CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

이 HMEJ 전략의 전반적인 목표는 유전자 변형 동물 모델 및 표적 유전자 치료제 생성을 포함한 다양한 응용 분야에 유망한 유전 도구를 제공하는 것입니다. 이 HMEJ는 법안을 통과시켰습니다. 또한 유전 및 신경 분야에서 핵심 질문을 가질 수 있습니다.

예를 들어, in vivo에서 전이유전자의 정밀한 표적 통합의 효율성을 개선하는 방법. 이 HMEJ 기반 전략의 주요 장점은 in vivo에서 높은 효율로 유전자 돌연변이를 교정할 수 있다는 것입니다. 그 다음에는 잠재적으로 치료가 가능합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Xing Wang입니다. 프로토콜을 시작하려면 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS를 통해 이전에 Cas9 sgRNA EGFP 발현 벡터로 transfection된 5000개의 N2a 세포를 대조군으로 사용하여 수집합니다. 수집된 세포를 2-5마이크로리터의 용해 완충액에서 섭씨 56도에서 30분 동안 소화합니다.

그런 다음 단백질 분해 효소 K를 섭씨 95도에서 10분 동안 가열하고 활성화합니다. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 중첩 PCR로 샘플을 증폭합니다. 1마이크로리터의 용해 산물을 DNA 중합효소와 sgRNA 표적 부위 주변의 염기서열을 인식하는 한 쌍의 외부 프라이머와 혼합하고 총 20마이크로리터의 부피에서 1차 PCR을 수행합니다.

다음으로, DNA 중합효소를 섭씨 95도에서 5분 동안 활성화한 다음 섭씨 72도에서 5분 동안 최종 연장으로 1차 PCR을 수행합니다. 1마이크로리터의 1차 PCR 산물과 한 쌍의 중첩된 내부 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 수행합니다. 20 마이크로리터의 1x TC7EI 반응 완충액에서 300-600 나노그램의 정제된 PCR 생성물을 변성 및 재어닐링합니다.

어닐링된 PCR 산물에 1마이크로리터의 T7EI 효소를 첨가하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 소화합니다. 그런 다음 분해 산물을 2% 아가로스 젤과 1x TAE 버퍼에서 120볼트에서 40분 동안 단편이 분리될 때까지 실행합니다. ImageJ를 사용하여 cut 및 uncut DNA의 밴드 강도를 결정하고 indel frequency를 계산합니다.

Cas9 mRNA 준비를 위해 PCR 증폭을 통해 T7 promoter sequence를 Cas9 coding region에 추가합니다. 다음으로, 0.1 마이크로몰의 최종 농도와 20 나노그램의 Cas9 발현 벡터에서 프라이머 Cas9 FR을 1x 고충실도 DNA 중합효소 혼합물에 첨가합니다. 뉴클레아제가 없는 물로 최종 부피를 50마이크로리터로 조정합니다.

DNA 중합효소를 섭씨 95도에서 5분간 활성화하고 PCR을 실시합니다. T7 Cas9 및 PCR 산물을 체외 전사(in vitro transcription, IVT)를 위해 정제합니다. 그런 다음 mRNA 전사 키트를 사용하여 섭씨 37도에서 8시간 동안 총 20마이크로리터의 DNA를 0.5-1마이크로그램으로 전사합니다.

혼합물에 1마이크로리터의 DNase를 첨가하여 DNA 주형을 섭씨 37도에서 15분 동안 제거합니다. 섭씨 37도에서 45분 동안 폴리(A)테일을 추가한 후 RNA 정제 키트로 Cas9 mRNA를 회수합니다. 이전 섹션에서 수행한 것처럼 충실도가 높은 DNA 중합효소를 가진 T7 promoter에 의해 구동되는 sgRNA template을 생성하고 벡터를 포함하는 sgRNA scaffold를 template으로 선택합니다.

T7 sgRNA PCR 산물을 정제한 후 0.5-1마이크로그램의 DNA를 섭씨 37도에서 6시간 동안 총 20마이크로리터의 짧은 RNA 전사 키트를 사용하여 sgRNA의 체외 전사를 위한 주형으로 사용합니다. 6시간 배양 후 혼합물에 1마이크로리터의 DNase를 첨가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양을 계속하여 DNA 템플릿을 제거합니다. RNA purification kit를 사용하여 sgRNA를 다시 정제합니다.

RNase 자유수에 sgRNA를 마이크로리터당 500나노그램으로 희석하고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 최대 3개월 동안 보관합니다. 변성이 없는 고품질의 Cas9 mRNA 및 sgRNA와 올바른 HMEJ donor parameters 라인은 knock-in 마우스 생성에서 가장 중요한 단계입니다. 수정된 배아를 이산화탄소가 5%인 인큐베이터에서 섭씨 37도의 KSOM 배지에 넣습니다.

Cas9 mRNA의 마이크로리터당 100나노그램, sgRNA의 마이크로리터당 50나노그램, HMEJ 공여체 벡터의 마이크로리터당 100나노그램을 혼합하고 물을 첨가하여 최종 부피를 10마이크로리터로 조정합니다. 혼합물을 위아래로 피펫으로 만들고 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 마이크로피펫 풀러를 사용하여 모세관 바늘을 당깁니다.

일정한 유량 설정의 마이크로인젝터를 사용하여 밀리리터당 5마이크로그램의 사이토칼라신 B를 함유하는 HEPES-CZB 배지 방울에 잘 정의된 프로핵을 가진 접합자의 세포질에 가능한 부피의 혼합물을 주입합니다. 마지막으로, 주입된 접합자를 KSOM 배지에서 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 형광 관찰을 위해 3 1/2일 후 배반포 단계까지 배양합니다. 주사 3일 후, HMEJ 기증자를 받은 배반포의 12.9%가 영양배엽에서 엄격하게 발현된 mCherry에 대해 양성이었습니다.

PCR 양성 마우스의 염기서열분석을 통해 조사된 모든 통합 이벤트는 5개의 프라임 접합과 3개의 프라임 접합 모두에서 정밀한 인-프레임 통합이었습니다. 주사 7일 후, 면역형광 영상에서 형질주입된 간세포의 거의 절반이 간 절편에서 염색된 mCherry를 발현하는 것으로 나타났습니다. NTBC를 철회한 후, Fah HMEJ 및 Cas9 구조체를 투여받은 Fah 음성 마우스의 Fah 교정 간세포의 면역조직화학 간 염색은 MMEJ 기반 방법보다 더 효과적인 증식을 보여주었습니다.

HMEJ 기반 전략은 돌연변이의 일부와 같은 돌연변이 염기서열을 올바른 염기서열로 대체하기 위한 이상적인 플랫폼이 될 수 있습니다. HHEJ 기반 방법에는 적용되지 않습니다. 이 실험 후, 이 치료법은 연구자들이 광범위한 치료 응용 분야를 탐구할 수 있는 정확한 표적 통합 분야로 나아갈 수 있는 길을 열어줍니다.