16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

이 고처리량 16S rRNA-Amplicon 염기서열분석의 전반적인 목표는 분변 샘플에서 시작하여 글로벌 마이크로바이옴 구성을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 신진대사, 소화, 장 및 전신 염증과 같은 많은 관심 분야와 관련된 전반적인 미생물 구성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배양하기 어려운 박테리아를 포함하여 배설물 샘플에 존재하는 호기성 및 혐기성 미생물 군집의 인구 조사를 제공한다는 것입니다.

이 방법은 신속한 무결장 처리 펌프 라인 덕분에 많은 수의 대변 샘플을 동시에 처리할 수 있으며 강력하고 재현성 있는 16S rRNA-Amplicon 염기서열분석을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜의 경우 대략 연필 지우개 크기의 냉동 대변 샘플이 있어야 합니다. 샘플은 채취 면봉의 끝을 잘라낸 상태로 2개의 밀리리터 튜브에 보관해야 합니다.

대변이 없는 면봉과 내부 중복 대조군으로 구성된 음성 대조군을 포함하고, 내부 대조군 역할을 하기 위해 원래 대변 샘플에서 중복된 샘플을 갖습니다. 추출 및 희석 용액을 배설물 샘플 및 대조 샘플과 함께 실온에서 해동하는 것으로 시작합니다. 해동되면 각 샘플 튜브에 250마이크로리터의 추출 용액을 추가하고 와류를 사용하여 대변을 용액에 혼합합니다.

이 시점에서 버퍼 전용 음수 컨트롤을 소개합니다. 다음으로, 끓는 물 중탕에서 샘플을 10분 동안 가열합니다. 끓는 물에서 배양한 후 각 샘플에 250마이크로리터의 희석 용액을 추가하고 혼합할 샘플을 와류로 만듭니다.

그런 다음 PCR을 수행할 수 있을 때까지 샘플 튜브를 섭씨 4도에서 보관합니다. 템플릿 및 앰플리콘과 같은 잠재적인 DNA 오염 물질이 제거된 pre-PCR 워크스테이션에서 PCR을 설정합니다. 바코드에 따라 프라이머에 라벨을 붙이고 이중 증류수에 50마이크로몰 농도로 희석합니다.

희석된 프라이머의 재고는 섭씨 영하 20도에서 보관하고 완전히 해동한 후 사용하십시오. 각 샘플에 대해 32회 반응할 수 있도록 96웰 플레이트를 준비합니다. 실온으로 데운 후 정방향 프라이머와 32개의 역방향 프라이머의 부분 표본을 PCR용 5마이크로몰로 희석합니다.

그런 다음 100회 반응에 충분한 염기 PCR 혼합물을 준비합니다. 100마이크로리터의 5마이크로몰 포워드 프라이머와 1밀리리터의 2X PCR 마스터 믹스 및 400마이크로리터의 이중 증류수를 결합합니다. 이 혼합물을 소용돌이친 다음 이 혼합물 15마이크로리터를 96개의 웰 각각에 로드합니다.

다음으로, 각각 1마이크로리터의 5마이크로몰 역 프라이머가 있는 3개의 웰 세트를 로드합니다. 따라서 32개의 서로 다른 역 인덱스를 모두 플레이트에 로드합니다. 그런 다음 모든 플레이트 웰에 추출된 DNA 샘플 4마이크로리터를 추가합니다.

이것은 깨끗한 벤치에서 수행됩니다. 이제 3분 초기 변성으로 PCR을 실행한 다음 1분 동안 변성하고 섭씨 55도에서 무릎을 꿇고 1분 동안 연장하는 35주기로 PCR을 실행합니다. 10분 최종 연장으로 마무리합니다.

반응이 완료된 후 PCR 후 전용 작업대에서 작업합니다. 여기에서 각 삼중 PCR 산물 세트를 샘플당 60마이크로리터의 단일 튜브로 결합합니다. 그런 다음 각 샘플의 4마이크로리터를 에티듐 브로마이드가 염색된 1%아가로스 겔에 실행합니다.

양의 Amplicon은 375 및 425 염기쌍 사이에 나타납니다. 음성 대조군이 표시되고 연구 양성 Amplicons와 함께 처리됩니다. 제조업체 지침에 따라 양성 반응 산물의 DNA 농도를 정량화합니다.

그런 다음 각 제품의 DNA 500나노그램을 단일 튜브에 결합합니다. 이 혼합물을 소용돌이치고 이전과 같이 1% 젤에 200마이크로리터를 소진합니다. 이제 겔에서 375 및 425 염기쌍 사이의 밴드를 추출합니다.

다음으로, 염기서열분석을 위해 라이브러리를 준비합니다. 제조업체 지침에 따라 고감도 이중 가닥 DNA 검출 키트를 사용하여 농도를 측정한 다음 고감도 분리 및 분석 키트를 사용합니다. 그런 다음 라이브러리를 7 피코몰러로 희석하고 대조군 라이브러리와 4 대 1로 결합합니다.

이제 샘플의 염기서열분석 준비가 되었으므로 염기서열분석 기계로 옮깁니다. 대변 샘플로부터 라이브러리 준비를 위해 설명된 방법은 감염성 설사가 의심되어 입원한 환자의 마이크로바이옴을 분석하는 데 사용되었습니다. 이와 동시에 대변 샘플도 미생물학 실험실에서 전통적인 배양을 받았습니다.

비교를 위해 건강한 성인의 대변 샘플을 염기서열분석했습니다. 여러 음성 대조군 샘플, 주형이 없는 PCR, 추출 및 희석 용액의 깨끗하고 멸균된 면봉에 대한 PCR, 혼합 추출 및 희석 용액에 대한 PCR이 포함되었습니다. 이들 각각은 총 118개 미만의 판독을 가졌으며 주로 Mycoplasm 분류군이었습니다.

표준 샘플은 품질 관리 후 Mycoplasma의 식별 없이 평균 10, 000회 이상 판독되었습니다. 샘플의 일관성 및 변동성은 각 샘플에서 두 개의 서로 다른 라이브러리를 구성하기 위해 두 개의 서로 다른 바코드 프라이머로 준비된 16개의 대변 샘플을 사용하여 측정되었습니다. 샘플의 절반은 전통적인 배양 기법에서 캄필로박터 살모넬라균 또는 시겔라균에 양성이었습니다.

16S 염기서열분석 결과를 사용하여 phylo 수준의 면적 플롯은 기존 배양 결과와 독립적으로 동일한 샘플에서 만들어진 라이브러리 간의 일관성을 보여줍니다. 이 16개 쌍의 샘플 풀에서 주요 좌표 분석을 통해 샘플 쌍이 밀접하게 정렬되어 있으며 양성 배양 샘플이 음성 배양 샘플과 유의하게 다른 PC1 값을 갖는 것으로 나타났습니다. 샘플에 대한 추가 분석에서는 높은 수준의 프로테오박테리아가 입원한 환자에서만 발견되는 것으로 나타났습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 무결장 DNA 추출과 PCR을 사용하여 많은 수의 대변 샘플을 동시에 처리하여 미생물 변수 V4 영역의 바코드 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 특히 라이브러리를 준비할 때 체계적이고 깨끗한 환경에서 작업해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 사람의 대변 샘플로 작업하는 것은 위험하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.