Name: 조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 학습하세요 조혈 줄기 세포의 소량 웨스턴 블로팅 프로토콜을 통해 특정 단백질과 신호 전달 경로를 분석하는 방법을. 이 기법은 500개 미만의 세포로도 신뢰할 수 있는 결과를 제공하여 동물 실험을 줄이고 희귀 세포 집단 연구를 효율화합니다.

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국립 보건원 부여 R01 CA149976 (N.A.S)이이 작업을 지원 합니다.

모든 절차는 기관 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행 되어야 합니다. 절차 murine 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSCs, HPs)의 분석을 위해 개발 되었다 그러나 다른 세포 인구의 분석을 위해 적응 시킬 수 있다.
1. 교류 Cytometry 절연 Murine HSCs 및 HPs의
<ol><li>문학6에 설명 된 대로 murine 골 수 세포를 수확. 참고: 그림 1 과 그림 2에 표시 하는 데이터에 골 C57BL/6J 쥐에서 수확 했다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 마우스 리니지 고갈 키트를 사용 하 여 골 수 세포의 계보 소모를 수행 합니다.</li>
	<li>설명7에 대 한 관심의 세포 표면 마커 항 체와 세포를 품 어. 그림 1 과 그림 2에 나와 실험에서 Sca 1, 키트, Flt3, 및 계보 (Lin) 마커 Mac1, Gr1, CD3e, B220, 그리고 Ter119 항 체 사용 됩니다.</li>
	<li>정렬 2000-20000 린- Sca1++ Flt3 키트- 세포 (HSCs) 또는 Lin-Sca1-키트+ 셀 (HPs) 0.1 mL의 인산 염을 포함 하는 1.5 mL Eppendorf 관에 버퍼링 2% 태아 소와 염 분 (PBS) 혈 청 (FBS)입니다. 참고: 그림 1 과 그림 2에 표시 된 데이터에 대 한 셀은 정렬 Flow Cytometer 70 µ M 노즐을 사용 하 여. 최대 컬렉션 볼륨 1.4 mL 이다입니다.</li>
</ol>2. 샘플 준비
참고:이 단계는 중요 한. 샘플을 매우 신중 하 게 처리 합니다. 제거는 상쾌한, 될 매우 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
<ol><li>원심 분리기는 1.5 mL 튜브 4 ° C에서 진동 물통 회전자에서 정렬된 셀을 포함, 500 x g 5 셀에서 상쾌한의 약 100 µ L 제외한 모든 분 제거에 대 한 매우 부드럽게 사용 하는 피 펫 20 µ L 피펫으로 팁 작은. 펠 릿을 방해 하지 마십시오.<ol>
<li>샘플 미만 5, 000 셀이 포함 하는 경우 정렬 된 샘플의 총 볼륨은 0.2 mL 미만 전송 셀 먼저 낮은 바인딩 0.2 mL PCR 튜브 원심 분리 하기 전에.</li>
		<li>샘플 포함 된 경우 5, 000 개 미만의 세포 볼륨은 0.2 mL 이상, 5 분, 4 ° C, 500 x g에서 원심 분리기와 셀 아래로 회전 하 고는 상쾌한의 200 µ L를 제외한 모든 제거. 수송과 셀 상쾌한, 나머지 200 µ L에 다시 중단 다음 0.2 mL PCR 튜브에 세포를 전송 하 고 다시 아래로 회전. 두 번째 스핀 후 펠 릿에서 모든 하지만 20-30 µ L을 제거 하 고 다시 셀을 일시 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브에서 표면에 뜨는 왼쪽에 셀 resuspend 필요한 경우, 추가 추가 PBS 2 %FBS에서 / PBS (또한 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 / PBS, 또는 혼자 PBS) 농도 5를 x104 5 x 105 셀/mL. 참고: 셀 계산 사용 cytometry 셀을 일시 중단 하는 데 사용 하는 볼륨을 추정 하 여 수집.</li>
	<li>다시 일시 중단 된 셀의 2-5 µ L를 사용 하 여 (제조업체의 지침에 따라) 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer9를 사용 하 여 정확한 셀 농도 결정.</li>
	<li>다시 일시 중단 된 셀 원하는 새로운 1.5 mL 튜브에 세포 수를 포함 하는 볼륨을 전송. 그림1에서 실험, 2000, 1000, 500 HSCs 또는 HPs 전송 했다. 원하는 셀 수는 서쪽 오 점 하 여 얻은 신호 강도 의존 하 고 경험적으로 결정 됩니다. 20 µ L 또는 100 µ L Eppendorf 피 펫 팁을 사용 하 여 전송을 수행 합니다.</li>
	<li>5 분 500 x g, 4 ° C에서 진동 물통 회전자에 셀 원심</li>
	<li>재고 솔루션 x 100을 생성 하려면 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제를 분해.</li>
	<li>증류수의 상응 하는 금액으로는 제조업체에서 제공 하는 4 x Laemmli 샘플 버퍼를 diluting 하 여 2 x Laemmli 샘플 버퍼를 준비 합니다. 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제 2 x Laemmli 샘플 버퍼에 2 x 억제제의 최종 농도를 100 배 재고의 적절 한 금액을 추가 합니다. 참고: 2 x Laemmli 샘플 버퍼는 사전에 만들 수 있습니다 하지만 프로테아좀 및 인산 가수분해 효소 억제제 다음 단계에 설명 된 대로 2 x Laemmli 샘플 버퍼 (더하기 억제제) 셀 펠 릿에는 세포를 lyse 추가 직전 추가 되어야 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 셀 펠 릿에서 그리고 셀 펠 릿으로 튜브에 남아 상쾌한은 상쾌한의 일부를 제거, 2 x Laemmli 샘플 버퍼 플러스 500의 최종 농도 달성 하기 위해 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제의 동일한 볼륨 추가 셀/1 x Laemmli 샘플 버퍼에 µ l 참고: 예를 들어 셀 (단계 2.6) 펠 릿에서 상쾌한의 18 µ L를 제거 해야 centrifuging 후 단계 2.5에서 튜브와 남아 상쾌한의 2 µ L 2000 셀 20 µ L의 전체 볼륨에 전송 하는 경우 추가의 동일한 볼륨 (2 µ L) 1 x Laemmli 샘플 버퍼에 500 세포 / µ L의 최종 농도 달성 하기 위해 Laemmli 샘플 버퍼 x 2.</li>
	<li>최대한 빨리 lysate를 생성 하는 펠 릿 resuspend 이 시점에서, 샘플을 즉시 SDS 페이지 젤를 통해 electrophoresed 수 또는 스냅 액체 N2 에서 냉동 고 수 미래 사용을 위한-80 ° C에 저장.</li>
</ol>3입니다. 전기 이동 법
<ol><li>95 ° C에서 열 블록 또는 끓는 물에 5 분 동안 lysates 열.</li>
	<li>SDS 페이지 젤 100V에서 표준 프로토콜10를 사용 하 여 통해 (20000 셀 해당 최대 500에서 포함) lysates의 1-40 µ L를 electrophorese. 참고: 젤으로 로드 lysate의 볼륨 바람직한 신호를 생성 하는 데 필요한 셀의 수에 의해 결정 되 고 관심, 그리고 항 체의 품질의 단백질의 풍부에 따라 달라 집니다. 그림 1에서 데이터 2000, 1000, 500 셀 등가물 lysate의 획득 했다. 우물의 폭 3 m m에 1.5 m m. 치아 수는 1.5 m m의 범위에 잘려야 한다 상용 빗에서가 위를 사용 하 여 넓은 이빨을 가진.</li>
</ol>4. 전송 및 차단
참고: 서쪽 오 점 표준 프로토콜11다음을 수행 합니다. 단계는 간단히 여기에 설명 된:
<ol><li>10 s, 다음 씻어 짧게 막으로 증류수에 대 한 메탄올을 가진 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인을 pretreat.</li>
	<li>SDS 페이지 젤에서 전송 장치 제조업체에서 제공 하는 설명서의 지침에 따라 막 단백질을 전송.</li>
	<li>5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 PBST의 2 개 mL를 막 차단 전송, 다음 (0.1 %PBS 트윈) 표준 프로토콜11다음 4 ° C에서 하룻밤.</li>
</ol>5. 항 체 라벨
<ol><li>공급 업체에서 권장 하는 항 체 희석을 사용 하 여 4 ° C에서 하룻밤 통에 항 체를 막 품 어. 참고: 재료의 테이블에서 항 체, 우리 HSCs HPs와 해당 항 체 희석에 대 한 확인 한, 표시 됩니다. 항 체 라벨 표준 절차8를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
</ol>6입니다. 감지
<ol><li>씻고 막 3 시간, 실 온에서 PBST에 각 세척에 대 일 분.</li>
	<li>실 온에서 1 분에 대 한 향상 된 화학 버퍼의 2 개 mL를 막 품 어. 다음 제조업체의 지침, 또는 autoradiography 필름과 필름 프로세서 이미징 시스템을 사용 하 여 신호를 감지 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

저자는 선언 하는 관심의 충돌이 있다.

서 부 럽 조직 또는 세포에 특정 단백질 및 신호 통로의 활성화를 탐지 하기 위한 일반적인 기술입니다. 작은 조정에 일반적으로 사용 되는 절차를 도입 하 여 정기적으로 15000 HSCs, 그리고 경우에 따라 몇 가지로 500 HSCs 15 다른 단백질 (자료 테이블)을 감지할 수 있었습니다. The most이 프로토콜의 중요 한 단계는: 1) 정확 하 게 계산 셀, 2) 튜브, 사이 전송의 수를 최소화 및 3) lysing Laemmli 샘플 버퍼와 직접 셀. Lysing Laemmli 샘플 버퍼 셀 펠 릿, 우리는 보다는 제거는 상쾌한의 모든 셀 펠 릿에서 하 고 다시 만약 우리가 대신 튜브에 남아 있는 작은 양의 상쾌한 동등한 추가 Laemmli 샘플 버퍼에서 중단 발견 Laemmli 샘플 버퍼 x 2의 볼륨, 우리 셀 손실을 피할 수 있습니다. 셀 손실의 위험을 감소 또한 centrifuging 진동 물통 회전자에 셀. 트리밍 빗 이빨 잘의 폭을 줄이는 탐지의 감도 향상.
<p cla...

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 모든 혈액 계보를 야기할 수 있는 각자 경신 세포 이다. 그들은 생 화 확 적인 분석을 어려운 렌더링 골 수에서 비교적 드문 셀입니다. 접근 cytometry, 같은 희귀 세포 분석을 위한 적합 한 세포 표면 마커 및 세포내 단백질의 상대적인 양을 측정 하는 데 매우 유용 했습니다. 그러나, 항 체 접근을 사용 하 셀 permeabilization 절차의 사용을 필요로 하는 세포내 단백질의 분석 하 고 모든 세포 표면 epitopes 살아이 절차1,2. 또한, 다른 단백질 isoforms 또는 분열 제품을 구분 하는 항 체는 종종 cytometry, 사용할 수 없습니다 그리고 그러므로 조사 여전히 의존 서쪽 오 점 특정 유형의 분석.
세포 lysates의 서쪽 오 점 분석은 대부분 실험실에서 일상적인 절차입니다. 세포 세포 표면 분자의 epitopes를 유지 하는 기본 조건에서 순화 될 수 있다 그리고 세포 lysates 수 이후에 준비 하 고 분석 했다. 그러나, 서쪽에 의해 인구 오 점 드문 기본 셀에 단백질의 분석 euthanizing 충분 한 세포를 얻기 위해 동물의 많은 수를 요구할 수 있습니다. 여러 단계로 작은 조정 함으로써, 기존의 서쪽 더 럽 히 프로토콜 HSCs (관심사의 단백질에 따라 500-15000)의 상대적으로 작은 숫자에 단백질을 감지할 수 있었습니다. 조정 포함 셀, 셀 손실 최소화 하기 위해 튜브 사이 세포의 전송을 감소 셀 펠 릿을 신중 하 게 처리를 정확 하 게 계산 하 고 포함 프로테아좀 버퍼 lysing 집중 로드 셀의 정의 수 고 인산 가수분해 효소 억제제입니다. 많은 게시 된 보고서 포함 20000 이상의 HSCs3,,45,6,7; 얻은 서쪽 오 점 이 간단한 절차는 세포와 실험 동물 4와 40 배 사이 해당 데이터를 생성 하는 데 필요한 수를 줄일 것입니다. 프로토콜은 결과 셀 당 기준 보다는 내부 통제를 정상화 하도록 설계 되었습니다. 내부 컨트롤에 데이터 정규화는 간과 될 수 있는 단백질 수준에서 전반적인 감소의 검색 수 있습니다. 셀 당 기준 표준화의 중요성 유전자 표현 데이터8의 분석에 대 한 설명 했다 그리고 동일한 원리 서쪽 오 점 하 여 단백질을 측정에 적용 됩니다. 이 최적화 된 프로토콜은 세포의 작은 숫자를 분석할 필요가 누군가 위해 유용 해야 한다.

<table><tbody><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td> <td>피셔 사이언티픽</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>템 드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30 % 아크릴 아미델 비스 솔루션</td><td>바이오 라드</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M 트리스 HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS 페이지</td></tr><tr><td>1.0M 트리스 HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS 페이지</td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>미니 프로티안 3 빗</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>미니 프로티안 테트라 셀</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>전송 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>전송</td></tr><tr><td>PowerPac HC 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>전기 영동</td></tr><tr><td>이미징 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>신호 감지</td></tr><tr><td>4x Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS 전기영동 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>전기영동</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF 전송 키트, 40인용 블롯</td><td>Bio-Rad</td><td>1704272</td><td>전달</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 시</td><td>그마</td><td>11697498001</td><td>시료 준비</td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 칵테일</td><td>골드 생명공학</td><td>GB-450-1</td><td>시료 준비</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>세포 신호 전달</td><td>2469</td><td>WB 항체, 1000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): 그림2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>세포 신호</td><td>4858</td><td>WB 항체, 1000 세포에서 검증 항체 농도: 1:1000 참조(그림): Fig2</td></tr><tr><td>actin(HRP conjugated)</td><td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB 항체, 500개 세포에서 검증 항체 농도: 1:5000 참조(그림): Fig1, Fig2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (그림 5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>세포 신호 전달</td><td>2317</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (그림 4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>세포 신호</td><td>9644</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>세포 신호</td><td>4877</td><td>WB 항체, 15000 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>WB 항체, 15000 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>2983</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>actin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:3000 참조(그림): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>lineage depletion kit (마우스)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>조혈 줄기 및 전구 세포 정제</td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>조혈 줄기 및 전구 세포 정제</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>인산화 자극</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>세포 분류</td></tr><tr><td>항 B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>세포 분류</td></tr><tr><td>안티-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>세포 분류</td></tr><tr><td>안티-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>셀 분류</td></tr><tr><td>안티-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>셀 분류</td></tr><tr><td>안티-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>셀 분류</td></tr><tr><td>스페이서 플레이트, 1.0 mm 통합 스페이서</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International</td><td>A30075</td><td>막 차단</td></tr><tr><td>세럼</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>중간 보충제</td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>세포 계수</td></tr>기 <tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; S17040</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>플림</td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td>신호 감지</td></tr><tr><td>의료용 필름 프로세서</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>신호</td></tr><tr><td>감지 Supersignal West Femto 최대 감도 기판</td><td>Therom Scientific</td><td>34096</td><td>신호 감지</td></tr><tr><td>Allegra X-15R 원심분리기(로터 SX4750A)</td><td>Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>BLUEstain protein ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P007-500</td><td>전기영동</td></tr><tr><td>세포 분류기</td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>시료 준비</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>전기영동</td></tr></tbody></table>

조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 드문 셀, 오래만 25000 ~ phenotypic 포함 된 마우스 골 수와 함께 다시 채우기 HSCs 용어. 서쪽 더 럽 히 프로토콜 최적화 되었고 HSCs (500-15000 셀)의 작은 숫자의 분석에 적합 합니다. Phenotypic HSCs 정화, 정확 하 게 계산, 고 직접 Laemmli 샘플 버퍼에서 lysed. Lysates 셀의 동등한 숫자를 포함 하는 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석 되었다 오 점 준비 하 고 더럽혀 프로토콜 표준 서에 따라 처리. 이 프로토콜, 2000-5000를 사용 하 여 HSCs는 정기적으로 분석 될 수 있다, 그리고 어떤 경우에 데이터는 몇 가지 대부분의 출판물에 20000 ~ 40, 000 셀에 비해 500 셀으로에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 다른 조 혈 모 세포에 일반적으로 적용 되 고 표준 실험실 절차를 사용 하 여 셀의 작은 숫자의 일상적인 분석을 수 있습니다.

500-2000 순화 HSCs와 HPs에서 대표적인 결과 그림 1 과 그림 2에 표시 됩니다. 그림 1 에서 β-말라 신호에서 몇 가지 500 HSCs로 검출 될 수 있다 고 HPs 한 마우스의 골 수에서 정화. Note는 3.0 m m 우물에 로드 보다 500 HPs에서 훨씬 더 강력한 신호 생산 로드는 lysates 1.5 m m 우물. 그림 2 은 EIF4G의 서쪽 오 점 및 Rps6의 인 산화 (p-Rps6), 둘 다 단백질 번역12, HSCs의 규칙에 관련 되 고 HPs와 줄기 세포에 의해 자극 없이 (SCF) 생체 외에서요인.
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프로토콜 blotting 표준 서 500 조 혈 줄기 또는 조상 세포로 몇 가지 분석을 위해 최적화 되었다. 최적화 포함 셀 샘플의 처리, 튜브, 사이 전송 제한 및 직접 Laemmli 샘플 버퍼에 세포를 lysing 주의 한다.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

이 웨스턴 블로팅 프로토콜의 오버 목표는 적은 수의 세포에 웨스턴 블롯을 수행하는 것입니다. 이 방법은 특정 단백질의 존재 또는 풍부함 또는 신호 경로의 활성화와 같은 조혈모세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 20 이하, 000 세포 미만을 요구하다 이다 그래서 몇몇 동물은 1 차적인 세포의 희소한 집단을 분석하기 위하여 필요하다.이 방법에 대한 아이디어는 조혈모세포 분석에 사용해야 하는 쥐의 수를 줄이는 방법을 찾던 중 처음 떠올랐습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Xiongwei Cai입니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 분류된 조혈 줄기 줄기 세포와 전구 세포가 들어 있는 1.5ml 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 500배로 원심분리합니다.원심분리가 끝나면 세포 펠릿을 방해하지 않고 100마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 폐기합니다. 5 미만, 000 세포가 있고, 분류한 표본의 양이 0.2 밀리리터 미만인 경우에, 첫째로 세포를 낮은 의무 0.2 밀리리터 PCR 관으로 원심분리의 앞에 옮긴다. 그러나, 5 미만 의 000의 세포가 있는 경우에, 그러나 분류한 표본의 양은 0.2 밀리리터 이상이고, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 500배 중력에 세포를 원심 분리하십시오.원심분리 후 200마이크로리터의 상층액을 제외한 모든 상층액을 폐기합니다. 그런 다음 펠릿과 나머지 200 마이크로 리터의 상등액을 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세포 현탁액을 0.2 millil PCR 튜브로 옮기고 다시 원심분리합니다.그런 다음 펠릿을 20-30 마이크로 리터의 상등액에 다시 현탁시키고 나머지는 버립니다. 필요한 경우, 2%의 소 태아 혈청에 인산염 완충 식염수를 첨가하거나 2%의 소 혈청 알부민을 재현탁 세포에 첨가합니다. 그런 다음 자동화된 세포 계수기를 사용하여 2-5마이크로리터의 재현탁 세포를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.그런 다음 20 또는 100 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 500, 1, 000 및 2, 000 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 새로운 1.5 ml 튜브로 이동합니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 섭씨 4도에서 중력의 500배에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 그런 다음 제조업체 지침에 따라 인산가수분해효소 및 프로테아좀 억제제 및 DMSO를 용해하여 100배 원액을 준비합니다.다음으로, 4중 Laemmli 샘플 버퍼를 동일한 양의 증류수로 희석하여 2중 Laemmli 샘플 버퍼를 만듭니다. 그런 다음 포스파타제와 프로테아좀 억제제의 100배 스톡 용액을 적당량으로 첨가하여 최종 농도를 2배 억제제와 2배 Laemmli 샘플 완충액으로 조정합니다. 인산가수분해효소 및 프로테아좀 억제제와 함께 동일한 부피의 2배 Laemmli 완충액을 추가하면 마이크로리터당 500개의 세포와 1배의 Laemmli 완충액의 최종 농도를 달성할 수 있도록 튜브의 잔류 상등액의 부피를 조정합니다.그런 다음 용해물을 형성하기 위해 다시 중단합니다. 겔을 로드하기 전에 샘플 용해물을 열 블록에서 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 표준 프로토콜 전기 이동법 500에서 20, 100 볼트에 SDS 페이지를 통해서 000의 세포에 동등한 용해물의 1개에서 40 마이크로리터.폴리비닐리덴 멤브레인을 메탄올로 처리한 후 몇 초 동안 멤브레인을 증류수로 간단히 세척합니다. 그런 다음 전사 장치 제조업체가 제공한 지침에 따라 겔에서 멤브레인으로 단백질을 옮깁니다. 이식 후, 표준 프로토콜에 따라 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 2 밀리리터의 2 % 소 혈청 알부민과 인산염 완충 식염수로 멤브레인을 0.1 % 트윈으로 차단합니다.멤브레인을 막은 후 희석된 항체로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 각각 5분 동안 0.1% Tween 20의 인산염 완충 식염수로 멤브레인을 세 번 세척합니다. 다음으로, 실온에서 1분 동안 2ml의 향상된 화학발광 완충액으로 멤브레인을 배양합니다.이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출합니다. 베타 액틴 신호를 비교하기 위해 소변, 조혈 줄기 및 전구 세포에서 용해물을 준비하고 서양 플롯 분석을 수행했습니다. 2, 000에서 500의 조혈 전구 및 줄기 세포에서 12%SDS 페이지 젤에 적재된 1.5 밀리미터 우물에서 적재된 lysates에서 beta actin 신호에 있는 감소가 있다는 것은 아미노 얼룩에서 명확합니다.또한, 겔에 캐스팅된 상이한 웰 크기로부터 얻어진 베타 액틴 신호를 비교하기 위함이다. 용해물을 겔의 1.5mm 및 3mm 웰에 적재한 다음 웨스턴 블롯 분석을 실시했습니다. 이 블롯은 1.5mm 웰에 적재된 500개의 조혈전구세포에서 제조된 용해물에서 얻은 베타 액틴 신호가 3mm 웰에 적재된 경우보다 훨씬 강하다는 것을 보여줍니다.다음으로, 사이토카인 줄기세포 인자 자극에 대한 반응으로 리보솜 단백질 S6의 진핵생물 개시 인자 4G, 액틴 및 인산화에 대한 신호를 비교하기 위해 얻은 용해물을 아미노 블롯으로 분석했습니다. 블롯은 사이토카인 줄기세포 인자 자극을 가진 조혈 재생체의 세 가지 단백질 모두에 대해 더 강한 신호 강도의 존재를 보여줍니다. 시험관 내 대조군과 비교하여, 서로 다른 조혈모세포 부피에서 온 세 가지 단백질 모두에 대해 신호 강도가 증가하고 있다는 것도 분명합니다.일단 숙달되면 기술적으로 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 적절하게 접근한다면. 이 절차를 시도하는 동안 세포를 정확하게 계수하고 용해물 세포를 로딩 버퍼로 지시하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 개발 후에는 줄기 세포 연구 분야의 연구원들이 소수의 세포에서 신호 경로를 탐구할 수 있도록 기술적으로 펠릿화됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 적은 수의 주소 조각으로 서양 플로팅을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. SDS 페이지에 사용하는 지역에 주의하세요.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

이 비디오는 인간 면역 체계(HIS) 마우스를 생성하는 기술을 보여줍니다. CD34+ 조혈모세포(HSC)는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 인간 제대혈 버피 코트 세포에서 분리됩니다. CD34+ HSC는 사이토카인이 풍부하고 동결 보존된 성장 배지에서 확장됩니다. 마지막으로, 해동된 HSC를 면역결핍 새끼 마우스에 주입하여 HIS 마우스 모델을 확립합니다.

제대혈 조혈 줄기세포를 분리하여 인간 면역계 마우스를 생성하다

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

세포에 있는 체세포 돌연변이 패턴은 이전 돌연변이 노출을 반영하고 발달 혈통 관계를 밝힐 수 있습니다. 여기에 제시된 개별 조혈 줄기 및 전구 세포에서 체세포 돌연변이를 분류하고 분석하는 방법론이 제시된다.

인간의 혈액의 돌연변이 하중과 클론 구성 특성화

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

이 프로토콜은 풍부한 지방산, 콜레스테롤, 사이토카인의 낮은 농도 및 저산소증을 사용하여 골수 마이크로 환경을 모방하여 체외에서 정지한 인간 조혈 줄기 세포의 유지를 가능하게 합니다.

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

학습하세요 조혈 줄기 세포의 소량 웨스턴 블로팅 프로토콜을 통해 특정 단백질과 신호 전달 경로를 분석하는 방법을. 이 기법은 500개 미만의 세포로도 신뢰할 수 있는 결과를 제공하여 동물 실험을 줄이고 희귀 세포 집단 연구를 효율화합니다.

조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

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