Name: 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 16S rRNA 증폭자 시퀀싱을 활용한 대변 미생물 특성화 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 호기성 및 혐기성 박테리아를 포함한 미생물 군집을 효율적으로 분석하여 대규모 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품-코어 프로그램 (부여 번호 41/11), 이스라엘 과학 재단 (그랜트 908/15), 유럽 크 론 및 Colitis 조직 (헴)에 의해 부분적으로 지원 되었다.

연구를 위한 윤리적인 승인 했다 시바 지역 연구 윤리 위원회에 의해 그리고 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 합니다. 프로토콜 받은 환자 동의 예외 지역 윤리 검토 보드에서 사용 했다 배설물 소재부터 이미 제출 했다 미생물학 코어 나이, 다른 환자 식별 정보 없이 임상 검사 결과의 일부로 서 성별와 미생물 결과 이다입니다. 작성, 동의 건강 한 지원자에서 얻은 고 기관 검토 위원회 승인 연구. 그 샘플 중 일부는 이미 이전 분석1에 포함 되었습니다.
1. 샘플 처리
<ol><li>수집 된 약 5 m m2 얼룩 (대략 연필 지우개의 크기) 테스트에서 멸 균 면봉으로 신선한 배설물 샘플에서 튜브 ( 재료의 표참조). 24 시간 이내-80 ° C에서 배설물 샘플을 포함 하는 모든 면봉을 저장 합니다. 지저분한 면봉 추가 처리까지 거기 남아 있을 수 있습니다.</li>
</ol>2. DNA 추출
<ol><li>추출 및 희석 솔루션 실 온에서 해 동 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>이동 빈 2 mL 컬렉션에 지저분한 면봉 튜브 ( 재료의 표참조). 크기를 조정할 면봉 스틱 절단 하 여 교차 오염을 최소 관 폐쇄를 사용 하는 깨끗 한가 위를 사용 하 여. 지저분한 면봉 및 혼합 소용돌이 포함 하는 각 컬렉션 튜브를 추출 솔루션의 250 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>끓는 물 탕에서 10 분 샘플 열 (95-100° C). 각 샘플을 소용돌이를 섞어 희석 솔루션의 250 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>추출 된 DNA와 4 ° c.에 면봉을 포함 하는 2 mL 튜브를 저장</li>
</ol>3. PCR 및 라이브러리 준비
3.1 및 3.2 단계, 깨끗 한, 제공 하는 PCR 워크스테이션에서 작동 템플릿과 amplicon 무료 환경.
<ol><li>라벨 바코드에 따라 프라이 머 (표 1). 두 배 증류수 (DDW) 50 μ M 농도-20 ° c.에가을에서 각 뇌관을 희석</li>
	<li>96 잘 접시를 사용 하 여 PCR 반응에 대 한. 각 플레이트는 32 다른 인덱스 뇌관에 의해 표 32 다른 샘플을 포함할 수 있습니다. 앞으로 뇌관 및 실 온에서 32 역 뇌관 thaw 그리고 5 μ M에 그들을 희석.</li>
	<li>5 μ M 앞으로 뇌관, 1 mL 2 X PCR 마스터 믹스, 그리고 400 μ DDW의 100 μ를 혼합 하 여 100 반응 (각 잘에서 최종 볼륨 20 μ를 있을 것입니다)에 대 한 PCR 반응 혼합을 준비 합니다. 각 잘 (총 96 웰 스)이 PCR 혼합의 15 μ를 넣어. 3 다른 웰 스 (triplicates에서 32 다른 뇌관 96 웰 스의 총을 제공)을 각 5 μ M 역 인덱싱된 뇌관의 1 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>사전-PCR 전용된 영역에서 의미는 템플릿과 amplicon 무료, 클린 벤치 추가 각 추출 된 DNA 샘플의 4 μ 반응 혼합물에 (각 추출 된 DNA 샘플 3 중에서 증폭-96 잘 접시 당 32 샘플).</li>
	<li>다음 설정으로 PCR을 실행: 3 분;에 대 한 94 ° C의 초기 변성 뒤에 1 분, 1 분, 그리고 1 분; 72 ° C에서 확장 하는 55 ° C에서 열 처리 변성 94 ° C에서의 35 주기 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.</li>
	<li>게시물-PCR 전용된 영역으로 정의 됩니다, 다른 벤치에 단일 볼륨 관 (60 μ 샘플 당)으로 각 triplicate PCR 반응 결합.</li>
	<li>PCR amplicons의 품질 평가, ethidium 평범한 사람 얼룩이 1 %agarose 젤에 각 결합 PCR 반응의 4 μ를 실행 합니다. 260의 UV 파장에서 nm, 긍정적인 amplicons 375-425 bp의 예상된 밴드 크기에 표시 됩니다. 이러한 amplicons만 후속 단계에 포함 됩니다. 참고: 각 샘플은 각 샘플 3 다른 PCR 반응에서 증폭 되어 triplicate, 의미에서 증폭 된다. 확장 하지 마십시오.</li>
</ol>4. 도서관 정량화 및 청소
<ol><li>얻기 위해서 모든 PCR 샘플의 아데닌 농도 수영장, 두 배 좌초 된 DNA에 의해 각 amplicon 계량 (dsDNA 계량 시 약) 형광 핵 산 얼룩 ( 재료의 표참조), 큰의 동시 정량화에 적합 샘플의 크기입니다. 참고: 이후는 amplicon의 크기 범위는 다의 적, nanograms에 실제 금액 아데닌 농도 로드 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>단일, 무 균 튜브에 각 샘플의 조합 500 ng. 소용돌이를 섞어입니다.</li>
	<li>Ethidium 평범한 사람 얼룩이 1 %agarose 젤에 풀링된 도서관의 200 μ를 실행 합니다. 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤에서 375-425 bp 밴드를 추출 ( 재료의 표참조) 및 80 μ DDW에서에서 풀링된 라이브러리 elute. 참고: 풀링된 라이브러리 크기 호스트 DNA에서에서 일반적인 증폭 제품을 선택 해야 합니다.</li>
	<li>매우 민감한 dsDNA 키트 제조업체의 지침에 따라 검색을 사용 하 여 최종 라이브러리 농도 측정 ( 재료의 표참조). 제조업체의 지침에 따라 DNA 라이브러리에 대 한 매우 민감한 분리 및 분석 키트를 사용 하 여 정확한 라이브러리 크기 측정 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>5입니다. 시퀀싱
<ol><li>오후 7 시에 20% 컨트롤 라이브러리의 추가 함께 풀링된 라이브러리를 희석 ( 재료의 표참조), 시퀀싱 시스템 프로토콜에 따라.</li>
	<li>시퀀싱에 대 한 사용 하 여 사용자 정의 설계 무료 v 4 증폭 뇌관 ( 표 1참조)에 뇌관 읽기.</li>
	<li>3 사용 하 여 사용자 지정 설계 된 시퀀싱 뇌관 추가에 바코드를 읽는 주기 ( 표 1참조) 하 고 제조업체의 사양에 따라 각 방향으로 길이 175 기지의 쌍 간 읽기를 생성 합니다.</li>
	<li>시퀀싱 컴퓨터를 실행 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 FASTQ 파일을 구하십시오.</li>
</ol>6입니다. 데이터 처리
<ol><li>함께 꿰 매 고 QIIME 2 버전 2017.7.017에서 구현 된 데이터 큐레이터 파이프라인에서 겹치는 쌍-엔드 FASTQ 파일을 처리 합니다. 샘플 특정 바코드에 따라 읽기 demultiplex</li>
	<li>DADA218 를 사용 하 여 품질 관리 및 시퀀스 변종 (SVs) 감지. 2 개 이상의 예상 오류 삭제 읽고 3' 끝에서 13 기지와 5' 끝에서 15 기지에서 읽기를 자릅니다. 식별 하 고 일치 메서드를 사용 하 여 키메라를 제거-키메라 샘플에서 개별적으로 검색 되 고 시퀀스에 충분 한 샘플 공상 발견 제거 됩니다.</li>
	<li>SVs 분류학 분류 Naive Bayes 장착 분류자를 사용 하 여 수행, 8 월 2013에 훈련 99% 신원 Greengenes6, 175 데이터베이스 오래 읽기 및 설정/역회전 뇌관.</li>
	<li>2146 시퀀스의 깊이에 모든 샘플 rarefy</li>
	<li>Β에 희박된 샘플 (샘플 다양성19,20) 사이 다양성의 측정을 위한 Unweighted UniFrac를 사용 하 여 샘플 크기 효과 피하기 위해.</li>
	<li>주 좌표 분석 (PCoA) 수행 결과 거리 매트릭스를 사용 합니다. 참고: 데이터 처리 스크립트 및 매핑 파일 (보충 자료 1 과 2) 보충 자료로 제공 됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

16S rRNA amplicon 및 metagenomics 샷건 시퀀싱 임상 미생물학 응용 프로그램21,22,23에서 인기를 얻고 있다. 이러한 기술은 캡처 culturable와 비 culturable taxa, 병원 성 inoculum 그리고 더 정확 하 게 polymicrobial 감염을 식별 하는 능력의 상대적 풍요에 대 한 데이터를 제공 하는 증가 기능에 유리한 24지문. 미생물 연구의 분야에서 진보는 다양 한 접근법에 일관성의 부족으로 인해 쉽게 비교할 데이터의 방대한 생성. 최근 몇 년 동안, 여러 컨소시엄은 이러한 문제를 해결 하려고 했습니다. 이 프로토콜 지구 microbiome 프로젝트 (EMP)와 비슷한 라이브러리 준비는 다음과 같습니다. 그러나, 추가 분석 파이프라인을 통해 배설물 샘플에서 DNA 추출에 대 한 자세한 단계별 프로토콜이입니다.
<p clas...

미생물 다양 성과 풍요, 건강 하 고 병 적인 조건에 개인 간의 유사성과 차이점을 캡처의 또 다른 측면으로 이해에 집중된 노력 되었습니다. 나이2,3, 지리4, 라이프 스타일5,6및 질병5 창 자 미생물의 성분과 관련 된 것으로 표시 했다 하지만 많은 조건과 인구 아직 되지 않은 완전히 특징. 최근에 미생물 치료 응용 프로그램7,,89수정할 수 있습니다 보고 되었습니다. 따라서, 다양 한 생리 적 조건 및 미생물 구성 사이의 관계에 대 한 추가 통찰력의 잠재적인 미래 수정 최적화 향한 첫 번째 단계입니다.
전통 미생물 문화 방법 낮은 수율10,11에 의해 제한 되 고 중 박테리아가 이진 상태로 개념화에 현재의. 높은 처리량 DNA 기반 시퀀싱 미생물 생태학, 미생물 커뮤니티의 모든 구성원의 캡처 수 있도록 혁명을 했다. 그러나, 시퀀스 길이 품질 유지 정확한 분류 할당12중요 한 장벽을 읽기. 또한, 높은 처리량 기반된 실험 측정 비 생물학 또는 비 과학적인 변수13에 의해 영향을 받는 배치 효과에서 고통을 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 여러 프로그램 미국의 직감 프로젝트, 미국 (미국) 인간 Microbiome 프로젝트 및 영국 (영국) MetaHIT 프로젝트를 포함 하 여 인간의 미생물 연구 설립 되었습니다. 이 이니셔티브는 그들의 접근에 일관성의 부족으로 인해 쉽게 비교할 데이터의 방대한 생성. 다양 한 국제 인간 Microbiome 컨소시엄, 국제 인간 Microbiome 표준 프로젝트, 국립 표준 및 기술 (NIST) 같은 국제 프로젝트14 이러한 문제의 일부를 해결 하려고 , 신뢰할 수 있는 생식 결과의 달성을 사용 해야 미생물 측정에 대 한 표준을 개발 하 고. 여기에 설명 된 여러 광범위 하 게 사용 되는 방법15,16 16S rRNA 높은 처리량 (16S-seq)을 시퀀싱 시작 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서에 대 한 통합 된 프로토콜이입니다. 열 무료 PCR 접근, 식물 DNA16의 직접 추출에 대 한 원래 설계 된 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 배설물의 많은 수의 동시 처리를 비교적 짧은 시간에 높은 품질의 샘플 타겟 DNA을 증폭 시퀀싱의 미생물 변수 v 4 지역의 일반적인 시퀀싱 플랫폼. 이 프로토콜 과학자 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 사용을 시작 하는 강력한, 생식, 사용 하기 쉬운, 상세한 방법에 관심이 중요 한 컨트롤을 사용 하 여 안내 하는 것을 목표로. 가이드 및 상세한 단계-의해 단계 프로토콜 배치 효과 최소화할 수 있습니다 고 따라서 연구소 사이 더 비교 시퀀싱 결과 허용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>추출 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>희석 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi 핫스타트 ReadyMix PCR 키트</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR 마스터 믹스</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 시약 키트</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA 시약 정량화</td></tr><tr><td>MinElute Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>초순수 Dnase 및 Rnase Free</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>분자 프로브</td><td>Q32854</td><td>dsDNA 검출 키트</td></tr><tr><td>고감도 D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>스크린 테이프 5067-5582</td><td>분리 및 분석</td></tr><tr><td>DNA 라이브러리용</td><td>스크린 테이프 분석</td><td>Agilent Technologies</td><td>시약 5067-5583</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>15017666</td><td>제어 라이브러리</td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v2(500 사이클)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 수집 튜브</td><td>SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>안전 밀봉 수집 튜브</td></tr><tr><td>PP 시험관에 플라스틱 스틱 면봉</td><td>STERILE INTERIOR</td><td>23117</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>응용 Biosystems</td><td>2720 열 순환기</td><td></td></tr><tr><td>시퀀싱 기계</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>PCR 워크스테이션</td><td>Biosan</td><td>UV 클리너</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>볼텍서</td><td>과학 산업</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

16s rrna amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

인간 장 미생물 부상에서 세포를 보호, 에너지와 영양소, 처리 및 면역 증진에 중심 역할을 한다. 건강 한 microbiota 구성 (dysbiosis)으로 간주 됩니다에서 편차 pathologic 조건에 선도 하는 중요 한 기능에 악영향을 줄 수 있습니다. 최근 지속적인 연구 노력 미생물 구성 및 인류 건강 및 질병 사이 협회의 특성으로 지시 되어 있다.
높은 처리량 시퀀싱 기술의 발전 창 자 미생물 구성의 특성을 사용합니다. 이러한 방법에는 16S rRNA amplicon 시퀀싱 및 샷건 시퀀싱 포함 됩니다. 16S rRNA amplicon 시퀀싱 샷건 시퀀싱 유전자 예측 및 주석 기능에 대 한 추가 정보를 제공 하는 동안 분류학 구성, 프로 파일링 하는 데 사용 됩니다. 16S rRNA 유전자 변수 지역의 타겟된 시퀀싱 메서드를 사용 하는 이점은 샷건 시퀀싱에 비해 현저히 낮은 비용입니다. 16S rRNA 유전자에서 순서 차이 식별 하 여 다른 taxa는 개별 샘플 내에서 계량 미생물 지문으로 사용 됩니다.
주요 국제적인 노력 16S rRNA amplicon 시퀀싱에 대 한 표준 입 대 했습니다. 그러나, 몇몇 연구 보고 배치 효과 의해 발생 하는 변이의 일반적인 소스. 이 효과, 샘플 수집, 제복을 입은 프로토콜을 최소화 하기 위해 처리 및 시퀀싱을 구현 합니다. 이 프로토콜은 배설물 샘플 컬렉션에서 데이터 분석을 시작 하는 광범위 하 게 사용된 프로토콜의 통합을 제안 합니다. 이 프로토콜 열-무료, 직접 PCR 접근 동시 처리 및 v 4 지역의 PCR 증폭 함께 배설물 샘플의 많은 수의 DNA 추출 가능 하 게 포함 되어 있습니다. 또한, 프로토콜 분석 파이프라인을 설명 하 고 QIIME (QIIME 2 버전 2017.7.0 및 DADA2)의 최신 버전을 사용 하 여 스크립트를 제공 합니다. 이 단계별 프로토콜 강력한, 생식, 사용 하기 쉬운, 상세한 방법에 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 사용을 시작에 관심이 안내 목적 이다.

프로토콜의 도식 적인 그림은 그림 1에 표시 됩니다.
우리는 prospectively 의심된 전염 성 설사로 입원된 환자에서 대변 샘플을 수집. 그 샘플으로는 앞에서 설명한1시바 메디컬 센터 2 월과 5 월 2015 년 사이 임상 미생물학 실험실에 제출 했다. 대변 샘플 임상 미생물학 실험실에서 수행 하는 기존의 미생물 문화 그리고 광범위 높은 처리량 16S-seq 동시에 받게 되었다. 또한, 건강 한 성인에서 대변 샘플 비교에 대 한 시퀀싱 했다.
이 분석에서 데이터 및 QIIME217에서 얻은 출력의 대표적인 결과의...

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

이 고처리량 16S rRNA-Amplicon 염기서열분석의 전반적인 목표는 분변 샘플에서 시작하여 글로벌 마이크로바이옴 구성을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 신진대사, 소화, 장 및 전신 염증과 같은 많은 관심 분야와 관련된 전반적인 미생물 구성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배양하기 어려운 박테리아를 포함하여 배설물 샘플에 존재하는 호기성 및 혐기성 미생물 군집의 인구 조사를 제공한다는 것입니다.이 방법은 신속한 무결장 처리 펌프 라인 덕분에 많은 수의 대변 샘플을 동시에 처리할 수 있으며 강력하고 재현성 있는 16S rRNA-Amplicon 염기서열분석을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜의 경우 대략 연필 지우개 크기의 냉동 대변 샘플이 있어야 합니다. 샘플은 채취 면봉의 끝을 잘라낸 상태로 2개의 밀리리터 튜브에 보관해야 합니다.대변이 없는 면봉과 내부 중복 대조군으로 구성된 음성 대조군을 포함하고, 내부 대조군 역할을 하기 위해 원래 대변 샘플에서 중복된 샘플을 갖습니다. 추출 및 희석 용액을 배설물 샘플 및 대조 샘플과 함께 실온에서 해동하는 것으로 시작합니다. 해동되면 각 샘플 튜브에 250마이크로리터의 추출 용액을 추가하고 와류를 사용하여 대변을 용액에 혼합합니다.이 시점에서 버퍼 전용 음수 컨트롤을 소개합니다. 다음으로, 끓는 물 중탕에서 샘플을 10분 동안 가열합니다. 끓는 물에서 배양한 후 각 샘플에 250마이크로리터의 희석 용액을 추가하고 혼합할 샘플을 와류로 만듭니다.그런 다음 PCR을 수행할 수 있을 때까지 샘플 튜브를 섭씨 4도에서 보관합니다. 템플릿 및 앰플리콘과 같은 잠재적인 DNA 오염 물질이 제거된 pre-PCR 워크스테이션에서 PCR을 설정합니다. 바코드에 따라 프라이머에 라벨을 붙이고 이중 증류수에 50마이크로몰 농도로 희석합니다.희석된 프라이머의 재고는 섭씨 영하 20도에서 보관하고 완전히 해동한 후 사용하십시오. 각 샘플에 대해 32회 반응할 수 있도록 96웰 플레이트를 준비합니다. 실온으로 데운 후 정방향 프라이머와 32개의 역방향 프라이머의 부분 표본을 PCR용 5마이크로몰로 희석합니다.그런 다음 100회 반응에 충분한 염기 PCR 혼합물을 준비합니다. 100마이크로리터의 5마이크로몰 포워드 프라이머와 1밀리리터의 2X PCR 마스터 믹스 및 400마이크로리터의 이중 증류수를 결합합니다. 이 혼합물을 소용돌이친 다음 이 혼합물 15마이크로리터를 96개의 웰 각각에 로드합니다.다음으로, 각각 1마이크로리터의 5마이크로몰 역 프라이머가 있는 3개의 웰 세트를 로드합니다. 따라서 32개의 서로 다른 역 인덱스를 모두 플레이트에 로드합니다. 그런 다음 모든 플레이트 웰에 추출된 DNA 샘플 4마이크로리터를 추가합니다.이것은 깨끗한 벤치에서 수행됩니다. 이제 3분 초기 변성으로 PCR을 실행한 다음 1분 동안 변성하고 섭씨 55도에서 무릎을 꿇고 1분 동안 연장하는 35주기로 PCR을 실행합니다. 10분 최종 연장으로 마무리합니다.반응이 완료된 후 PCR 후 전용 작업대에서 작업합니다. 여기에서 각 삼중 PCR 산물 세트를 샘플당 60마이크로리터의 단일 튜브로 결합합니다. 그런 다음 각 샘플의 4마이크로리터를 에티듐 브로마이드가 염색된 1%아가로스 겔에 실행합니다.양의 Amplicon은 375 및 425 염기쌍 사이에 나타납니다. 음성 대조군이 표시되고 연구 양성 Amplicons와 함께 처리됩니다. 제조업체 지침에 따라 양성 반응 산물의 DNA 농도를 정량화합니다.그런 다음 각 제품의 DNA 500나노그램을 단일 튜브에 결합합니다. 이 혼합물을 소용돌이치고 이전과 같이 1% 젤에 200마이크로리터를 소진합니다. 이제 겔에서 375 및 425 염기쌍 사이의 밴드를 추출합니다.다음으로, 염기서열분석을 위해 라이브러리를 준비합니다. 제조업체 지침에 따라 고감도 이중 가닥 DNA 검출 키트를 사용하여 농도를 측정한 다음 고감도 분리 및 분석 키트를 사용합니다. 그런 다음 라이브러리를 7 피코몰러로 희석하고 대조군 라이브러리와 4 대 1로 결합합니다.이제 샘플의 염기서열분석 준비가 되었으므로 염기서열분석 기계로 옮깁니다. 대변 샘플로부터 라이브러리 준비를 위해 설명된 방법은 감염성 설사가 의심되어 입원한 환자의 마이크로바이옴을 분석하는 데 사용되었습니다. 이와 동시에 대변 샘플도 미생물학 실험실에서 전통적인 배양을 받았습니다.비교를 위해 건강한 성인의 대변 샘플을 염기서열분석했습니다. 여러 음성 대조군 샘플, 주형이 없는 PCR, 추출 및 희석 용액의 깨끗하고 멸균된 면봉에 대한 PCR, 혼합 추출 및 희석 용액에 대한 PCR이 포함되었습니다. 이들 각각은 총 118개 미만의 판독을 가졌으며 주로 Mycoplasm 분류군이었습니다.표준 샘플은 품질 관리 후 Mycoplasma의 식별 없이 평균 10, 000회 이상 판독되었습니다. 샘플의 일관성 및 변동성은 각 샘플에서 두 개의 서로 다른 라이브러리를 구성하기 위해 두 개의 서로 다른 바코드 프라이머로 준비된 16개의 대변 샘플을 사용하여 측정되었습니다. 샘플의 절반은 전통적인 배양 기법에서 캄필로박터 살모넬라균 또는 시겔라균에 양성이었습니다.16S 염기서열분석 결과를 사용하여 phylo 수준의 면적 플롯은 기존 배양 결과와 독립적으로 동일한 샘플에서 만들어진 라이브러리 간의 일관성을 보여줍니다. 이 16개 쌍의 샘플 풀에서 주요 좌표 분석을 통해 샘플 쌍이 밀접하게 정렬되어 있으며 양성 배양 샘플이 음성 배양 샘플과 유의하게 다른 PC1 값을 갖는 것으로 나타났습니다. 샘플에 대한 추가 분석에서는 높은 수준의 프로테오박테리아가 입원한 환자에서만 발견되는 것으로 나타났습니다.이 동영상을 시청한 후에는 무결장 DNA 추출과 PCR을 사용하여 많은 수의 대변 샘플을 동시에 처리하여 미생물 변수 V4 영역의 바코드 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 특히 라이브러리를 준비할 때 체계적이고 깨끗한 환경에서 작업해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 사람의 대변 샘플로 작업하는 것은 위험하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

guided-protocol-for-fecal-microbial-characterization-16s-rrna

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 결장 종양 보유 마우스의 대변 샘플에서 DNA 분리 프로토콜에 대해 설명합니다. 추출된 DNA는 PCR을 사용하여 증폭되고 생성물은 마그네틱 비드 기반 접근법을 사용하여 추가로 세척됩니다. 이 방법은 대장 미생물총(microbiota) 및 동물 폐사율에 대한 환경 풍부화의 영향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

대변 미생물 DNA 분리: 쥐 종양 모델의 미생물 군집 다양성에 대한 환경 풍부화의 영향 연구

미생물 군집을 특성화하는 것은 환경 미생물학의 오랜 목표였습니다. 차세대 염기서열분석 방법을 통해 이제 최소한의 비용과 노동력으로 전례 없는 깊이로 미생물 군집의 특성을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 벤치탑 염기서열분석기를 사용하여 박테리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 염기서열분석하는 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

여기, 선물이 위장 장 관의 생리 조건을 시뮬레이션 bioreactors의 시리즈를 사용 하 여 콜론 생체 외에서, 의 본질적인 microbiota 경작을 위한 프로토콜.

인간의 본질적인 Microbiota 공부 기술을 경작 하는 체 외에서 고급 적용

이 프로토콜은 인체 배설물 미생물의 체외 배치 배양 발효 시스템을 설명하며, 이눌린(잘 알려진 프리바이오틱 및 가장 널리 연구된 미생물 변조기 중 하나)을 사용하여 특정 한 효과의 효과를 추정하는 데 이 시스템의 사용을 입증합니다. 대변 미생물 구성 및 대사 활동에 대한 개입.

인체 배설물 미생물에 대한 중재 식이요법의 효과를 추정하는 시험관 내 배치 배양 모델

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

우리는 수생 서식지에서 탄화수소 분해 박테리아를 분리, 번식 및 특성화하는 과정을 제시합니다. 이 프로토콜은 박테리아 분리, 16S rRNA 방법에 의한 식별 및 탄화수소 분해 가능성 테스트에 대해 설명합니다. 이 기사는 연구자들이 환경 샘플에서 미생물 생물 다양성을 특성화하고 특히 생물학적 정화 가능성이 있는 미생물을 선별하는 데 도움이 될 것입니다.

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats(수생 서식지에서 탄화수소 대사 특성을 가진 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별)

Pyrosequencing은 박테리아를 식별하는 균주를 구별하고, 항균 에이전트에 저항성을 부여하는 유전자 변이를 감지하는 데 사용할 수있는 미생물 게놈 시퀀싱을 용이하게하는 다양한 기술입니다. 이 비디오에서는, 미생물 amplicon의 생성,의 amplicon의 pyrosequencing 및 DNA 염기 서열 분석을위한 절차를 설명합니다.

미생물 식별 및 특성화를위한 Pyrosequencing

배우세요 16S rRNA 증폭자 시퀀싱을 활용한 대변 미생물 특성화 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 호기성 및 혐기성 박테리아를 포함한 미생물 군집을 효율적으로 분석하여 대규모 연구에 활용할 수 있습니다.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

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