신진 대사 매핑: 양적 효소 Cytochemistry 및 Histochemistry Dehydrogenases 세포와 조직에서의 활동을 결정 하

이 비디오는 대사 매핑을 수행하는 방법을 보여줍니다. 탈수소효소(dehydrogenase)라고 하는 특정 효소의 활성을 정량화하는 절차입니다. 세포는 현미경 슬라이드 또는 동결된 조직에 부착됩니다.

수십 년 전, 우리는 현미경으로 조직과 세포의 활동을 감지하기 위해 효소화학(enzymistochemistry)이라고 불리는 일련의 대사 매핑 기술을 개발했습니다. 그러나 신진 대사는 지난 세기 말의 유전 혁명 동안 쓸모 없게되었습니다. 하지만 지금은 신진대사가 다시 뜨겁습니다.

예를 들어, 암세포를 보십시오. 신진대사는 이제 치료 표적으로 간주되고 있으며, 따라서 세포와 조직의 활성 측정이 다시 뜨거워지고 있습니다. 반응 버퍼의 핵심 구성 요소는 폴리비닐 알코올 또는 PVA입니다.

이것은 18%의 농도로 인산염 완충액에 용해되며, PVA는 흡입 시 먼지가 많고 독성이 있으므로 흄 후드 아래에서 PVA의 무게를 측정해야 합니다. 인산염 완충액의 PVA 농도가 높기 때문에 저어주면서 반응 완충액 병 au bain-marie를 가열합니다. 병의 캡을 느슨하게 조이지 않으면 병이 폭발할 수 있습니다.

PVA가 인산염 완충액에 완전히 용해되기까지 최대 15분이 소요될 수 있습니다. 그렇다면 용액은 교반으로 인한 작은 기포로 투명해야 합니다. 점성이 있는 PVA 용액은 넓은 피펫을 사용하여 반응 버퍼 튜브에 피펫으로 주입할 수 있습니다.

PVA가 응고되는 것을 방지하기 위해 튜브를 섭씨 40도 이상으로 유지하십시오. PVA 용액 1ml는 약 4개의 사이토스핀 또는 2개의 조직 제제에 좋습니다. 반응 완충액의 다른 성분인 nitroBT라고도 하는 노란색 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드는 에탄올과 디메틸포름아미드의 혼합물에 용해된 동시에 분젠 버너의 유리 바이알에서 가열합니다.

용액이 끓어오르지 않아야 하며 그렇지 않으면 볼륨이 너무 많이 줄어듭니다. 따라서 바이알을 화염 속에 너무 오래 두지 말고 정기적으로 흔듭니다. 용해 후 얼음 위에 보관하고 용해된 nitroBT가 빠르게 소멸하므로 다음 단계로 빠르게 진행하십시오.

NitroBT는 에탄올과 DMF가 함유된 유리 바이알을 용해시키지 않을 때 바닥에 놓이는 노란색 분말입니다. nitroBT가 용해되었는지 몇 번마다 확인할 수 있습니다. 그러면 용액이 노란색으로 투명해집니다.

용해되면 PVA 용액이 들어 있는 바이알에 nitroBT를 피펫으로 넣을 수 있습니다. 얇은 숟가락이나 얇은 주걱을 사용하여 nitroBT와 완충액을 섞어 부드럽게 저어줍니다. 전체 텍스트의 표 1에 나열된 반응 버퍼의 모든 구성 요소에 대해 단계별로 이 작업을 수행합니다.

반응 성분을 PVA 용액에 저어주는 동안 너무 많은 기포를 만들지 마십시오. 비결은 용액에서 숟가락이나 주걱을 꺼내지 않고 계속 저어주는 것입니다. 전자 운반체인 메톡시 페나지늄 메틸 설페이트는 빛으로부터 보호되고 마지막으로 반응 완충액에 용해되어야 합니다.

MPMS의 빨간색은 모든 구성 요소가 올바르게 용해되었는지 다시 확인하는 데 편리합니다. 반응 완충액을 준비하고 성분을 저어주는 동안 따뜻한 물이 담긴 인큐베이터에서 슬라이드를 50분 동안 예열합니다. 배양실 내부의 수위를 낮게 유지하십시오.

뚜껑을 닫으면 반응 환경이 습하게 유지됩니다. 뚜껑을 열면 물이 슬라이드를 따뜻한 온도로 유지합니다. 유리 피펫을 사용하여 세포 또는 조직 제제에 반응 완충액을 도포합니다.

작은 기포는 표면으로 흘러 세포나 조직의 반응을 방해하지 않으므로 걱정하지 마십시오. 배양 시간 동안 배양실의 뚜껑을 닫아 두십시오. 이렇게 하면 PVA 버퍼가 건조되는 것을 방지하기 위해 습한 환경에서 반응이 발생하는지 확인할 수 있습니다.

대사 매핑 실험에서 대부분의 탈수소효소 반응은 섭씨 37도에서 발생합니다. 사전 지정된 시간 동안 반응 버퍼에서 슬라이드를 배양하며, 이는 전체 텍스트 기사의 표 1에서 찾을 수 있습니다. 탈수소효소의 활성으로 인해 세포나 조직이 짙은 파란색 또는 보라색으로 변할 때 반응이 작용했는지 여부를 쉽게 확인할 수 있습니다.

궁극적으로 무색 불용성 nitroBT로 진한 파란색 포르마 졸로 변하여 탈 수소 효소 활성 부위에 침전됩니다. 효소 반응은 3단계로 중단됩니다. 먼저, 과잉 배양 배지를 조직에서 두드려 제거합니다.

둘째, 배양 배지는 섭씨 60도에서 PH 5.3의 인산염 완충액에서 기계적 세척을 사용하여 현미경 슬라이드에서 세척해야 합니다. 셋째, 현미경 슬라이드를 섭씨 60도에서 PH 5.3의 신선한 인산염 완충액에 20분 동안 방치해야 합니다. 넷째, 인산염 완충액은 수돗물과 증류수를 사용하여 헹굴 수 있습니다.

반응 버퍼가 벗겨지는 것을 쉽게 볼 수 있습니다. 정지 완충액의 낮은 PH는 세포 내부의 탈수소효소 반응을 중단하는 데 도움이 됩니다. 슬라이드를 새 정지 버퍼에 넣고 한 번에 처리하는 슬라이드의 양에 따라 한 번 또는 두 번

또한 슬라이드를 수돗물로 헹구고 증류수로 마무리합니다. 이제 슬라이드는 슬라이드 워머에서 건조하고 동봉할 수 있습니다. 슬라이드의 뒷면을 닦아 조심스럽게 말리고 섭씨 50도에서 60도로 예열 된 슬라이드 워머에 놓습니다.

슬라이드가 건조되면 글리세린 글리세롤 용액과 커버 슬립을 사용하여 슬라이드를 둘러싸고 보존할 수 있습니다. 이미지 획득을 진행할 때까지 슬라이드를 냉장고에 보관하십시오. 이것은 이 비디오에 표시된 실험에서 처리된 유리 슬라이드의 대표적인 조직 단면을 컬러 사진 현미경 사진

이것은 교모세포종 절편이며 렙토 탈수소효소(lepto dehydrogenase)가 조사된 효소입니다. 모든 탈수소효소는 실체 PH를 생성하고 모든 실체 PH 분자는 노란색 테트라졸륨 염인 nitroBT 분자 하나를 이 이미지에 표시된 보라색 침전물인 포르마졸 분자 하나로 변환합니다. 짙은 자주색으로 표시된 종양 세포에서 세포 내에서 높은 젖산 탈수소효소 활성을 볼 수 있습니다.

혈관은 활동이 적고 흰색입니다. 이것은 슬라이드의 동일한 영역의 단색 이미지입니다. 이는 프로토콜에 설명된 대로 효소 활성을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

포르마잔이 많이 생성될수록 픽셀이 더 어두워지고 흡광도가 높아집니다. 그런 다음 흡광도는 생성된 엔티티 ph의 피코몰로 변환될 수 있습니다. 따라서 대사 매핑은 쉽게 수행할 수 있습니다.

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