조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

이 웨스턴 블로팅 프로토콜의 오버 목표는 적은 수의 세포에 웨스턴 블롯을 수행하는 것입니다. 이 방법은 특정 단백질의 존재 또는 풍부함 또는 신호 경로의 활성화와 같은 조혈모세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 20 이하, 000 세포 미만을 요구하다 이다 그래서 몇몇 동물은 1 차적인 세포의 희소한 집단을 분석하기 위하여 필요하다.

이 방법에 대한 아이디어는 조혈모세포 분석에 사용해야 하는 쥐의 수를 줄이는 방법을 찾던 중 처음 떠올랐습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Xiongwei Cai입니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 분류된 조혈 줄기 줄기 세포와 전구 세포가 들어 있는 1.5ml 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 500배로 원심분리합니다.

원심분리가 끝나면 세포 펠릿을 방해하지 않고 100마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 폐기합니다. 5 미만, 000 세포가 있고, 분류한 표본의 양이 0.2 밀리리터 미만인 경우에, 첫째로 세포를 낮은 의무 0.2 밀리리터 PCR 관으로 원심분리의 앞에 옮긴다. 그러나, 5 미만 의 000의 세포가 있는 경우에, 그러나 분류한 표본의 양은 0.2 밀리리터 이상이고, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 500배 중력에 세포를 원심 분리하십시오.

원심분리 후 200마이크로리터의 상층액을 제외한 모든 상층액을 폐기합니다. 그런 다음 펠릿과 나머지 200 마이크로 리터의 상등액을 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세포 현탁액을 0.2 millil PCR 튜브로 옮기고 다시 원심분리합니다.

그런 다음 펠릿을 20-30 마이크로 리터의 상등액에 다시 현탁시키고 나머지는 버립니다. 필요한 경우, 2%의 소 태아 혈청에 인산염 완충 식염수를 첨가하거나 2%의 소 혈청 알부민을 재현탁 세포에 첨가합니다. 그런 다음 자동화된 세포 계수기를 사용하여 2-5마이크로리터의 재현탁 세포를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.

그런 다음 20 또는 100 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 500, 1, 000 및 2, 000 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 새로운 1.5 ml 튜브로 이동합니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 섭씨 4도에서 중력의 500배에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 그런 다음 제조업체 지침에 따라 인산가수분해효소 및 프로테아좀 억제제 및 DMSO를 용해하여 100배 원액을 준비합니다.

다음으로, 4중 Laemmli 샘플 버퍼를 동일한 양의 증류수로 희석하여 2중 Laemmli 샘플 버퍼를 만듭니다. 그런 다음 포스파타제와 프로테아좀 억제제의 100배 스톡 용액을 적당량으로 첨가하여 최종 농도를 2배 억제제와 2배 Laemmli 샘플 완충액으로 조정합니다. 인산가수분해효소 및 프로테아좀 억제제와 함께 동일한 부피의 2배 Laemmli 완충액을 추가하면 마이크로리터당 500개의 세포와 1배의 Laemmli 완충액의 최종 농도를 달성할 수 있도록 튜브의 잔류 상등액의 부피를 조정합니다.

그런 다음 용해물을 형성하기 위해 다시 중단합니다. 겔을 로드하기 전에 샘플 용해물을 열 블록에서 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 표준 프로토콜 전기 이동법 500에서 20, 100 볼트에 SDS 페이지를 통해서 000의 세포에 동등한 용해물의 1개에서 40 마이크로리터

폴리비닐리덴 멤브레인을 메탄올로 처리한 후 몇 초 동안 멤브레인을 증류수로 간단히 세척합니다. 그런 다음 전사 장치 제조업체가 제공한 지침에 따라 겔에서 멤브레인으로 단백질을 옮깁니다. 이식 후, 표준 프로토콜에 따라 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 2 밀리리터의 2 % 소 혈청 알부민과 인산염 완충 식염수로 멤브레인을 0.1 % 트윈으로 차단합니다.

멤브레인을 막은 후 희석된 항체로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 각각 5분 동안 0.1% Tween 20의 인산염 완충 식염수로 멤브레인을 세 번 세척합니다. 다음으로, 실온에서 1분 동안 2ml의 향상된 화학발광 완충액으로 멤브레인을 배양합니다.

이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출합니다. 베타 액틴 신호를 비교하기 위해 소변, 조혈 줄기 및 전구 세포에서 용해물을 준비하고 서양 플롯 분석을 수행했습니다. 2, 000에서 500의 조혈 전구 및 줄기 세포에서 12%SDS 페이지 젤에 적재된 1.5 밀리미터 우물에서 적재된 lysates에서 beta actin 신호에 있는 감소가 있다는 것은 아미노 얼룩에서 명확합니다.

또한, 겔에 캐스팅된 상이한 웰 크기로부터 얻어진 베타 액틴 신호를 비교하기 위함이다. 용해물을 겔의 1.5mm 및 3mm 웰에 적재한 다음 웨스턴 블롯 분석을 실시했습니다. 이 블롯은 1.5mm 웰에 적재된 500개의 조혈전구세포에서 제조된 용해물에서 얻은 베타 액틴 신호가 3mm 웰에 적재된 경우보다 훨씬 강하다는 것을 보여줍니다.

다음으로, 사이토카인 줄기세포 인자 자극에 대한 반응으로 리보솜 단백질 S6의 진핵생물 개시 인자 4G, 액틴 및 인산화에 대한 신호를 비교하기 위해 얻은 용해물을 아미노 블롯으로 분석했습니다. 블롯은 사이토카인 줄기세포 인자 자극을 가진 조혈 재생체의 세 가지 단백질 모두에 대해 더 강한 신호 강도의 존재를 보여줍니다. 시험관 내 대조군과 비교하여, 서로 다른 조혈모세포 부피에서 온 세 가지 단백질 모두에 대해 신호 강도가 증가하고 있다는 것도 분명합니다.

일단 숙달되면 기술적으로 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 적절하게 접근한다면. 이 절차를 시도하는 동안 세포를 정확하게 계수하고 용해물 세포를 로딩 버퍼로 지시하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 개발 후에는 줄기 세포 연구 분야의 연구원들이 소수의 세포에서 신호 경로를 탐구할 수 있도록 기술적으로 펠릿화됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 적은 수의 주소 조각으로 서양 플로팅을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. SDS 페이지에 사용하는 지역에 주의하세요.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.