Name: Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 학습하세요 Cynomolgus 원숭이 혈장 microRNA의 절대 정량화 방법을 실시간 RT-qPCR 기술로. 저발현 수준에서도 정확한 측정이 가능하며, 다양한 연구 간 데이터 비교와 안전성 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

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이 연구는 공공, 상업, 또는 하지-위한-비영리 부문에 자금 지원 기관에서 어떤 특정 그랜트를 받지 않았다.

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 다이 이치 산 쿄 주식회사에 의해 승인 되었다
1. 샘플 준비
<ol><li>EDTA 2 K 포함 된 튜브에 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 혈액 (적어도 0.5 mL)를 수집 합니다. 참고: 시트르산과 헤 파 린 허용 되지 않습니다 때문에 이러한 응고 억제 이후 PCR14,15.</li>
	<li>즉시 얼음과 컬렉션의 2 시간 이내 플라즈마 격리 프로세스에 수집 된 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 샘플 원심</li>
	<li>2 mL microtube, 세포 파편 및 잔여 혈소판을 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 16000 x g에서 원심 분리 뒤에 상쾌한을 전송 합니다. 참고: 정량화 miRNAs의 혈소판 오염16에 의해 크게 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>신선한 2 mL-microtubes에 상쾌한의 200 µ L aliquots를 놓고 사용까지-80 ° C에 저장 합니다. 참고: 각 샘플의 고정된 볼륨은 사용할 RNA 추출; 따라서,는 약 수의 볼륨 정확 해야 합니다.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>냉동된 샘플 (1.5 단계)에서 얼음에 녹여<ol>
<li>계속 샘플 차가운 얼음에 RNA 추출 하는 동안. 세포 시 약을 진정 하 고 사용 하기 전에 얼음에 클로 프롬.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 시 약, 포함 하는 샘플 (200 µ L), 페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션의 5 볼륨 (1000 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.</li>
	<li>5 nM 합성의 5 µ L 추가 꼬마 선 충 미르 (Syn-cel-미르-238-3 p).</li>
	<li>클로 프롬의 1 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.</li>
	<li>2 ~ 3 분 동안 얼음에 유지 하 고 15 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 샘플을 원심.</li>
	<li>신중 하 게 새로운 microtube 수성 단계 전송. 참고: 유기 단계 (빨간색) 또는 interphase (흰색)를 전송 하지 않습니다. 수집 된 수성 단계의 볼륨 증가 기술 변화에서 결과 불일치를 처리 하지 않도록 균일 해야 한다. 이 프로토콜에 수성 단계의 일반적인 금액 650 µ L 이었다.</li>
	<li>에탄올, 1.5 볼륨 (975 µ L)를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 잘 혼합.</li>
	<li>해당 열과 어댑터, 진공 건조 진공 매니폴드를 사용 하 여 3 분 뒤에 샘플을 전송 합니다. 샘플 볼륨 이상 700 µ L 이면 나머지 솔루션을 처리 하려면이 단계를 반복 합니다. 참고: 열 기반 RNA 격리 진공 및 원심 분리 방법와 호환 됩니다.</li>
	<li>뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>뒤에 2 분 동안 진공 건조 열 RWT 버퍼의 800 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>RPE 버퍼의 800 µ L 뒤에 2 분 동안 진공 건조 하 여 열을 추가 합니다.</li>
	<li>2.11 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>새로운 microtube에 열을 배치 하 고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 12000 x g에서 원심.</li>
	<li>새로운 microtube에 열을 전송 하 고 nuclease 무료 물 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 3 분, 그리고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 8000 × g에서 원심 분리기에 대 한 서.</li>
	<li>다시는 eluate 열에 적용 됩니다.</li>
	<li>2.16, 단계를 반복 하 고 사용까지 eluate-80 ° C에서 저장.</li>
</ol>3입니다. cDNA 합성
<ol><li>(단계 2.18)에서 냉동된 샘플 녹여</li>
	<li>
대상 miRNAs에 해당 하는 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도 준비 합니다.
	<ol>
<li>합성 RNA oligonucleotide를 사용 하 여 정량에서 표준 곡선을 생성 하기 위한. 1 x 108 복사 / µ L 농도의 재고 솔루션 스토리지 목적을 위해 준비가 되어 있습니다.</li>
		<li>재고 솔루션을 1 x 107 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플) 또는 1 x 105 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 작업 솔루션 표준 곡선을 만들기 위한 가장 높은 농도 10 배 희석. 일반적으로, 표준 곡선 농도 대 한 제안된 범위는 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플)을 1 x 105 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>멀티플렉스 RT 뇌관 수영장 대상 miRNAs에 대 한 20 x RT 뇌관의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비 합니다. 참고: 지금까지 그림 2에서 같이에 포함 된 최대 4 대상 miRNAs 수영장 수영장에서 miRNAs의 각각의 20 배 RT 뇌관을 혼합 하 여 만들 수 있습니다. Cel-미르-238 (외부 제어) 각 관에서 대상 miRNAs의 하나로 포함 되어야 합니다. 미만 4 대상 miRNAs의 경우 20 x RT 뇌관 대신 1/10 테 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>RT 반응 혼합 준비: 3 µ L RT 뇌관의 dTTP와 100mm dNTPs의 0.15 µ L, 역전사 (50 U / µ L), RT 버퍼 x 1.5 µ L 10, RNase 억제제 (20 U / µ L)의 0.19 µ L의 1 µ L (3.3 단계)에서 수영장 및 4.16 µ L nuclease 무료의 물.</li>
	<li>RT 반응의 믹스 10 µ L pipetting, 여 (3.1 단계)에서 RNA 샘플 또는 (3.2 단계)에서 oligonucleotides의 5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>열 cycler 기구에 반전 녹음 방송 실행: 16 ° C 30 분, 30 분 동안 42 ° C에 대 한 다음 5 분에 85 ° C에서 최종 역전사 비활성화 단계 저장소 역방향 베낀된 샘플-80 ° C에서 사용까지.</li>
</ol>4입니다. preamplification (선택 사항)
참고: Cq 값 35 또는 후속 정량에 더 이상 보여 주는 miRNAs는 미리 증폭.
<ol><li>냉동된 샘플 (3.6 단계)에서 녹여</li>
	<li>10 직렬 희석 합성 RNA oligonucleotides;에서 실시간 제품의 확인 1 x 10을 1 x 100 복사 / µ L 표준 곡선을 생성 하기 위한5 .</li>
	<li>대상 miRNAs 200-fold 묽 게 되 고 각 분석 결과 뇌관의 최종 농도 대 한 분석 결과 뇌관 x 20의 다중 분석 결과 뇌관 풀 같은 볼륨 (5 µ L)를 혼합 하 여 준비 테 버퍼 1000 µ L의 최종 볼륨에 의해. 참고: 해당 대상 miRNAs 사전 증폭 없이 cel-미르-238 (외부 제어)에 대 한 후속 정량에서 감지 수 분석 결과 뇌관 뇌관 수영장에는 포함 되지 않습니다.</li>
	<li>사전 증폭 반응 혼합물 준비: 2 x 준비-사용 preamplification 시 약, 분석 결과 뇌관 풀 (4.3 단계)에서 3.75 µ L nuclease 무료 물 6.25 µ L의 12.5 µ L.</li>
	<li>사전 증폭 반응의 µ L 믹스 22.5 pipetting, 여 역 베낀된 샘플 (4.1 단계) 또는 (4.2 단계)에서 oligonucleotides의 2.5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>반응 열 cycler 기구에 실행: 95 ° C 10 분; 15 s 및 4 분 동안 60 ° C까지 사용-80 ° C에 미리 증폭된 샘플을 저장 하는 동안 95 ° C의 12 주기 다음.</li>
</ol>5. 정량 실시간 PCR (정량)
<ol><li>냉동된 샘플 (3.6 단계 또는 단계 4.6)에서 녹여</li>
	<li>5-fold 샘플을 희석 소독 물.</li>
	<li>합성 RNA oligonucleotides;에서 파생 된 RT 제품의 10 연속 희석을 준비 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 105 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 표준 곡선을 생성 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 반응 혼합 준비: 준비-사용 증폭 시 약, 분석 시 약, 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 조사 대상 미르에 포함 된 x 20의 1 µ L과 nuclease 무료 물 7 µ L x 2의 10 µ L.</li>
	<li>정량 Pcr 반응 혼합에서 빠른 광학 96-잘 반응 판 18 µ L를 전송 하 고 우물에 (단계 5.2 또는 5.3 단계)에서 희석 샘플 2 µ L를 추가 합니다. 참고: 샘플 및 정량에 대 한 표준을 설정 됩니다 중복에.</li>
	<li>접착 필름, 접시를 봉인 하 고 짧게 원심.</li>
	<li>반응 실시간 열 cycler에서 실행: 20 95 ° C 95 ° C의 45 주기 다음 s 1 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>해당 실시간 열 cycler와 함께 작동 하는 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 원시 복사본 수를 계산 합니다. 참고: 임계값 줄 설정 됩니다 수동으로 "1.0"은 연구에 모든 접시에 그들의 Cq vales 비교해보면 재현성 확인 하. Cq에서 차단 수준 설정 > 40 주기.</li>
	<li>중복에서 각 샘플의 원시 복사본 수의 평균을 계산 합니다.</li>
	<li>해당 관의 모든 샘플에서 cel-미르-238의 복사본 수의 평균에 의해 cel-미르-238 각 샘플에서의 복사본 수를 분할 하 여 수정 계수를 계산 합니다. 참고: 그림 2에서처럼 각 튜브 4 대상 miRNAs cel-미르-238 (외부 제어) 등까지 포함 합니다. 따라서, cel-미르-238의 해당 값을 사용 하 여 각 튜브에 대 한 수정 계수를 계산 합니다.</li>
	<li>(단계 6.2)에서 각 샘플의 평균된 원시 복사본 수를 분할 하 여 각 샘플 (단계 6.3)에서 수정 계수에 의해 조정된 복사본 수를 계산 합니다.</li>
	<li>여 (단계 6.4)에서 각 샘플의 조정된 원시 복사본 수를 곱하여 절대 복사본 수를 계산는 각 샘플에 대 한 희석 비율. 참고: 희석 요인은 단계 5.2에서 파생 되는이 프로토콜에 "5"입니다.</li>
	<li>로그 cDNA 농도 대 한 각 직렬 희석 Cq 값의 작의의 사면에서 PCR 증폭의 효율을 계산 합니다. 참고: 수식을 계산 하는 효율성; E = (10(-1/경사) -1) x 100%.</li>
	<li>계산 수식 E를 사용 하 여 모든 샘플에서 cel-미르-238의 Cq 값을 사용 하 여 기술 변화 = (2 x 확대 효능)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). 참고: 6.5, 6.7 단계 절차의 품질 평가에 사용 됩니다.</li>
</ol>

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<li>Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+circulating+miRNAs+by+droplet+digital+PCR%3A+comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-based+chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol.+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 충돌의 관심이 있다.

우리의 포괄적인 평가 개별 샘플 사이 변이의 크기는 매우 다른 miRNAs 테스트 중 명확 하 게 표시 동적 범위의 넓이의 더 엄격한 통계 분석을 제공 합니다. 비록 이러한 유사 체액에 그들의 작은 수량에 기인 수 있습니다, 생물학 변화 뿐만 아니라 기술 변화 반영 하는 이러한 데이터 주목 해야한다. 기술 변화의 대부분은 다른 분석 결과 플랫폼18에서 사용 되는 외부 제어 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의하여 평가 수 있습니다. 이후 미르 분석에 아무 표준된 내부 통제 되었습니다, 기술 변화에 대 한 정보 분석 결과19의 품질을 결정 하기 위한 분석에 포함 되어야 합니다. 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다이 보고서에 설명 된 방법에. 다른 연구에 비해 기술 정보 부족으로 인해이 절차에 대 한 품질 수준을 확인할 수는 없습니다, 비록 같은 정보를 포함 하 여 신뢰성 향상에 기여 하 고 간의 호환성 보장 다른 연구입니다.
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연구의 증가 진단 및 암의 예 후에 대 한 생체로 microRNAs (miRNAs)를 탐험 또는 모니터링 및 nonclinical 및 임상 연구1,2,3에에서 다른 질병을 감지 . 양이 많은 실시간 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량)이이 기술은 microarray4 와 RNA 시퀀싱 플랫폼5기반 보다 더 중요 한 있기 때문에 개별 대상 miRNAs, 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, 미르 식6의 ΔCq 메서드 사용 하 여 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 순환 miRNAs의 상대 부 량 그들의 소량 때문에 유틸리티를 제한 했다. 또한, 기술 변형 하기가 다른 실험실 사용자 정의 실시간 정량 Pcr 실험 프로토콜 다르게, 일관성에 이르게 하거나 심지어 모순에서 결과 때문에 다른 연구에서 결과 비교 하기 어려운 다른 연구7.
위에서 언급 한 문제에 비추어 절대 정량화는 더 작은 양의 체액에서 miRNAs의 평가 적합 수 있습니다. 절대 정량화 방법은 해당 대상 미르8의 시퀀스와 동일한 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다. 건강과 환경 과학 연구소 (HESI) 유전체학 회 최근 여러 테스트 사이트에서 플라즈마 miRNAs의 절대 측정의 결과 비교 하는 포괄적인 연구를 실시 했다. 결과 여러 테스트 사이트9에서 유사한 결과 굴복 miRNAs의 절대 정량에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 보였다. 현재 연구에서 설명 하는 실시간 정량 분석 방법을 거의 여러 miRNA 표적, 및 낮은 식 miRNAs의 검색을 돕기 위해 사전 증폭의 다중화 분석 포함 HESI의 표준 프로토콜.
이 연구에서 EDTA-혈장 혈액에서 준비의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 (n = 50) 사용10. 다음과 같은 프로토콜의 추출, miRNA 및 RT-정량, 사전 증폭을 포함 하 여 플라즈마 샘플의 준비를 위한 절차를 설명 합니다. 샘플에서 대상 miRNAs의 수량 충분 한 자격이 프로세스와 함께에서 유효성을 검사할 수 있도록 더 중요 하 게는 프로토콜에 대 한 추가 기술 정보 포함 되었습니다. 첫째, 각 미르의 표준 곡선 생물학 견본에서 그것의 부 량 이전의 개별 검색 범위에 대 한 유효성을 검사 했다. 둘째, 현재 방법론의 품질 외부 컨트롤 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의해 종합적으로 평가 되었습니다. 따라서,이 플랫폼은 다른 연구 나 실험실에서 결과 비교 하기 위한 더 유익 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 합니다.
8 miRNAs의 프로필 대표 결과로이 보고서에 포함 된 시험 방법을 여기에 설명 된에서. 이러한 miRNAs (미르-1, 미르 208a, 미르-208b, 그리고 미르-499a), 심장 및 골격 근육 (133a 미르와 미르-206) 설치류와 인간3, 잠재적인 안전 생체 (122 미르와 미르-192), 간 조직 상해와 관련 된으로 제안 되어 11,,1213.

<table><tbody><tr><td>BD Microtainer tube (K2EDTA)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365974</td><td>채혈용</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030124359</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&nbsp; 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&nbsp; 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>합성 올리고뉴클레오티드</td><td>홋카이도 시스템 과학</td><td>-</td><td>개별 miRNA (0.2 &mu; mol, HPLC 등급)</td></tr> <tr><td>Tris-EDTA 버퍼&nbsp; (산도 8.0)</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td>TE 버퍼</td></tr><tr><td>버퍼 RPE</td><td>QIAGEN-miRNeasy</td><td></td> <td>미니 키트에 포함된 내용&nbsp;</td></tr><tr><td>버퍼 RWT</td><td>QIAGEN-miRNeasy</td><td></td> <td>미니 키트의 내용물&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy 미니 키트</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리 워터&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol 용해 시약</td><td>QIAGEN-Contents</td><td></td> <td>in miRNeasy 미니 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA 모방&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>219600</td><td>ID:MSY0000293, 5 nmol</td></tr><tr><td>SC 어댑터</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>S0120</td><td>RNA 추출용</td></tr><tr><td>VacEZor 36 Complete System</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>M3610</td><td>RNA 추출용</td></tr><tr><td>7900HT 고속 실시간 PCR 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4351405</td><td>Fast 96-Well</td></tr><tr><td>Block GeneAmp PCR 시스템 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>마이크로앰프 고속 광학 96웰 반응 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4311971</tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4444557 TaqMan MicroRNA 어세이(cel-miR-238-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td>4427975 어세이 ID: 000248</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-122-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>분석 ID: 002245</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-133a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>어세이 ID: 002246</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-1-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>어세이 ID: 002222</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-192-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>어세이 ID: 000491</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-206)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>어세이 ID: 000510</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-208a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>분석 ID:</td></tr><tr><td>000511 TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-208b-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>분석 ID: 002290</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 분석(has-miR-499a-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>어세이 ID: 001352</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4366597</tr><tr><td>TaqMan PreAmp 마스터 믹스 (2&times;)</td><td>써모 피셔 사이언티픽 Inc.</td><td></td><td></td>4391128</tr><tr><td>클로로포름&nbsp;</td><td>와코 퓨어 케미컬</td><td>035-02616</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(99.5)</td> <td>와코 퓨어 케미컬</td><td>057-00456</td><td></td></tr></tbody></table>

cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 pcr를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

실시간 정량 Pcr 개별 대상 miRNAs 평가 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. MiRNAs 수준 일반적으로 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 더 나은 통계 분석을 사용 하 여 절대 정량화 유전자 식 레벨의 포괄적인 평가 위해 바람직합니다. 절대 부 량은 여전히 공통 사용 하지. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
EDTA 플라스마의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 된 혈액에서 준비 되었다 (n = 50). 총 RNA는 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하 여 추출 되었다. 플라즈마 miRNAs는 프로브 기반 실시간 정량 Pcr 분석 실험 미르 관련 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 프로브를 포함 하 여 정량 했다. 절대 정량화에 대 한 표준 곡선 상용 합성 RNA oligonucleotides를 사용 하 여 생성 되었다. 합성 cel-미르-238 표준화 및 품질 평가 대 한 외부 제어로 사용 되었다. MiRNAs는 정량화 35 위 주기 (Cq) 값 정량 단계 전에 미리 증폭 했다.
가운데 8 miRNAs 검사, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192 했다 사전 증폭 없이 감지 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면. 미르-208a와 미르 208b 했다 감지 전 확대 후에. 샘플 처리 효율 아군된 cel-미르-238의 Cq 값에 의해 평가 되었다. 이 분석 방법에서 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다 하 고 정량화 (LLOQ)의 하한값은 102 복사 / µ L, 시험된 miRNAs의 대부분을 위해.
이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 견적을 제공 하 고 다른 연구에서 해당 하는 데이터의 품질 평가 허용 한다. 체액, 사전 증폭 miRNAs의 낮은 수는 저조한의 탐지를 향상 시키기 위해 유용 고려 miRNAs 표현.

실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 워크플로 및 품질 assessment 그림 1 에서 정량10를 사용 하 여 혈액 샘플 분석 결과 miRNA의 워크플로 보여 줍니다. Cel-미르-238는 외부 컨트롤을 포함 하 여 실험의 품질을 확인할 수 있습니다. 이 RNA 추출 기술 변화를 보여줄 것입니다 및 후속 실시간 정량 Pcr 처리 합니다. 이 연구에서는 50 샘플에서 계산 하는 Cq 값의 평균 ± SD 21.0 ± 0.4 (표 1) 이었다. Cel-미르-238 사전 증폭 단계 때문에 희석 했다, Cq 값 24.2 ± 0.4 (표 1)을 했다. 여기 설명 하는 시험 방법을에서 기술 변화의 정도 Cq 값에 차이에 따라 미만 3 것으로 추정 했다. 변화의 정...

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

이 절차의 전반적인 목표는 Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR을 사용하여 혈장 MicroRNA의 절대 수준을 측정하는 것입니다. 이 방법은 발현 수준이 낮더라도 혈장 microRNA의 양을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 측정된 데이터를 다른 연구 또는 실험실의 다른 데이터와 비교할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 합성 RNA 또는 뉴클레오티드를 사용하여 표준 곡선을 생성할 수 있기 때문에 다른 종의 샘플로 확장됩니다. 이 방법은 유망한 안전성 바이오마커를 조사하기 위한 중개 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 먼저 얼음 위에서 Cynomolgus 원숭이의 대퇴 정맥에서 얻은 냉동 혈장 샘플을 해동합니다.RNA 추출 전에 냉각을 위해 클로로포름의 Lysis 시약을 얼음 위에서 옮깁니다. 다음으로, 1, 000 마이크로 리터의 용해 시약을 200 마이크로 리터의 샘플에 추가하십시오. 그리고 적절한 혼합을 보장하기 위해 1분 동안 와류를 칩니다.그런 다음 5마이크로리터의 5나노몰 합성 Caenorhabditis elegans microRNA와 200마이크로리터의 클로로포름을 샘플에 추가합니다. 제대로 섞이도록 샘플을 1분 동안 소용돌이치십시오. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 2-3분 동안 놓습니다.다음으로, 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000G에서 샘플을 원심분리하십시오. 다음으로, 650마이크로리터의 수성상을 새 마이크로튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 975마이크로리터의 에탄올을 수성상에 추가하고 피펫을 여러 번 넣어 완전한 혼합을 보장합니다.샘플을 해당 컬럼과 어댑터로 옮긴 다음 진공 매니폴드를 사용하여 3분 동안 진공 건조합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 에탄올을 컬럼에 넣고 1분 동안 진공 건조합니다. 진공 건조 후 800마이크로리터의 RWT 버퍼를 컬럼에 추가하고 다시 2분 동안 진공 건조합니다.그런 다음 800마이크로리터의 RPE 버퍼를 컬럼에 추가하고 2분 동안 진공 건조합니다. RPE 버퍼를 두 번 추가한 다음 진공 건조를 수행합니다. 다음으로, 300마이크로리터의 에탄올을 컬럼에 추가합니다.에탄올을 첨가한 후 1분 동안 진공 건조합니다. 다음, 새로운 microtube에 있는 란을 옮기고 12, 1 분 동안 실내 온도에 000 G에 동일을 분리기. 원심분리 후 컬럼을 새 마이크로튜브로 옮기고 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.란을 3 분 동안 실내 온도에 방치한 후에 8, 1 분 동안 실내 온도에 000 G에 원심분리하십시오. 마지막으로 용리액을 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 타겟 microRNA에 해당하는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 농도를 준비하려면 원액을 10배 희석하여 표준 곡선을 플로팅하는 가장 높은 농도의 작업 용액을 얻습니다.다음으로, 역전사 프라이머의 멀티플렉스 풀을 구성하기 위해, 타겟 microRNA에 대해 20개 강도의 프라이머를 동일한 부피로 혼합합니다. 그런 다음 역전사 반응 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 역전사 반응 혼합물을 5마이크로리터의 RNA 샘플에 추가합니다.여러 번 피펫팅하여 두 가지를 혼합합니다. 그런 다음 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 Thermocycler에 넣은 후 사이클을 시작합니다.프로그램이 끝나면 역으로 전사된 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다중화 분석실험 뇌관 풀을 구성하기 위하여는, 1, 000 마이크로리터의 마지막 양에 있는 Tris-EDTA 완충액을 포함하는 관으로 표적 microRNAs에 해당하는 분석실험 뇌관의 5 마이크로리터의 동일한 양을 추가하십시오. 다음으로, 사전 증폭 반응 혼합물을 구성합니다.반응 혼합물이 완료되면 22.5마이크로리터의 사전 증폭 반응 혼합물을 2포인트 5마이크로리터의 역전사 샘플로 옮깁니다. 그런 다음 피펫으로 샘플과 사전 증폭 마스터 믹스를 철저히 혼합하고 얼음에서 5분 동안 배양한 다음 PCR 튜브를 Thermocycler에 그대로 두고 실행을 시작합니다. 프로그램이 끝나면 모든 샘플을 섭씨 영하 80도에서 옮깁니다.사전 증폭 또는 사전 증폭되지 않은 샘플을 해동한 후 멸균수로 5배 희석합니다. 표준 곡선을 생성하려면 합성 RNA 올리고뉴클레오티드에서 유래한 샘플을 10배 연속 희석합니다. 그런 다음 얼음에 보관된 튜브에서 정량적 PCR 반응 혼합물을 구성합니다.그런 다음 정량적 PCR 반응 혼합물에서 18마이크로리터를 Fast Optical 96-Well 반응 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 희석된 샘플 2마이크로리터를 웰에 추가합니다. 접착 필름으로 플레이트를 밀봉한 후 500G에서 15초 동안 샘플을 잠시 원심분리합니다.그런 다음 실시간 Thermocycler 프로그램을 시작합니다. 해당 실시간 열 순환기와 함께 작동하는 SDS 소프트웨어 버전 2.4를 사용하여 각 샘플의 원시 복제 수를 계산합니다. 그런 다음 Excel 소프트웨어를 사용하여 원시 사본 번호에서 절대 사본 수를 계산합니다.miR-122, miR-192 및 miR-133a의 증폭 효율은 표준 곡선을 플로팅하여 분석되었으며, 이는 사전 증폭되지 않은 샘플에 대한 로그 농도와 정량화 주기 간의 관계를 설명합니다. miR-122, miR-192 및 miR-133a에 대한 표준 곡선은 정량화 주기와 샘플의 로그 농도 간의 선형 관계를 보여줍니다. 다음으로, 사전 증폭된 샘플에 대한 표준 곡선을 플로팅하여 miR-1, miR-499a 및 miR-206의 증폭 효율을 분석했습니다.증폭 효율을 분석하기 위해 선형 회귀를 사용하여 기울기를 계산했습니다. 표준 곡선 A에 있는 사면은 miR-499a 및 miR-206을 위한 마이크로리터 농도 당 1, 000 사본에 특정한 amplicon의 결핍을 보여줍니다. 그러나, 비특이적 앰플리콘은 miR-1에 대해 마이크로리터당 1,000 카피에서 얻어졌다.여기서, 증폭 플롯을 도출하기 위해 사전 증폭되지 않은 및 사전 증폭된 miR-206 샘플이 중복으로 사용되었습니다. 비-프리-증폭 및 프리-증폭된 miR-206에 대한 정량화 사이클 값은 각각 39.9, 플러스 마이너스 1포인트 9 및 27.0, 플러스 마이너스 2포인트 2로 추정되었으며, 이는 플롯에 나타난 바와 같이 중복 간에 거의 유사한 값을 나타냅니다. 다음으로, Cynomolgus 원숭이에서 얻은 플라즈마 microRNAs를 프로파일링하여 절대값을 계산했습니다.발현 수준을 나타내는 microRNA 프로파일링에서 얻은 점도표는 miR-122, miR-133a 및 miR-192가 사전 증폭 없이 검출될 수 있음을 보여줍니다. 반면, miR-1, miR-206 및 miR-499a는 발현 수준이 낮기 때문에 사전 증폭이 필요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 RT-qPCR을 사용하여 혈장 microRNA의 절대 수준을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.및 사전 증폭; 소량의 microRNA로 검출을 개선하는 데 유용합니다.

absolute-quantification-plasma-microrna-levels-cynomolgus-monkeys

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

Microglia은 중추 신경계의 방어 및 면역 감시의 첫번째 라인을 제공 macrophages를 거주하고 있습니다. MicroRNAs는 활성화 및 macrophages의 차별화 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을 규제 분자입니다. 이 문서에서는 microglia에서 microRNAs의 측정을위한 방법을 설명합니다.

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여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.

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여기, 우리 조기 폐 암 발견에 대 한 순환 예측에 관한 서명 분류자 테스트를 수행 하는 시험 검사는 BioMILD에 채택 하는 상세한 프로토콜 제시.

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설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.

급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

학습하세요 Cynomolgus 원숭이 혈장 microRNA의 절대 정량화 방법을 실시간 RT-qPCR 기술로. 저발현 수준에서도 정확한 측정이 가능하며, 다양한 연구 간 데이터 비교와 안전성 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

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