Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR을 사용하여 혈장 MicroRNA의 절대 수준을 측정하는 것입니다. 이 방법은 발현 수준이 낮더라도 혈장 microRNA의 양을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 측정된 데이터를 다른 연구 또는 실험실의 다른 데이터와 비교할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 합성 RNA 또는 뉴클레오티드를 사용하여 표준 곡선을 생성할 수 있기 때문에 다른 종의 샘플로 확장됩니다. 이 방법은 유망한 안전성 바이오마커를 조사하기 위한 중개 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 먼저 얼음 위에서 Cynomolgus 원숭이의 대퇴 정맥에서 얻은 냉동 혈장 샘플을 해동합니다.

RNA 추출 전에 냉각을 위해 클로로포름의 Lysis 시약을 얼음 위에서 옮깁니다. 다음으로, 1, 000 마이크로 리터의 용해 시약을 200 마이크로 리터의 샘플에 추가하십시오. 그리고 적절한 혼합을 보장하기 위해 1분 동안 와류를 칩니다.

그런 다음 5마이크로리터의 5나노몰 합성 Caenorhabditis elegans microRNA와 200마이크로리터의 클로로포름을 샘플에 추가합니다. 제대로 섞이도록 샘플을 1분 동안 소용돌이치십시오. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 2-3분 동안 놓습니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000G에서 샘플을 원심분리하십시오. 다음으로, 650마이크로리터의 수성상을 새 마이크로튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 975마이크로리터의 에탄올을 수성상에 추가하고 피펫을 여러 번 넣어 완전한 혼합을 보장합니다.

샘플을 해당 컬럼과 어댑터로 옮긴 다음 진공 매니폴드를 사용하여 3분 동안 진공 건조합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 에탄올을 컬럼에 넣고 1분 동안 진공 건조합니다. 진공 건조 후 800마이크로리터의 RWT 버퍼를 컬럼에 추가하고 다시 2분 동안 진공 건조합니다.

그런 다음 800마이크로리터의 RPE 버퍼를 컬럼에 추가하고 2분 동안 진공 건조합니다. RPE 버퍼를 두 번 추가한 다음 진공 건조를 수행합니다. 다음으로, 300마이크로리터의 에탄올을 컬럼에 추가합니다.

에탄올을 첨가한 후 1분 동안 진공 건조합니다. 다음, 새로운 microtube에 있는 란을 옮기고 12, 1 분 동안 실내 온도에 000 G에 동일을 분리기. 원심분리 후 컬럼을 새 마이크로튜브로 옮기고 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.

란을 3 분 동안 실내 온도에 방치한 후에 8, 1 분 동안 실내 온도에 000 G에 원심분리하십시오. 마지막으로 용리액을 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 타겟 microRNA에 해당하는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 농도를 준비하려면 원액을 10배 희석하여 표준 곡선을 플로팅하는 가장 높은 농도의 작업 용액을 얻습니다.

다음으로, 역전사 프라이머의 멀티플렉스 풀을 구성하기 위해, 타겟 microRNA에 대해 20개 강도의 프라이머를 동일한 부피로 혼합합니다. 그런 다음 역전사 반응 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 역전사 반응 혼합물을 5마이크로리터의 RNA 샘플에 추가합니다.

여러 번 피펫팅하여 두 가지를 혼합합니다. 그런 다음 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 Thermocycler에 넣은 후 사이클을 시작합니다.

프로그램이 끝나면 역으로 전사된 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다중화 분석실험 뇌관 풀을 구성하기 위하여는, 1, 000 마이크로리터의 마지막 양에 있는 Tris-EDTA 완충액을 포함하는 관으로 표적 microRNAs에 해당하는 분석실험 뇌관의 5 마이크로리터의 동일한 양을 추가하십시오. 다음으로, 사전 증폭 반응 혼합물을 구성합니다.

반응 혼합물이 완료되면 22.5마이크로리터의 사전 증폭 반응 혼합물을 2포인트 5마이크로리터의 역전사 샘플로 옮깁니다. 그런 다음 피펫으로 샘플과 사전 증폭 마스터 믹스를 철저히 혼합하고 얼음에서 5분 동안 배양한 다음 PCR 튜브를 Thermocycler에 그대로 두고 실행을 시작합니다. 프로그램이 끝나면 모든 샘플을 섭씨 영하 80도에서 옮깁니다.

사전 증폭 또는 사전 증폭되지 않은 샘플을 해동한 후 멸균수로 5배 희석합니다. 표준 곡선을 생성하려면 합성 RNA 올리고뉴클레오티드에서 유래한 샘플을 10배 연속 희석합니다. 그런 다음 얼음에 보관된 튜브에서 정량적 PCR 반응 혼합물을 구성합니다.

그런 다음 정량적 PCR 반응 혼합물에서 18마이크로리터를 Fast Optical 96-Well 반응 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 희석된 샘플 2마이크로리터를 웰에 추가합니다. 접착 필름으로 플레이트를 밀봉한 후 500G에서 15초 동안 샘플을 잠시 원심분리합니다.

그런 다음 실시간 Thermocycler 프로그램을 시작합니다. 해당 실시간 열 순환기와 함께 작동하는 SDS 소프트웨어 버전 2.4를 사용하여 각 샘플의 원시 복제 수를 계산합니다. 그런 다음 Excel 소프트웨어를 사용하여 원시 사본 번호에서 절대 사본 수를 계산합니다.

miR-122, miR-192 및 miR-133a의 증폭 효율은 표준 곡선을 플로팅하여 분석되었으며, 이는 사전 증폭되지 않은 샘플에 대한 로그 농도와 정량화 주기 간의 관계를 설명합니다. miR-122, miR-192 및 miR-133a에 대한 표준 곡선은 정량화 주기와 샘플의 로그 농도 간의 선형 관계를 보여줍니다. 다음으로, 사전 증폭된 샘플에 대한 표준 곡선을 플로팅하여 miR-1, miR-499a 및 miR-206의 증폭 효율을 분석했습니다.

증폭 효율을 분석하기 위해 선형 회귀를 사용하여 기울기를 계산했습니다. 표준 곡선 A에 있는 사면은 miR-499a 및 miR-206을 위한 마이크로리터 농도 당 1, 000 사본에 특정한 amplicon의 결핍을 보여줍니다. 그러나, 비특이적 앰플리콘은 miR-1에 대해 마이크로리터당 1,000 카피에서 얻어졌다.

여기서, 증폭 플롯을 도출하기 위해 사전 증폭되지 않은 및 사전 증폭된 miR-206 샘플이 중복으로 사용되었습니다. 비-프리-증폭 및 프리-증폭된 miR-206에 대한 정량화 사이클 값은 각각 39.9, 플러스 마이너스 1포인트 9 및 27.0, 플러스 마이너스 2포인트 2로 추정되었으며, 이는 플롯에 나타난 바와 같이 중복 간에 거의 유사한 값을 나타냅니다. 다음으로, Cynomolgus 원숭이에서 얻은 플라즈마 microRNAs를 프로파일링하여 절대값을 계산했습니다.

발현 수준을 나타내는 microRNA 프로파일링에서 얻은 점도표는 miR-122, miR-133a 및 miR-192가 사전 증폭 없이 검출될 수 있음을 보여줍니다. 반면, miR-1, miR-206 및 miR-499a는 발현 수준이 낮기 때문에 사전 증폭이 필요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 RT-qPCR을 사용하여 혈장 microRNA의 절대 수준을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

및 사전 증폭; 소량의 microRNA로 검출을 개선하는 데 유용합니다.