또는 15 μ 클로 프롬-메탄올 elute lipopeptides 나중에 매트릭스와 믹스를 추가 합니다. 2, 5-dihydroxybenzoic 산 (DHB) 등 다른 행렬 특정 lipopeptide 구성에 대 한 불만족 한 결과 가져온 경우 CHCA에 대안으로 시험 되어야 한다. 주의: 클로 프롬 및 메탄올 흡입 하는 경우에 유해 하다입니다. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.</li>
		<li>
옵션: 나트륨을 홍보 하기 위해 대형 adduct, 1mm의 최종 농도에 수성 나트륨 탄산염 (NaHCO3)와 클로 프롬-메탄올에 CHCA의 솔루션을 보완.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간단히 샘플을 회전 합니다. 피 펫와 신중 하 게 새로운 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브에 액체를 전송. 이 솔루션은 N 맨끝 lipopeptides의 대량을 포함 됩니다. 참고:는 니트로 수 있습니다 부분적으로 또는 완전히 분해 클로 프롬 메탄올 솔루션. 이 부정적인 MS 결과 영향을 주지 않습니다 그리고 lipopeptide 반환을 증가 하는 대체 방법으로 사용할 수 있습니다. PVDF 막 하지 같은 방식으로 분해 됩니다.</li>
	<li>닦은 강철 MALDI 표적에 CHCA와 eluted lipopeptides의 1 μ를 입금. 참고: 클로 프롬-메탄올 것입니다 증발 신속 하 게, 결정 CHCA와 lipopeptides 뒤에 남겨두고. Aliquot는 선택적 둘째 1 μ 샘플 농도 높이기 위해 같은 자리에 입금 될 수 있습니다. 클로 프롬-메탄올 대상에 증 착 후 크게 확산 될 수 있습니다와 같은 한다 주의 샘플 대상에 혼합 하지 마십시오. 입금 하 고 각 샘플의 여러 관광 명소를 촬영 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>즉시 질량 분석을 진행 합니다. 특히 자리 포함 되어 있는 경우 두 레이어 샘플의 두 번째 레이어 스팟의 바깥쪽 테두리에는 lipopeptides를 밀어 수 있습니다 lipopeptide 신호, 스팟의 모든 영역을 검사 합니다. 참고: 권장된 시작 레이저 강도 25%, 비록 그것은 신호를 수집 하 고 적절 한 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 여러 스펙트럼 (20 명 이상 검사)를 합계 하는 강도 증가 하는 데 필요한 있을 수 있습니다. 여기, 스펙트럼 MALDI TOF TOF 악기에 인수 했다 ( 테이블의 자료를 참조) 700-3500 m/z 범위 반사판 긍정적인 이온 검출에 대 한 공장에서 구성 된 악기 방법을 사용 하 여. 악기는 소 혈 청 알 부 민 (BSA) tryptic 펩 티 드 혼합물으로 보정 했다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

지 단백질 특성의 2 단계로 여기 프로토콜에 설명 합니다: TX-114에 의해 농축 단계 MALDI TOF MS에 의해 분할 및 구조 결정. TX-114 추출 하는 동안 추가 원심 아세톤 강수량 수익률 높은 농축된 단백질 이어서이 과정 침전 오염 단백질을 제거 합니다. 셀의 15 mL 가치에 각 준비의 규모를 제한 하 여 몇 가지 샘플 수 쉽게 병렬로 처리 되며 원하는 경우, 프로토콜의 끝에 풀링된.
MS 구조 분석용, 니트로 하는 단백질의 양도 트립 신 소화, 세척, 고 막에서 후속 차입을 촉진 한다. 우리의 손에서이 접근은 입증 전통적인 polyacrylamide 젤 플러그에서 세제 중재 추출 하는 것이 좋습니다는 단백질 연관 니트로 막의 표면 그리고 polyacrylamide에 포함 되지. 니트로 표면 단백 협회도 크게 소수 성 펩 티 드에 의해 컨테이너 표면에 일반적인 흡착의 일반적인 문제를 방지할 수 있습니다. 니트로 조각의 stepwise 차입 제거 더 많은 친수성, ...

세균성 단백질을 보존된 N 맨끝 지질 수정 시스테인 그 앵커 세포 막 표면에 구형 단백질 도메인 특징입니다. 그들은 보편적으로 박테리아에 일반적인 게놈1내의 모든 세포질 유전자의 2 ~ 5%를 구성 배포 됩니다. 지 단백질 등 양분 통풍 관, 신호 변환 세포질 과정의 광범위 한에 중요 한 역할 단백질 복합물의 및 유지 세포 봉투 구조적 무결성2. 병원 성 박테리아, 단백질 독성 요인3,4로 제공합니다. 감염, 동안 N 맨끝 lipopeptides 수용 체 통행세 같이 (TLR) 2에 의해의 인식 incites 침입 병원 체를 제거 하는 타고 난 면역 반응. N 맨끝 acylation 상태에 따라 단백질 대체 TLR2 heterodimeric 복합물에 의해 일반적으로 인식 된다. TLR2 TLR1 TLR2 TLR6 바인딩 무료 lipopeptide α-아미노 termini 동안 N-acylated lipopeptides를 인식합니다. 한 번 바운드, 신호 경로 proinflammatory cytokines3,4의 분 비를 유도 하기 위해 수렴.
그것은 이전 줄 알았는데 그 그람 양성 박테리아에서 단백질 diacylated 및 그램 음성 박테리아에서 보존된 N 맨끝 시스테인 잔류물에는 아 미드 연결 지방산의 존재 또는 부재에 다른 triacylated를 했다. 이 가정은 Lnt, 형성 하는 triacylated 단백질5그람 음성 N acyl 전이 효소를 그람 양성 게놈에서 순서 orthologs의 부족에 의해 지원 되었다. 그러나, 최근 연구 3 소설 N 맨끝 단백 구조, peptidyl, lyso와 N-아 세 틸 형태6,7 뿐 아니라 단백 triacylation 그람 양성 Firmicutes 그 부족 lnt에 계시 했다 ,8. 이러한 결과 소설 단백질이 어떻게 만들어에 대 한 근본적인 질문 어떤 생리 적 목적이 나 장점은 다양 한 형태의 얻으며 함께 가능한 아직---발견 지 형태에 대 한 질문을 제기. 또한, 그들은 명확 하 게 지 단백질 구조 예측 유전체학의 현재 무 능력을 보여 줍니다. 실제로, 우리는 최근 단백 N acyl transferases, Lit, Enterococcus faecalis 균 cereus 만드는 lyso 형태의 지 단백질9에서 라는의 소설 클래스 식별. 이 매우 소수 성 성격 및 특성을 그들의 분자 구조를 사용할 수 있는 제한 된 방법 때문에 도전적 일 수 있다 지 단백질 구조를 실험적으로 확인 하는 필요를 나타냅니다.
우리 세균 단백질을 순화 하 고 N-터미널 tryptic 준비 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜 호스트 면역 반응 뿐만 아니라 N-터미널 구조 결정의 단백 유도 대 한 연구를 촉진 하기 위하여 적응 MALDI TOF MS6,10,,1112에 의해 분석을 위해 lipopeptides. 지 단백질 오염 비 단백질을 제거 하 고 단백 수확량을 증가 하는 최적화 메서드를 분할 설립된 트리톤 X-114 (이제부터 계면 활성 제 또는 TX-114 참조) 단계를 사용 하 여 농축입니다. 이러한 단백질은 SDS 페이지 더 정화 또는 TLR 분석 실험에 직접 사용 하기 위해 적합 합니다. MALDI TOF ms, 니트로 막에는 단백질의 양도 비 계 트립 신 소화 효율적인 현장에 대 한 세척, 하며 매우 인 멤브레인 표면에서 후속 차입 정화 N 맨끝 lipopeptides. 니트로 샘플 처리를 용이 하 게 하 고 완전 한 막 단백질13,14, 지 단백질9,10에서 높은 소수 성 펩 티 드에 대 한 시퀀스 범위를 향상을 보여줘 왔다 . 메서드는 중간 세척 솔루션은 단일 실험에서 N-터미널 구조 결심과 동시에 높은 자신감 단백질 식별을 위해 분석 될 수 있다 그래야 펩 티 드, 극성에 따라 분별의 추가 이점이 있다 . 이 프로토콜 고유 기능 의도적인 나트륨 adduct MS/MS, N-acylation 상태의 구조 지정에 은닉 하는 동안 dehydroalanyl 이온으로 부모 이온 조각화를 홍보 하는 대형. N-말단은 모두 가장 변수 및 주요 기능 단백질의 TLR 인식에 관련 된. 함께 찍은,이 프로토콜 정화 및 TOF MALDI MS 실험의 전반적인 목표에 따라 쉽게 적응 하 여 구조 결정의 각 단계와, 지 단백질에 집중 하 고 재현할 수 연구를 허용 했다.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01 mm 지르코니아/실리카 비드</td><td>BioSpec 제품</td><td>110791012</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>EMD</td><td>AX0116-6</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>EMD</td><td>AX0142-6</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>플루카 분석</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT 니트로셀룰로오스</td><td>PALL Life Sciences</td><td>66485</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 다이제스트 표준</td><td>프로테아</td><td>PS-204-1</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>아크로스 유기물</td><td>423550025</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>EMD</td><td>WX0008-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP535-1</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>피어스 트립신 프로테아제</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Acros Organics</td><td>161470100</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 튜브 0.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>트리스-하이드로클로라이드(HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-114</td><td>시그마-알드리치</td><td>93422</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 콩 국물 (TSB)</td> <td>BD</td><td>211822</td><td></td></tr> &<tr><td>alpha; -cyano -4- 하이드 록시 신남산 (MS 등급)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>C8982</td><td></td></tr> <tr><td> Name </td> <td>Company </td> <td>카탈로그 번호 </td> <td>Comments</td></tr> <tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNALyser</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF 타겟</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>355nm 주파수 3배 Nd:YAG smartbeam-II 레이저 장착</td></tr></tbody></table>

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 n 맨끝 lipopeptides의 준비의 농축

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

지 단백질 세균성 세포 봉투의 중요 한 성분 이며 포유류 타고 난 면역 반응의 강력한 활성 제입니다. 세포 생리학과 면역학에 그들의 중요성에도 불구 하 고 많은 소설 지, 어떻게 그들은 합성은, 양식과 호스트 면역에 다양 한 형태의 효과 대 한 발견 되 고 남아 있다. 지 단백질에 대 한 철저 한 연구를 활성화 하려면이 프로토콜 세균 단백 농축 하는 방법에 설명 합니다 및 매트릭스 지원 레이저에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides의 준비 desorption 이온화 시간의 비행 질량 분석기 (MALDI TOF MS)입니다. 단백 추출 및 세균성 세포 막에서 농축 방법 분할 설립된 트리톤 X-114 단계에 확대, 프로토콜 단백 수확량 증가 비 지 오염 물질을 제거 하기 위한 추가 단계를 포함 하 고 순도입니다. 먼저 MALDI TOF 양 여기에 의해 N-터미널 구조 특성에 중요 한 단백질은 수용 체 통행세 같이 (TLR) 분석 실험 일반적으로 사용 됩니다, 이후, 메서드 N 맨끝에 농축 하는 집중된 소수 성 펩 티 드를 분리 하 여 lipopeptides 나트륨 라우릴 황산 염 폴 리 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분리 된 TOF MALDI MS/양 지 단백질에 의해 직접 분석에 적합 니트로 막 전송 현장에 와 소화 트립 신, 순차적으로 북극 tryptic 펩 티 드, 제거 하기 위하여 세척 그리고 클로 프롬-메탄올을 가진 마지막으로 eluted. 세척 솔루션에서 더 극 trypsinized 펩 티 드의 MS와 결합,이 메서드는 둘 다 식별 하는 단백 단일 실험에서의 N-말단의 특성 기능을 제공 합니다. 의도적인 나트륨 adduct 형성 더 구조적으로 유익한 조각화 스펙트럼을 홍보 하는 도구로 채택 될 수 있다. 궁극적으로, 단백질의 농축 및 그들의 N 맨끝 구조의 세균성 단백질의이 유비 쿼터 스 클래스에 더 광범위 한 연구 수 있도록 합니다.

프로토콜의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. TX-114 Enterococcus faecalis ATCC 19433에서에서 추출한 단백 농축 분수는 그림 2에 표시 됩니다. 비교를 위해 침전 된 단백질 분수의 밴딩 패턴도 표시 됩니다. 이 분수에서 단백질은 MALDI MS는 매우 풍부한 단백질 (표 1) 이외의 단백질 오염 수에 의해 확인 되었다. 그림 3 에 질량 스펙트럼 입증 증가 극성 (피크 할당 에 나열 된의 용 매와 니트로 바인딩된 PnrA의 연속적인 세척으로 나타나는 PnrA E. faecalis 단백의 tryptic 펩 티 드 이온 프로필 표 2). 그림 4...

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

이 절차의 전반적인 목표는 직접 적용을 위해 박테리아 세포에서 지단백질을 추출하고 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 구조 분석을 위해 N-말단 리포펩타이드를 추가로 준비하는 것입니다. 이 방법은 지단백질의 N 말단 구조가 Toll-like 수용체 인식 및 신호에 영향을 미쳐 숙주의 면역 반응에 영향을 미치기 때문에 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 고유한 장점은 선택적이지만 의도적인 나트륨 부가물 형성이며, 이는 진단용 디하이드로알라닐 이온으로의 단편화를 촉진하여 지단백질의 아실화 상태의 구조적 할당을 돕습니다.15 밀리리터의 트립틱 콩 육수 또는 이와 유사한 풍부한 매체에서 박테리아를 후기 기하급수적으로 성장시킵니다. Tris-buffered saline EDTA 또는 TBSE로 한 번 세척하기 전에 원심분리로 세포를 수확합니다. 1밀리몰 PMSF와 0.5밀리리터당 밀리리터 라이소자임으로 800마이크로리터의 TBSE에 세포를 재현탁합니다.용액을 나사 캡과 O-링이 있는 2.0ml 나사산 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 튜브에 약 800마이크로리터의 0.1mm 지르코니아 실리카 비드를 첨가한 다음 균질화기에서 30초씩 5회 동안 최대 속도로 흔들어 세포를 파괴하고 각 주기 사이에 얼음 위에서 2분 휴식을 취합니다. 3, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 5 분 동안 펠릿 구슬 및 끊기지 않는 세포에 표본을 원심 분리하십시오.상층액을 새로운 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 얼음 위에 보관하십시오. 나머지 펠릿에 200마이크로리터의 TBSE를 추가하고 추가 사이클을 위해 균질기로 돌아갑니다. 이전과 같이 원심분리기를 만들고 상층액을 이전 상층액과 결합합니다.얼음처럼 차가운 TBSE에 동일한 부피의 4% 계면활성제를 첨가하여 상등액에 TX-114 계면활성제를 최종 농도 2%까지 보충합니다. 보충된 상등액을 얼음 위에서 1시간 동안 배양하고 15분마다 뒤집어서 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조로 옮기고 10분 동안 배양하여 상 분리를 유도합니다.10, 000 시간 g에 biphasic 별거를 유지하기 위하여 실내 온도에 10 분 동안 표본을 분리기로 만드십시오. 상부 수성상을 부드럽게 피펫으로 분리하여 버립니다. 얼음처럼 차가운 TBSE를 하부 계면활성제 상에 추가하여 튜브를 원래 부피로 다시 채우고 뒤집어 혼

enrichment-bacterial-lipoproteins-preparation-n-terminal-lipopeptides

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Armbruster, KM, Meredith, TC 질량 분석법에 의한 구조 결정을 위한 박테리아 지단백질의 농축 및 N-말단 리포펩티드의 제조. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 온열 시 상 분리를 거치는 비이온성 세제를 사용하여 박테리아 지단백질을 농축하는 방법을 보여줍니다. 순차적인 온도 변화와 원심분리 단계를 통해 지단백질은 세제 상으로 선택적으로 분할되는 반면 비지단백질 오염 물질은 제거됩니다. 그런 다음 농축된 지단백질을 침전, 세척 및 다운스트림 응용 분야를 위해 재현탁됩니다.

비이온성 세제 상 분리를 사용한 박테리아 지단백질 농축

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.

초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

많은 예측된 (포스포) 리파제는 기질 특이성 및 생리학적 기능과 관련하여 제대로 특성화되지 않았습니다. 여기에서 우리는 효소 활성을 최적화하고, 천연 기질을 검색하고, 이러한 효소에 대한 생리학적 기능을 제안하는 프로토콜을 제공합니다.

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지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

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세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

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액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

이 프로토콜은 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 이중층 투석 방법에 의한 고품질 프로테올리포좀의 생산을 위한 효율적인 무세포 방법을 설명합니다. 이 방법은 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

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Shotgun 질량분석법 기반 지질체학은 다양한 설치류 조직에서 한 번의 측정으로 광범위한 지질 등급에 대한 민감한 정량적 스냅샷을 동시에 제공합니다.

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배우세요 세균성 지질단백질 추출 및 N말단 리포펩티드 준비 방법을 MALDI-TOF 질량분석을 통해 구조 분석하는 기술입니다. 면역학 연구와 TLR 신호전달 이해에 활용됩니다.

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

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