Name: CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9과 HMEJ 전략을 활용한 생체내 정밀 유전자 표적 통합 기법을 통해 유전자 변형 동물 모델 생성 및 유전자 치료의 효율성을 높이는 방법을 탐구하세요.

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이 작품은 CAS 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (XDB02050007, XDA01010409), 국가 하이테크 R & D 프로그램 (863 프로그램; 2015AA020307), 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되었다 (NSFC 부여 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), 중국 청소년 천 재능 프로그램 (HY), 휴식 프로젝트를 통해 중국 과학 아카데미의, 상하이 시 위원회의 과학 기술 프로젝트 (HY에 16JC1420202), 과학과 기술의 중국 (대부분; 2016YFA0100500).

동물 주제를 포함 한 모든 절차 생물 과학 (CAS) 상하이 연구소에서 생물 의학 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1입니다. 기증자 플라스 미드의 디자인
<ol><li>
SgRNA의 선택
	<ol>
<li>온라인 CRISPR 디자인 도구를 사용 하 여 대상 지역11,12,13,,1415에 sgRNAs를 예측. Cdx2 로커 스에 대 한 6 개의 서로 다른 sgRNAs 디자인 (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) 주위에 정지 codon 높은 순위 및 더 낮은 잠재력으로 오프-대상 (그림 1A)16.</li>
		<li>BbsI 소화 (1 µ L BbsI의 20 µ L의 볼륨에서 1 U / µ L의 최종 농도에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한)에 의해 Cas9-CMV-EGFP 식 벡터와 sgRNA의 2 µ g를 선형화. 다음 1 × 태 버퍼에 1 %agarose 젤 젤 정화 키트에 의해 제품을 정화.</li>
		<li>믹스 한 쌍 sgRNA oligonucleotides 50 µ M. 최종 농도를 1 × T4 DNA 리가 버퍼의 10 µ L에서의 온도 변화 속도 5 ° C/5 분 (5 분 동안 95 ° C 95 ° C에서 25 ° C의 온도 기울기를 사용 하 여 올리고 솔루션을 품 어 5 분, 5 분, 등등을 위한 85 ° C에 대 한 다음 90 ° C.),이 oligos anneal 것입니다.</li>
		<li>혼합 4 µ L의 제품, 1 × T4 DNA 리가 버퍼의 10 µ L에 T4 DNA 리가의 1 µ L로 선형화 벡터의 2 µ L을 단련 하 고 1-2 h (그림 1B) 22 ° C에서 선.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SgRNA의 측량 nuclease 분석 결과 참고: 노크에서 실험을 위해 사용 하는 sgRNA의 대상 효율 측량 nuclease 분석 결과 평가 (일컬어 T7 endonuclease 나 (T7EI) 분석 결과)17. 높은 DNA 분열 효율과 sgRNA 절단 사이트와 정지 codon 사이의 낮은 거리는 sgRNA를 선택 합니다.<ol>
<li>Cas9-sgRNA-EGFP 식 벡터 N2a 셀 라인에 transfect DMEM 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청에서에서 교양, 1 %PSG, 그리고 1% 비 필수 아미노산은 transfection에 의해 키트 ( 재료의 표참조). 5% CO2에서 37 ° C에서 transfected 세포를 품 어.</li>
		<li>외피의 48 h 후 수집 5000 transfected 셀 (GFP+) 형광 활성화 (FACS) 정렬 제어로 비 페 셀을 사용 하 여.</li>
		<li>2-5 µ L oflysis 버퍼 (0.1% 트라이 톤 X-100, 0.1% 트윈 20, 및 100 µ g/mL 가수분해 K) 30 분 동안 56 ° C에서 수집 된 세포를 소화 하 고 십 분 동안 95 ° C에 K 성분을 비활성화.</li>
		<li>중첩 된 PCR (표 1) 제조업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플을 증폭. PCR 제품의 크기는 300-500 bp로 설정 됩니다.<ol>
<li>DNA 중 합 효소와 sgRNA 대상 사이트 (0.1 µ M, 최종 농도) 시퀀스를 인식 하는 외부 뇌관의 쌍 세포 제품의 믹스 1 µ L (표 1), 20 µ L의 볼륨에서 기본 PCR을 수행 하 고.</li>
			<li>5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 30 사이클에 대 한 기본 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 24 72 ° C s (1 분/1 킬로바이트), 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.</li>
			<li>1 µ L 기본 PCR 제품의 중첩 된 내부 뇌관의 쌍을 사용 하 여 2 차 PCR을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>변성 고 다시 1 × T7EI 반응 버퍼 (50 m m NaCl, 10 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1mm DTT pH 7.9)의 20 µ L에서 순화 된 PCR 제품의 300-600 기 anneal 속도/5 분의 5 ° C 95 ° C에서 25 ° C의 온도의 그라디언트를 사용 하 여.</li>
		<li>단련 된 PCR 제품 및 다이제스트 2 h 37 ° C에서 T7EI 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 파편 ( 재료의 표참조) 분리 될 때까지 다음 1 × 태 buffer 120 V 40 분 2 %agarose 젤에 소화 제품을 실행 합니다.</li>
		<li>ImageJ를 사용 하 여 잘라내기 및 포경된 DNA의 밴드 농도 결정. 메서드를 사용 하 여 이전 indel 빈도 보고9 (그림 1C)를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기증자 벡터의 건설 참고: Cdx2 유전자에 대 한 HMEJ 기증자 벡터를 생성 하려면 구성 DNA 기증자 (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp 하겠다) 23 형벌 nt Cdx2 sgRNAs 타겟팅 (D 그림 1및 그림 1E) 양쪽에서 시퀀스. 대상 시퀀스의 PAM 동종 팔의 끝에 인접 했다. 깁슨 어셈블리 HMEJ 기증자 복제에 대 한 것이 좋습니다.<ol>
<li>앞으로 뇌관-1 층으로 800 bp 왼쪽된 상 동 팔 (HAL)을 증폭 (벡터, 23에서에서 15-20 nt 중첩 시퀀스가 포함 된 nt Cdx2 sgRNA 대상 시퀀스, 그리고 HAL에서 약 20 nt 시퀀스) 및 뇌관-1 라운드 (15-20 bp 겹침 순서에서 포함 된 역 p2A mCherry와 HAL에서 약 20 nt 시퀀스) 0.1 µ M 최종 농도 200 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 마우스 게놈 DNA를 사용 하 여에서.</li>
		<li>앞으로 뇌관-2 층 (HAL에서 15-20 nt 겹침 순서와 삽입 부분에서 약 20 nt 시퀀스를 포함 하는)와 p2A mCherry 삽입 단편 증폭 하 고 뇌관-2R (포함 된 무기에서 15-20 nt 중첩 시퀀스에서 약 20 nt 순서 반전 삽입 부분)에서 0.1 µ M 최종 농도가 100 ng / µ L 또는 30 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 기자 시퀀스 게놈 DNA 또는 플라스 미드를 사용 하 여.</li>
		<li>앞으로 뇌관-3 층으로 800 bp 오른쪽 상 동 팔 (무기)를 증폭 (벡터, 23에서에서 15-20 nt 중첩 시퀀스가 포함 된 nt Cdx2 sgRNA 대상 시퀀스, 그리고 무기에서 약 20 nt 시퀀스) 반전 뇌관-3R (15-20에서 nt 중복 시퀀스를 포함 하 고 p2A mCherry 및 무기에서 약 20 nt 시퀀스) 0.1 µ M 최종 농도 200 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 마우스 게놈 DNA를 사용 하 여에서.</li>
		<li>1 × 태 버퍼에 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 하 고 제조업체의 지침 (표 1)에 따라 젤 추출 키트에 의해 예상 되는 크기의 PCR 제품을 정화.</li>
		<li>KpnI 및 XbaI 구조 벡터의 50-100 ng을 소화. 믹스 2 µ L 3 PCR와 30-40 ng / µ L에서 선형화 벡터의 깁슨 믹스 x 2에서 조각 (각, 100-200 ng / µ L에 대 한 1 µ L)를 증폭. H2O 10 µL.Incubate 60 분 50 ° C에서 믹스를 최종 볼륨 조절 추가.</li>
		<li>유능한 대장균 을 변형 모든 조립된 제품 및 플라스 미드 DNA 추출 키트 제조업체의 지침에 따라 하 여 구성 하는 추출 셀. DNA 시퀀싱에 의해 HMEJ 기증자를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 게놈 HMEJ 기반 메서드를 사용 하 여 마우스 배아에서 편집
<ol><li>
Cas9 mRNA의 생산
	<ol>
<li>Cas9 mRNA 준비, T7 발기인 순서는 Cas9 표 1에 나열 된 적절 한 뇌관 쌍을 사용 하 여 PCR 증폭에 의해 지역 코딩을 추가 합니다. 0.1 µ M의 최종 농도 20에서 뇌관 Cas9 F/R 추가 1 × 고 충실도 DNA 중 합 효소 혼합에 벡터를 표현 하는 Cas9의 ng. H2o. 50 µ L 최종 볼륨을 조정</li>
		<li>5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 36 사이클에 대 한 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 4 분 (1 분/1 킬로바이트), 10 분 동안 68 ° C에서 최종 확장명이 68 ° C.</li>
		<li>생체 외에서 전송 (IVT), T7 Cas9 PCR 제품을 정화 하 고 다음 녹음 0.5-1 µ g의 DNA mRNA 전사 키트 제조업체의 지침에 따라 20 µ L의 전체 볼륨에 8 h 37 ° C에 의해 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>15 분 추가 폴 리 A 꼬리 37 ° C에서 45 분 동안 37 ° C에서 DNA 템플렛을 제거 하 고 제조업체의 지침에 따라 RNA 정화 키트, 여 Cas9 mRNA를 복구 하는 혼합물에 DNase의 1 µ L를 추가 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SgRNA의 생산
	<ol>
<li>고 충실도 DNA 중 합 효소로 위에 T7 발기인에 의해 구동 sgRNA 서식 파일을 생성 합니다. 템플릿으로 벡터를 포함 하는 sgRNA 비 계를 선택 합니다. 사용 하는 뇌관은 표 1에 나열 됩니다.</li>
		<li>T7 sgRNA PCR 제품을 정화 하 고 0.5-1을 사용 하 여 µ g sgRNA 짧은 RNA 전사 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 20 µ L의 전체 볼륨에 6 h를 37 ° C에서의 녹음 방송 생체 외에서 에 대 한 템플릿으로 DNA ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 < / c11 >).</li>
		<li>1 µ L DNase의 혼합물에 추가 하 고 DNA 템플렛을 제거 하려면 15 분 동안 37 ° C에는 부 화를 계속. sgRNAs RNA 정화 키트에 의해 정화 ( 재료의 표참조) 이상으로.</li>
		<li>RNase 무료 물에 500 ng / µ L을 sgRNA를 희석 하 고 최대 3 개월까지 −80 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 참고: CRISPR ribonucleoproteins (RNPs)는 더 나은 절단 효율성18,,1920대체 대체 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배아 컬렉션, microinjection 및 생체 외에서 문화
	<ol>
<li>여성 B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) 쥐 (7-8 주 이전) 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)에 의해 뒤에 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 48 h 후 superovulate HCG 주사 후 집 여성 B6D2F1 남성과 하룻밤.</li>
		<li>CO2 마 취, hCG 주사 후 24 h에 의해 여성을 희생. M2 매체에서 (30-50 배아 각 여성에 대 한)와 그들의 oviducts에서 수정 된 배아를 수집 합니다.</li>
		<li>장소 KSOM 중간에 수정 된 배아 (약 300 달걀 1 일 주입에 대 한) (5.55 g/L NaCl, KCl, 0.05 g/L KH2포4, 0.05 g/L MgSO4•7H2O, 0.04 g/L 포도 당, 1.12 g/L 나트륨 0.19 g/L 젖이 나올, 2.1 g/L NaHCO3 , 0.02 g/L 나트륨 pyruvate, 0.25 g/L CaCl2•2H2O, 0.004 g/L EDTA, 0.146 g/L L-글루타민, 및 1 g/L 소 혈 청 알 부 민) 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서.</li>
		<li>혼합 Cas9 mRNA (100 ng / µ L), sgRNA (50 ng / µ L), 그리고 HMEJ 기증자 벡터 (100 ng / µ L), H2O 10 µ L. 최종 볼륨을 조정 하는 얼음에 혼합물을 넣어 추가.</li>
		<li>모 세관 바늘 (외부 직경 1.0 m m, 내경 필 라 멘 트와 0.78 m m)를 당겨 Micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 (매개 변수: 열, 74, 풀, 60, 속도, 80, 200 시간/지연, 압력, 300. 재료의 표참조). 상업적인 바늘은 microinjection에 대 한 대체 대체 될 것 이다.</li>
		<li>HEPES CZB 매체 포함 하는 5 µ g/mL cytochalasin 상수는 microinjector를 사용 하 여 B의 물방울에 잘 정의 된 pronuclei와 혼합물의 가능성이 볼륨 zygotes의 세포질으로 주입 흐름 설정 (그림 2A) (참조 재료의 표)21. 참고: 각 그룹 zygotes의 주입 한다 20-30 분 내 Cytochalasin B는 주사 후 마우스 zygote의 생존 능력을 증대 시킬 수. 또는, microinjection22위에서 설명한 대로 피에 조 시스템으로 동작할 수 있습니다.</li>
		<li>37 ° C 미만 5% CO2 는 blastocyst까지 형광 관찰 (그림 2B , 2C)에 대 한 일 후 무대에서 KSOM 중간에 삽입 된 zygotes 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배아 전송 및 쥐의 생성
	<ol>
<li>주입으로 같은 날에 vasectomized ICR 남성 마우스 estrous ICR 여성 쥐를 친구.</li>
		<li>5% CO2, 그리고 0.5 하루 게시물 coitum (dpc)에서 pseudopregnant ICR 여성의 oviducts로 전송 25-30 2 셀 배아에서 37 ° C에서 2 셀 단계에 주입된 zygotes 문화. 받는 사람 어머니 19.5 dpc에서 새끼를 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 유전형
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용 하 여 발가락 또는 꼬리 샘플에서 마우스 게놈 DNA를 추출 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>5'과 3' 접합 PCR ampliﬁcation를 수행 하기 위해 템플릿으로 UV/vis 분 광 분석에 의해 측정 하는 genomic DNA의 200-400 ng를 사용 하 여 노크에서 이벤트를 식별 합니다.<ol>
<li>5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 38 사이클에 대 한 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장으로 1 분 (1 분/1 킬로바이트), 72 ° C. 5' 접합, 노크-조각 (p2A-mCherry)에 반대 한 HAL의 업스트림에서 앞으로 뇌관을 사용 합니다. 3' 접합로 노크-조각 (p2A-mCherry)에 앞으로 뇌관을 사용 하 여 무기 (표 1)의 하류에 반대 하나.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 × 태 버퍼 및 예상된 조각 크기에 대 한 확인에 1 %agarose 젤에 PCR 제품의 6 µ L를 실행 합니다. 다음 DNA 시퀀싱 (그림 2D)으로 그들을 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HMEJ-기반 Vivo에서 게놈 Hepatocytes에서 편집
<ol><li>금지 장치에 받는 사람 C57BL/6J 마우스 (8 주)를 배치 하 고 슬릿을 통해 꼬리를 넣어.</li>
	<li>HMEJ 기증자 벡터 (30 µ g)과 spCas9 식 벡터 (30 µ g) 염의 2 개 mL에 혼합. 제어 실험에 대 한 염 (그림 3A)의 2 ml HMEJ 기증자 벡터 (30 µ g)을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올과 마우스 꼬리를 청소. 삽입 꼬리에 바늘 정 맥 및 플라스 미드 DNA 솔루션 5-7 미에서 주사 바늘을 제거 하 고 억제 장치에서 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>주입 후 5-9 일 후 CO2 마 취에 의해 쥐를 희생. 0.9% 식 염 수와 쥐 transcardially perfuse, 4 %paraformaldehyde 연동 펌프를 사용 하 여 및 4 ° c.에 하룻밤 간 수정</li>
	<li>하룻밤, 튜브의 바닥에 싱크 될 때까지 30% 자당을 사용 하 여 조직을 탈수.</li>
	<li>섹션 간 샘플 10 µ m의 두께에 냉동된 조직.</li>
	<li>0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 세 번 섹션 린스와 1 차 항 체로 그들을 품 어: 안티-mCherry 토끼 (5%에 희석 NGS) 4 ° c.에서 하룻밤</li>
	<li>세 번에 PB, 섹션을 세척 하 고 다음 2 차 항 체로 그들을 품 어: Cy3-AffiniPure 염소-토끼 IgG 궤도 셰이 커에 실 온에서 2 h에 대 한.</li>
	<li>20 분 동안 DAPI와 섹션 및 형광 관찰 (그림 3B)에 대 한 유리 슬라이드에 글 리세 린과 산 counterstain.</li>
</ol>

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<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18 (1), 92(2017).</li>
<li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR%2FCas+Ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li>
<li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li>
<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

HMEJ 기증자 플라스 미드의 건축에서 가장 중요 한 단계는: (1) 높은 DNA 분열 효율과 낮은 거리 sgRNA 절단 사이트와 정지 codon, 및 (2) 적절 한 건설 HMEJ 기증자의 간의 sgRNA의 선택. CRISPR/Cas9-중재 분열 (sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 포함) 모두 transgene 기증자 벡터에 타겟된 게놈은 효율적이 고 정확한 타겟된 통합에 필요한 vivo에서. HMEJ 기반 방법을 사용 하 여 노크에서 쥐의 세대의 가장 중요 한 단계는: Cas9 mRNA와 sgRNA (Cas9 mRNA와 sgRNA에 존재 하는 아무 변성), 높은 품질의 준비 (1) 및 (2) 높은 품질 HMEJ 기증자 플라스 미드의 준비. 플라스 미드는 배아 발달에 아무 독성 효과 보여줍니다.
최근, NHEJ 기반 방법 또한 효율적인 vivo에서 게놈8편집에 대 한 보고 왔다. 그럼에...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

정확 하 고 타겟 게놈 편집 하는 것은 종종 생산 하는 유전자 변형 동물 모델과 임상 치료 필요 합니다. 효율적인 타겟된 게놈 아연 손가락 nuclease (ZFN), 같은 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs), 편집에 대 한 다양 한 전략을 개발 하기 위해 많은 노력 했다 및 CRISPR/Cas9 시스템. 이러한 전략 타겟된 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 게놈에서 만들고 동종 재결합 (HR)1,2, microhomology-중재 끝 결합 (MMEJ)3 등 본질적인 DNA 복구 시스템 , 4 , 5, 그리고 비 동종 끝 결합 (NHEJ)6,,78 transgenes1,9의 타겟된 통합을 유도 하 라. 시간 기반 전략은 현재 가장 일반적으로 사용 되는 셀 라인에 매우 효율적 이지만 비 분할 셀 후반 S/g 2 단계에서 제한 된 그것의 발생 때문에 쉽게 액세스할 수 없는 접근을 편집 하는 게놈. 따라서, 시간 기반 전략 vivo에서 게놈 편집에 대 한 적용 되지 않습니다. 최근, NHEJ 기반 전략에 대 한 효율적인 유전자 노크 마우스 조직8에서 개발 되었다. 그럼에도 불구 하 고, NHEJ 기반 방법 일반적으로 접합, 어렵게 정확한 게놈 편집, 프레임에 융합 유전자8를 구성 하려고 할 때 특히 생성에서 indels를 소개 합니다. MMEJ 기반 대상된 통합은 정확한 게놈 편집 가능 합니다. 그러나, 그것은 단지 겸손 하 게 이전 보고서5대상된 통합 효율성 증가. 따라서 vivo에서 정확한 타겟된 통합의 효율성 개선 시급히 필요 광범위 한 치료 응용 프로그램3합니다.
최근에 출판 된 작품에서 우리 시연 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-모든 보고 전략 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서10최고의 타겟된 통합 효율을 보여준 전략을 기반으로. 여기, 우리는 HMEJ 시스템의 설립을 위한 프로토콜을 설명 하 고 또한 관심과 기증자의 유전자를 대상으로 단일 가이드 RNA (sgRNA) 벡터의 벡터 은닉 sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 (그림 1)의 . 이 프로토콜에서 우리 또한 vivo에서조직 대상된 통합에 대 한 DNA 노크에서 마우스와 간단한 단계의 세대에 대 한 자세한 내용은 설명합니다. 또한, HMEJ 기반 전략의 개념 증명 연구 Fah 돌연변이 수정 하 고 구조 파-/- 간 실패 마우스, 더 치료 잠재력을 공개 하는 기능을 설명 했다.

<table><tbody><tr><td>pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>pAAV vector</td><td>Addgene</td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td><td>EFs promoter AAV_Actb 의해 구동되는 human codon-optimized SpCas9 인코딩을 위한 AAV 벡터</td></tr><tr><td>donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td><td>HMEJ Addgene</td><td>97308</td><td>p2A-mCherry 리포터를 마우스 Actb에 융합한 HMEJ 기증자. Actb를 표적으로 하는 EF1a promoter 및 U6 driven sgRNAs에 의해 구동되는 EGFP입니다. AAV 백본.</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 HMEJ 기증자</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>HMEJ 기증자는 p2A-mCherry 리포터를 마우스 Cdx2에 융합했습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 형질주입 시약</td><td>생명 기술</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>생명 기술</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB 버퍼 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 EndoFree-Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td>&nbsp; 마이크로피펫 풀러 (매개변수: 열, 74; 당기기, 60; 속도, 80; 시간/지연, 200; 압력, 300)</td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>셔터 기기</td><td>B100-78-10</td><td>모세관 유형 (외경 1.0 mm, 필라멘트 포함 내경 0.78 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉동 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>CM1950-Cryostat</td><td>두께&nbsp; 의&nbsp; 40&nbsp; &뮤; 엠&nbsp; 에 대한&nbsp; 뇌,&nbsp; 10 &뮤; 엠&nbsp; 에 대한&nbsp; 간</td></tr>, <tr><td>토끼, 안티-m체리</td><td>, 유전자, Tex,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Affini, 순수 염소, 안티-토끼, IgG</td><td>, 잭슨, 면역연구</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>DMEM</td>, <td>Gibco</td><td>, 11965092</td><td></td></tr>, <tr><td>FBS,</td><td>Gibco</td><td>, 10099141</td><td></td></tr>, <tr><td>NEAA,</td><td>Gibco</td>, <td>11140050</td><td></td></tr>펜<tr><td>, 스트렙, 글루타민, Gibco</td><td></td>, <td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>닝보 Sansheng 의학</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>닝보 Sansheng 의학</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>CAT#C6762</td><td></td></tr><tr><td>KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 매체 with Phenol Red</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9-중재 대상된 통합에서 vivo에서 homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

유망한 게놈 편집 플랫폼으로 서 CRISPR/Cas9 시스템 특히 transgenes 대상된 통합에 대 한 효율적인 유전자 조작에 대 한 큰 잠재력이 있다. 그러나, 동종 재결합 (HR)의 낮은 효율과 비 동종 끝 결합 (NHEJ)의 다양 한 indel 돌연변이 때문-기반 전략 비 분할 셀, vivo에서 게놈 남아 편집에 큰 도전. 여기, 우리가 설명 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-정확한 타겟 통합 효율적인 vivo에서 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로. 이 시스템에는 기증자와 타겟된 게놈 벡터 포함 하 상 동 팔 (~ 800 bp) 단일 가이드 RNA (sgRNA) 대상 시퀀스는 CRISPR/Cas9에 의해 죽 습에 의해 형벌. 이 HMEJ 기반 전략 마우스 zygotes, 뿐만 아니라 vivo에서hepatocytes에 효율적인 transgene 통합을 달성 한다. 또한, HMEJ 기반 전략은 hepatocytes에서 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파) 돌연변이의 수정에 대 한 효율적인 접근 방식을 제공 하 고 파를 구출-결핍 유발 간부 쥐. 함께, 통합 대상에 초점을 맞추고,이 HMEJ 기반 전략 유전자 변형된 동물 모델 및 타겟된 유전자 치료의 세대를 포함 하는 응용 프로그램의 다양 한 유망 도구를 제공 합니다.

HMEJ 기반 게놈 마우스 배아에서 편집: 마우스 zygotes에서 노크에 HMEJ 기반 방법의 효율성을 정의 우리 Cas9 mRNA, Cdx2 의 마지막 codon에 p2A mCherry 취재 원 유전자를 융합 설계 되었습니다 sgRNA 마우스 zygotes에 HMEJ 기증자와 Cdx2 유전자를 대상으로 전달 유전자 (그림 2A). 주입 된 zygotes blastocysts 문화에로 발전. 노크에 효율성을 평가 하 우리는 형광 현미경으로 mCherry 형광을 분석 하 고 우리는 HMEJ 기증자를 받는 blastocysts의 12.9%는 trophectoderm에서 엄격 하 게 표현 되었다 mCherry에 대 한 긍정적인 발견 (그림 2B 2 C). PCR 긍정적인 쥐, 시퀀싱에 의해 우리는 또...

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

이 HMEJ 전략의 전반적인 목표는 유전자 변형 동물 모델 및 표적 유전자 치료제 생성을 포함한 다양한 응용 분야에 유망한 유전 도구를 제공하는 것입니다. 이 HMEJ는 법안을 통과시켰습니다. 또한 유전 및 신경 분야에서 핵심 질문을 가질 수 있습니다.예를 들어, in vivo에서 전이유전자의 정밀한 표적 통합의 효율성을 개선하는 방법. 이 HMEJ 기반 전략의 주요 장점은 in vivo에서 높은 효율로 유전자 돌연변이를 교정할 수 있다는 것입니다. 그 다음에는 잠재적으로 치료가 가능합니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Xing Wang입니다. 프로토콜을 시작하려면 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS를 통해 이전에 Cas9 sgRNA EGFP 발현 벡터로 transfection된 5000개의 N2a 세포를 대조군으로 사용하여 수집합니다. 수집된 세포를 2-5마이크로리터의 용해 완충액에서 섭씨 56도에서 30분 동안 소화합니다.그런 다음 단백질 분해 효소 K를 섭씨 95도에서 10분 동안 가열하고 활성화합니다. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 중첩 PCR로 샘플을 증폭합니다. 1마이크로리터의 용해 산물을 DNA 중합효소와 sgRNA 표적 부위 주변의 염기서열을 인식하는 한 쌍의 외부 프라이머와 혼합하고 총 20마이크로리터의 부피에서 1차 PCR을 수행합니다.다음으로, DNA 중합효소를 섭씨 95도에서 5분 동안 활성화한 다음 섭씨 72도에서 5분 동안 최종 연장으로 1차 PCR을 수행합니다. 1마이크로리터의 1차 PCR 산물과 한 쌍의 중첩된 내부 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 수행합니다. 20 마이크로리터의 1x TC7EI 반응 완충액에서 300-600 나노그램의 정제된 PCR 생성물을 변성 및 재어닐링합니다.어닐링된 PCR 산물에 1마이크로리터의 T7EI 효소를 첨가하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 소화합니다. 그런 다음 분해 산물을 2% 아가로스 젤과 1x TAE 버퍼에서 120볼트에서 40분 동안 단편이 분리될 때까지 실행합니다. ImageJ를 사용하여 cut 및 uncut DNA의 밴드 강도를 결정하고 indel frequency를 계산합니다.Cas9 mRNA 준비를 위해 PCR 증폭을 통해 T7 promoter sequence를 Cas9 coding region에 추가합니다. 다음으로, 0.1 마이크로몰의 최종 농도와 20 나노그램의 Cas9 발현 벡터에서 프라이머 Cas9 FR

crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 Cas9 및 sgRNA가 세포에 단일 플라스미드 구조로 제공되는 배양 세포에서 올인원 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집을 시연합니다. CRISPR-Cas9 시스템과 삽입하고자 하는 유전자는 전기천공법을 통해 세포에 도입되어 성공적인 유전자 편집을 가능하게 했습니다.

All-in-one CRISPR 게놈 편집: CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 배양된 세포에서 상동성 유도 복구 기반 유전자 knock-in 방법

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

이 연구는 동형접합 메뚜기 돌연변이의 CRISPR/Cas9 리보뉴클레아제 기반 구성의 체계적으로 최적화된 절차와 메뚜기 알의 냉동 보존 및 소생을 위한 상세한 방법을 제공합니다.

CRISPR/Cas9 기술을 이용한 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이 구축

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

학습하세요 CRISPR/Cas9과 HMEJ 전략을 활용한 생체내 정밀 유전자 표적 통합 기법을 통해 유전자 변형 동물 모델 생성 및 유전자 치료의 효율성을 높이는 방법을 탐구하세요.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

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