Name: 화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 학습하세요 분할-TET2 효소 CiDER를 이용한 화학적 유도 DNA 하이드록시메틸화 및 후성유전체 리모델링 방법을. 포유류 세포에서 시간적 제어가 가능한 이 기술은 후성유전학 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리 금융 감사 지원 건강의 국가 학회에서 부여 (R01GM112003 YZ), 웰 치 재단 (YZ에 될-1913 년), 미국 암 협회 (YZ에 RSG-16-215-01 TBE), 암 예방 및 연구 연구소의 텍사스 (YH에 RR140053 YZ RP170660), 미국 심장 협회 (YH에 16IRG27250155), 그리고 존 S. 던 재단 공동 연구 보너스 프로그램.

1. 세포 문화, 플라스 미드 Transfection 및 화학 유도
<ol>
	<li>문화는 부착 셀 라인 (예, 인간 미 발달 신장 HEK293T 셀) Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)에 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 100 U/mL 페니실린, 5% CO2와 37 ° C에서 스 보완.</li>
	<li>사과 쥬 스 플라스 미드와 셀 transfect
	<ol>
		<li>Transfection 전에 적어도 18 h, 2.5 ml 당 적절 한 DMEM의 씨앗 0.3 x 106 셀 6 잘 플레이트에 고 37 ° C 하룻밤 60-80 %confluency 도달에서 세포를 품 어.</li>
		<li>미리 사용 하기 전에 실내 온도에 transfection 시 따뜻한.</li>
		<li>무 균 튜브에 혈 청 자유로운 매체의 장소 250 µ L. 참고:이 금액은 80 %confluency 6 잘 플레이트에 대 한 맞춤형. 필요한 경우, 비례 또는 셀 숫자의 크기에 따라 중간 금액을 조정 합니다.</li>
		<li>사과 쥬 스18 또는 TET2의 촉매 도메인 인코딩 플라스 미드의 2.5 µ g 추가 (긍정적인 제어 TET2CD)12,13 혈 청 무료 매체와 부드럽게 pipetting으로 혼합.</li>
		<li>7.5 µ L transfection 시 약의 희석된 DNA 혼합물에 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합.</li>
		<li>20-30 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
		<li>미리 데워 진된 미디어 변경 우물에 drop-wise 혼합물을 추가 하 고 부드럽게 흔들어 균일 하 게 배포 transfection 시 약 및 DNA 혼합물 셀 문화 접시.</li>
		<li>하룻밤 사이, 세포와 혼합 incubate 고 transfection 시 약 2 ml 신선한 완전 한 DMEM 미디어를 포함 하를 바꿉니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>화학 유도
	<ol>
		<li>Rapamycin 재고 (DMSO에 용 해) 적절 한 완전 한 매체에서 20 µ M의 농도의 희석 2 mM.</li>
		<li>20 µ L 희석된 rapamycin의 200의 최종 농도 도달 2 mL 매체에 유지 하는 transfected 세포에 추가 nM. 참고: 48 h에 대 한 보육, 후 셀은 5hmC 세대의 정량화 또는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비. 필요한 경우, 유도 효율은 셀 아래 설명 된 대로 추가 5hmC 부 량에 대 한 모든 3 h를 취 함으로써 모니터링 고 그림 1에 표시 된 수 있습니다.</li>
		<li>5hmC 유도 효율성의 더 나은 정량화에 대 한 시드 웰 스 모니터 셀 3 시간 마다 구분 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunostaining에 의해 Rapamycin 유도 5hmC 생산의 정량화
<ol>
	<li>5hmC 면역 형광 염색 참고: 접시의 모든 세포를 충당 하기 위해 3 N HCl와 PBS에서 충분 한 양의 4 %paraformaldehyde, 0.2% 계면 활성 제 (Triton X-100) 등으로 구성 된 고정 솔루션을 추가 합니다. 예를 들어 솔루션의 500 µ L 6-잘 접시에 잘에 대 한 충분 한 것입니다. 실 온에서 모든 단계를 수행 합니다.<ol>
		<li>셀을 수정, 추가 4% paraformaldehyde PBS에 rapamycin 치료 셀 주위 온도에 15 분 동안에. 컨트롤 그룹에 대 한 mCherry-사과주 rapamycin 치료 없이 표현 하는 셀을 사용 합니다. 교 반 하십시오 하지 않습니다. 주의: Paraformaldehyde 독성이 있다. 적절 한 보호를 착용 하십시오.</li>
		<li>통 솔루션을 삭제 합니다. 세포 막 permeabilize를 30 분 PBS에 0.2% 계면 활성 제와 고정된 셀을 품 어.</li>
		<li>Permeabilization 솔루션을 삭제 합니다. Permeabilized 셀에 3 N HCl를 추가 하 고 DNA를 변성을 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>HCl 추가 100 mM Tris HCl 버퍼 (pH 8.0) pH의 중성화에 대 일 분에 대 한 셀을 삭제 합니다.</li>
		<li>모든 솔루션을 삭제 합니다. 셀에 대 한 PBS와 철저 하 게 씻어 3-5 시간. PBS를 철저 하 게 제거 합니다. 참고: 모든 세척 단계에 대 한 PBS의 충분 한 양을 추가 합니다. 예를 들어 1 mL의 PBS 6 잘 플레이트에 대 한 충분 하다.</li>
		<li>1 %BSA 및 0.05%의 계면 활성 제 (예: 트윈 20) PBS에 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 블로킹 버퍼를 추가 하 여 셀을 차단 합니다.</li>
		<li>삭제 차단 솔루션. 셀에 희석된 5hmC 항 체 (1: 200)을 추가 하 고 실 온에서 2 시간 또는 하룻밤 4 ° c.에 품 어</li>
		<li>3 시간 15 분 대 한 PBS 가진 세포를 씻어.</li>
		<li>추가 희석된 fluorophore (FITC)-셀에 이차 항 체 (1: 200)을 활용 하 고 1 시간에 품 어.</li>
		<li>워시 PBS 가진 셀 세 번 광범위 하 게 잔여 항 체를 제거 하.</li>
		<li>4'의 250 ng/mL을 추가, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 5 분에 대 한 핵 얼룩 제거 얼룩 솔루션.</li>
		<li>Immunostained 셀 confocal 영상에 대 한 슬라이드 또는 유리 하단 문화 접시를 탑재 합니다. 대표 결과 그림 1B에 보였다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometry 참고: 다음 얼룩 절차에 대 한 96-잘 라운드 바닥판을 사용 합니다. 일반적으로, 150 µ L의 시 약은 각 잘 충분 합니다.<ol>
		<li>FACS 버퍼 (1 %BSA, 2 mM EDTA와 PBS)에 rapamycin 유도 transfected 세포 resuspend Rapamycin 치료 없이 사과 표현 셀을 사용 하 여 컨트롤 그룹에 대 한 있습니다.</li>
		<li>수정 하 고 단계 2.1에 설명 된 대로 세포를 permeabilize.</li>
		<li>10 분 동안 DNA를 변성 하 셀 2 N HCl를 추가 합니다.</li>
		<li>HCl 중화를 취소 하 고 단계 2.1에 설명 된 대로 세포를 차단 합니다.</li>
		<li>셀에 희석된 안티-5hmC 항 체 (1: 200)을 추가 하 고 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에 대 한 품 어</li>
		<li>FACS 버퍼 셀 세 번 씻어. FACS 버퍼를 철저 하 게 제거 합니다.</li>
		<li>추가 희석된 fluorophore (FITC)-형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 분석, 이차 항 체 (1:400)를 활용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
		<li>FACS 버퍼 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>샘플은 FACS 분석에 대 한 준비가 되었습니다. 대표 결과 그림 1 c-D에 표시 했다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 점 오 점 분석 결과 5hmC 및 5-methylcytosine (5mC) 척도를 도달
<ol>
	<li>상업적인 DNA 추출 키트를 사용 하 여 transfected 및 rapamycin 유도 세포에서 게놈 DNA를 격리 합니다. Rapamycin 치료 없이 사과 쥬 스 페 셀을 사용 하 여 컨트롤 그룹에 대 한 있습니다.</li>
	<li>80 ° C와 사전 담가 니트로 막 이중 증 류 H2O 그리고 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 10 분 x 6에서에 진공 오븐이 열.</li>
	<li>96-잘 PCR 접시에 같은 양의 DNA (TE 버퍼에 총 µ 2 g)의 60 µ L을 로드 합니다. 나머지 우물에 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>확인 두 배 직렬 희석 세로 96 잘 접시에 2 행에 동일한 열 위치를 30 µ L 솔루션의 행 1에 전송 하 여 합니다. 다시 혼합 하 고 경계를 도달까지 후속 행에서 웰 스 솔루션의 30 µ L를 전송.</li></ol>마지막으로 30 µ L을 제거 합니다.
	<li>각 음을 1m NaOH와 10 mM EDTA의 20 µ L을 추가 하 고 접시를 봉인 완전히 DNA 이중 변성에 95 ° C에서 10 분을 위한 혼합물을가 열.</li>
	<li>즉시 얼음에 샘플 진정 차가운 2 M 염화 아세테이트 (pH 7.0)의 50 µ L를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 품 어. 참고: 단계 3.7-3.10 진공의 사용을 포함.</li>
	<li>미리 젖된 막으로 점 오 점 장치를 조립 하 고 잔여 버퍼 풀 진공을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>점 오 점 기구의 각 잘 하 테 버퍼의 200 µ L을 추가 하 여 막 씻으십시오. TE 버퍼를 제거 하는 진공을 켭니다.</li>
	<li>점 오 점 기구의 각 우물에 변성된 DNA (이전 단계 3.1-3.6에서에서 준비)을 로드 합니다. 솔루션을 제거 하는 진공을 켭니다.</li>
	<li>SSC 및 제거 잔여 솔루션 완전히 진공을 사용 하 여 x 2의 200 µ L을 추가 하 여 막 씻으십시오.</li>
	<li>점 오 점 장치를 분해, 막 밖으로가 고 2의 20 mL와 함께 전체 막 씻어 x SSC.</li>
	<li>20 분 동안 막 건조</li>
	<li>2 시간에 대 한 진공에서 80 ° C에서 막 구워.</li>
	<li>막에 차단 솔루션 (TBST에 5% 탈지 우유)를 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>삭제 차단 솔루션. 희석된 5hmC (1:5, 000) 또는 (1:1, 000) 5mC 추가 막에 항 체 및 4 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	<li>잔여 항 체를 제거 하려면 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막 씻으십시오. TBST를 철저 하 게 제거 합니다.</li>
	<li>HRP 활용 된 이차 항 체를 추가 (1:10, 000 안티 토끼 HRP(5hmC) 또는 반대로 마우스 HRP(5mC)) 막에 대 한 1:3,000 및 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막 씻으십시오.</li>
	<li>ECL 기판 화학 검출기를 사용 하 여 5hmC 신호의 시각화에 대 한 막에 더럽혀 서 부를 추가 합니다. 대표 결과 그림 1E에 표시 했다.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
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<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
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<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
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<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
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<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
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<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기 우리 DNA hydroxymethylation의 일시적인 제어를 달성 하기 위해 설계 된 분할-TET2 효소를 사용 하 여를 일러스트 있다. TET 가족 5-methycytosine dioxygenase의의 발견, 많은 연구 해독 TET 단백질과 그들의 주요 촉매 제품 5hmC,12,3,의 생물 학적 기능 수행 되었습니다. 4,5,6,7,,89,<sup class="x...

DNA 메 틸 화, 주로 5-methylcytosine (5mC) 형성 시 토 신의 탄소 5 위치에 메 틸 그룹의 추가를 나타냅니다, 그리고 DNA 메 틸-transferases (DNMTs)에 의해 촉매. 5mC transcriptional 억제, x 염색체 비활성화와 transposon 입을1에 대 한 신호를 종종 포유류 게놈에 있는 주요 epigenetic 마크 역할을 합니다. DNA 메 틸 화의 반전 10-엘 프 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. TET 효소 철 (II)에 속하는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxycytosine (5caC)의 연속 산화 촉매는 종속 dioxygenases 2 oxoglutarate. TET 중재 5mC 산화 epigenetic 제어할 포유류 게놈의 추가 계층을 부과 한다. TET의 발견 TET 단백질의 생물 학적 기능 및 그들의 주요 촉매 제품 5hmC 공개 후 필드에 강렬한 관심을 촉발 했다. 5hmC 하지만 중간 TET 중재 활성 DNA demethylation2,,34일 동안 이지만 또한 epigenetic 안정 역할 표시5,6,7,8 . DNA hydroxymethylation에서 변경 일부 인간의 장애9,,1011, 인과 관계와 연결 된 DNA hydroxymethylation은 높은 유전자 발현과 관련 된 탈 선 후 성적인 수정 DNA에는 고기 사이 종종 남아 설립 도전, 시간적 및 공간적 정의 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족에 부분적으로 관찰 될 수 있습니다. 해상도입니다.
여기 우리는 화학을 유도할 수 있는 epigenome 도구 (사과주) 인과 관계의 연구를 직면 하는 장애물을 극복 하기 위해 DNA hydroxymethylation와 유전자 전사 사이 개장의 사용을 보고 합니다. 가정에는 디자인을 기반으로 하는 TET2의 촉매 도메인 (TET2CD) 2 개의 비활성 파편 포유류 세포에서 표현 하는 때로 분할할 수 있습니다 및 화학적으로 유도할 수 있는 이합체 화 접근법 ( 여 효소 기능을 복원할 수 있습니다 그림 1A). 분할-TET2CD 시스템을 설정 하기 위해 우리는 TET2CD, Cys 풍부한 지역 및 더블-좌초 β 나선 (DSBH) 배, TET2 DNA 복잡 한 낮은 복잡성 지역12부족의 보고 된 결정 구조 기초의 구성에서 6 사이트를 선택. 합성 유전자 인코딩 rapamycin 유도할 수 있는 이합체 화 모듈 FK506 바인딩 단백질 12 (FKBP12)와 FKBP rapamycin 바인딩 도메인 (FRB) rapamycin14,15, 자체 cleaving 펩타이드 T2A 함께 포유류 대상의 polypeptide 시퀀스16,17, TET2CD 내의 선택한 분할 사이트에 개별적으로 삽입 되었다. 우리의 엔지니어링 대상으로 TET2의 선택 다음과 같은 고려 사항을 기반으로 합니다. 수 반하는 감소 된 DNA hydroxymethylation TET2에서 첫 번째, 체세포 돌연변이 골수성 질환 등 암10, 대 피할 수 민감한 사이트에 유용한 정보를 제공 하는 인간의 장애에서 자주 관찰 된다 삽입입니다. 둘째, TET2 촉매 도메인, 특히 낮은 복잡성 지역의 큰 분수는 효소 기능12, 유도할 수 있는 후 성적인 수정에 대 한 최소화 된 분할 TET2 공예를 활성화를 위해 불가결 이다. 15 구조, 심사 후 포유류 시스템에서 그것의 효소 활동의 가장 높은 rapamycin 유도할 수 있는 복원 전시 하는 구문 선택 되었고 사과 쥬 스18로 지정. 우리는 여기 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 rapamycin와 리 모델링 후 사과 mCherry 태그를 사용 하 여 설명 하 고 사과 중재 5hmC 생산 모델 셀룰러 시스템 HEK293T에서에서 유효성 검사에 세 가지 방법 제시.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% 용액</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>알부민, 소</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) 항체 (pAb)</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsosorbed Secondary 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB 이코노미 진공 오븐, 0.6 Cu.Ft. (17리터)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-methylcytosine (5mC) 항체, 클론 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP 관련 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP 결합 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL 솔루션</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

화학을 유도할 수 있는 dna hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-tet2 효소

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA 메 틸 화 포유류 게놈에 안정적이 고 상속 후 성적인 수정 이며, 세포 기능 제어 유전자 발현 조절에 관여. DNA 메 틸 화, 또는 DNA demethylation의 반전은 dioxygenases의 10-11 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. 그것은 널리 알려졌다 탈 DNA 메 틸 화와 demethylation 발달 결함과 암와 관련 된, 있지만 어떻게 이러한 후 성적인 변경을 직접 기여할 진 식 또는 질병 진행에 후속 변경 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는 정의 된 시간적, 공간적 해상도에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족 때문에 크게 불분명 남아 있습니다. 이 장애물을 극복 하기 위해 우리는 분할 TET2 효소를 5-methylcytosine (5mC) 산화의 일시적인 제어 및 후속 개장 하는 포유류 세포에 있는 후 성적인 국가의 단순히 화학 물질을 추가 하 여 사용할 수 있도록 설계 되었습니다. 여기, 우리 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 (사이 다), 포유류 세포와 함께 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 화학 유도할 수 있는 생산 측정 조작된 분할-TET2 효소에 따라 도입 방법 설명 immunostaining, cytometry 또는 점 오 점 분석 결과. 이 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 유전자 코드를 변경 하지 않고 셀룰러 시스템 질문 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 시스템에서 epigenotype−phenotype 관계를 프로 빙에 광범위 한 사용을 찾을 것입니다.

유도할 수 있는 화학 5mC-5hmC 변환 단일 셀 수준, 교류 cytometry 분석, transfected (mCherry 양성) 세포 인구에 또는 더 양적 점 오 점 분석 결과 그림 1에서 볼 수 있듯이 immunostaining에 의해 유효성 수 있습니다. TET2, 또는 TET2CD의 촉매 도메인 긍정적인 통제로 연구에 걸쳐 사용 되었다. 5hmC 및 chromatin 접근성에 rapamycin 유도 변경의 게놈 넓은 매핑에 대 한 자세한 내용은 참조 18-20 참조.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56858/56858fig1.jpg"> 
그림 1: HEK293T 셀에서 유도할 수 있는 DNA hydroxym...

자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.

화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

이 일련의 실험의 전반적인 목표는 CiDER라고 하는 엔지니어링된 split-TET2 효소를 포유류 세포에 도입하여 하이드록시메틸화 및 후성유전학적 리모델링과 같은 유도성 DNA 변형을 수행하는 것입니다. 이 방법은 다음과 같은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 엔지니어링된 split-TET2 효소가 5-메틸시토신 산화의 시간적 제어와 화학 첨가제로 포유류 세포의 후성유전학적 상태의 후속 리모델링을 허용한다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 10%의 열 비활성화 FBS와 100단위의 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 부착 세포주를 배양합니다.섭씨 37도에서 세포를 5%CO2로 배양합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CiDER 플라스미드로 세포를 transfection합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다.다음 날, transfection 시약이 함유된 배지를 완전한 새 DMEM으로 교체합니다. 세포를 화학적으로 유도하려면 200 나노몰의 최종 농도에 도달하기 위해 2밀리리터의 배지로 유지되는 형질주입된 세포에 20마이크로리터의 희석된 라파마이신을 첨가합니다. 유세포분석을 수행하려면 transfection된 세포와 Rapamycin에 유도된 세포를 FACS buffer에 재현탁합니다.대조군의 경우, 라파마이신 처리 없이 CiDER 발현 세포를 사용합니다. text protocol에 설명된 대로 셀을 수정하고 투과화합니다. 그런 다음 세포에 두 개의 일반 염산을 첨가하여 10분 동안 DNA를 변성시킵니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 중화하고 차단한 후 희석된 항-5hmC 항체를 세포에 첨가합니다. 세포를 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후 FACS 완충액으로 세포를 세 번 세척합니다.FACS 버퍼를 완전히 제거합니다. FACS 분석을 위해 희석된 형광단 접합 2차 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 FACS 버퍼로 셀을 세 번 세척합니다.세척 후 샘플은 FACS 분석을 위한 준비가 됩니다. 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 transfection된 세포와 Rapamycin에 의해 유도된 세포에서 게놈 DNA를 분리합니다. 대조군의 경우, 라파마이신(Rapamycin)을 처리하지 않은 CiDER 형질주입 세포를 사용합니다.진공 오븐을 섭씨 80도로 가열합니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 이중 증류수에 미리 담근 다음 6X SSC 버퍼에 10분 동안 담가둡니다. 다음으로, 60마이크로리터의 동일한 양의 DNA를 96웰 PCR 플레이트에 로드합니다.나머지 웰에 30마이크로리터의 TE 버퍼를 추가합니다. 1열에 있는 30마이크로리터의 용액을 2행의 동일한 컬럼 위치로 이동시켜 96웰 플레이트에서 수직으로 2배 연속 희석을 수행합니다. 다시 혼합하고 경계에 도달할 때까지 30마이크로리터의 용액을 다음 행의 우물로 옮깁니다.그런 다음 우물에서 마지막 30마이크로리터를 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 20마이크로리터의 1몰 수산화나트륨과 10밀리몰 EDTA를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 혼합물을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열하여 DNA 이중체를 완전히 변성시킵니다.즉시 얼음에서 샘플을 식히십시오. 각 웰에 50마이크로리터의 얼음처럼 차가운 2몰 암모늄 아세테이트를 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 한편, 미리 담근 멤브레인과 함께 dot-blot 장치를 조립합니다.완전 진공을 사용하여 잔류 버퍼를 제거합니다. dot-blot 장치의 각 well에 200마이크로리터의 TE 버퍼를 추가하여 멤브레인을 세척합니다. 진공 청소기를 켜서 TE 버퍼를 제거합니다.다음으로, 변성된 DNA를 dot-blot 장치의 각 well에 로드합니다. 용액을 제거하려면 진공 청소기를 켜십시오. 200마이크로리터의 2X SSC를 첨가하여 멤브레인을 세척하고 진공을 사용하여 잔류 용액을 완전히 제거합니다.도트 블롯 장치를 분해합니다. 그런 다음 멤브레인을 꺼내고 20mL의 2X SSC로 멤브레인 전체를 헹굽니다. 멤브레인을 20분 동안 자연 건조시킵니다.멤브레인을 더 건조시키려면 진공 상태에서 80도에서 2시간 동안 굽습니다. 멤브레인에 차단 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 차단 용액을 버린 후 희석된 5-hmC 또는 5-mC 항체를 멤브레인에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.TBST로 멤브레인을 10분 동안 3회 세척하여 잔류 항체를 제거합니다. TBST를 철저히 제거한 후 멤브레인에 HRP 접합 2차 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다.TBST로 멤브레인을 10분 동안 3회 세척합니다. 마지막으로, 화학발광 검출기를 사용하여 5-hmC 신호를 시각화하기 위해 멤브레인에 ECL 웨스턴 블로팅 기질을 추가합니다. 유세포 분석에 의한 CiDER 매개 5-hmC 생산의 대표적인 정량 결과가 여기에 나와 있습니다.라파마이신 처리된 조건에서 CiDER를 발현하는 세포만이 5-hmC 수준의 현저한 증가를 보여줍니다. dot-blot assay에 의한 전체 세포 집단에서 5-hmC 수준의 전반적인 변화의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 로딩 제어는 입력 DNA의 총량에 대한 에틸렌 블루 염색으로 시각화됩니다.결과는 Rapamycin 처리가 무시할 수 있는 배경 활성을 가진 CiDER 발현 HEK293T 세포에서 5-hmC의 강력한 생산을 유도한다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 후성유전학 분야의 연구자들이 유전 코드를 변경하지 않고 세포 기능을 탐구하고 다양한 생물학적 시스템에서 후성유전형과 표현형 관계를 조사할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

여기, 우리는 활성 태그 인간의 효율적인 단일 단계 정화에 대 한 프로토콜 10-11 전 2 (TET2) 제시 5-methylcytosine dioxygenase 이온-교환 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량을 사용 하 여 그 분석 결과 사용 하 여 분석 (LC-MS/MS)-기반 접근.

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.

더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

여기에서는 높고, 장기적이며, 안정적이며, 표적 침묵 효율이 높고 게놈 전체, 표적 외 활성이 낮은 조작된 전사 억제제(ETR)의 시험관 내 선택을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우를 통해 후보 ETR의 초기 복잡한 레퍼토리를 짧은 목록으로 줄일 수 있으며, 이는 치료적으로 관련된 환경에서 추가 평가에 적합합니다.

In Vitro (시험관 ) 표적 후성유전학적 침묵을 위한 엔지니어링된 전사 억제제 선택

여기에서는 NgTET 효소를 사용하여 박테리오파지의 DNA 변형을 줄여 효율적이고 흉터가 없는 CRISPR-Cas 돌연변이 유발을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 생명공학 및 파지 치료에 응용하기 위한 파지의 유전 공학을 용이하게 합니다.

NgTET 지원 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발

이 프로토콜은 K562 세포에서 표적 후성유전학적 편집을 위한 비통합적 에피솜 CRISPR/dCas9 기반 시스템을 설명하며, dCas9-DNMT3A 및 dCas9-HDAC1 이펙터를 특정 sgRNA와 결합하여 유전자좌 특이적 DNA 메틸화를 정밀하게 유도하고 표적 이탈 효과를 감소시킵니다.

K562 세포의 후성유전학적 공학: dCas9-DNMT3A 및 -HDAC1 융합 단백질을 사용한 안정적인 표적 DNA 메틸화를 위한 이중 벡터 에피솜 전략

학습하세요 분할-TET2 효소 CiDER를 이용한 화학적 유도 DNA 하이드록시메틸화 및 후성유전체 리모델링 방법을. 포유류 세포에서 시간적 제어가 가능한 이 기술은 후성유전학 연구에 필수적인 도구입니다.

화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

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