화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

이 일련의 실험의 전반적인 목표는 CiDER라고 하는 엔지니어링된 split-TET2 효소를 포유류 세포에 도입하여 하이드록시메틸화 및 후성유전학적 리모델링과 같은 유도성 DNA 변형을 수행하는 것입니다. 이 방법은 다음과 같은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 엔지니어링된 split-TET2 효소가 5-메틸시토신 산화의 시간적 제어와 화학 첨가제로 포유류 세포의 후성유전학적 상태의 후속 리모델링을 허용한다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 10%의 열 비활성화 FBS와 100단위의 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 부착 세포주를 배양합니다.

섭씨 37도에서 세포를 5%CO2로 배양합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CiDER 플라스미드로 세포를 transfection합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날, transfection 시약이 함유된 배지를 완전한 새 DMEM으로 교체합니다. 세포를 화학적으로 유도하려면 200 나노몰의 최종 농도에 도달하기 위해 2밀리리터의 배지로 유지되는 형질주입된 세포에 20마이크로리터의 희석된 라파마이신을 첨가합니다. 유세포분석을 수행하려면 transfection된 세포와 Rapamycin에 유도된 세포를 FACS buffer에 재현탁합니다.

대조군의 경우, 라파마이신 처리 없이 CiDER 발현 세포를 사용합니다. text protocol에 설명된 대로 셀을 수정하고 투과화합니다. 그런 다음 세포에 두 개의 일반 염산을 첨가하여 10분 동안 DNA를 변성시킵니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 중화하고 차단한 후 희석된 항-5hmC 항체를 세포에 첨가합니다. 세포를 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후 FACS 완충액으로 세포를 세 번 세척합니다.

FACS 버퍼를 완전히 제거합니다. FACS 분석을 위해 희석된 형광단 접합 2차 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 FACS 버퍼로 셀을 세 번 세척합니다.

세척 후 샘플은 FACS 분석을 위한 준비가 됩니다. 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 transfection된 세포와 Rapamycin에 의해 유도된 세포에서 게놈 DNA를 분리합니다. 대조군의 경우, 라파마이신(Rapamycin)을 처리하지 않은 CiDER 형질주입 세포를 사용합니다.

진공 오븐을 섭씨 80도로 가열합니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 이중 증류수에 미리 담근 다음 6X SSC 버퍼에 10분 동안 담가둡니다. 다음으로, 60마이크로리터의 동일한 양의 DNA를 96웰 PCR 플레이트에 로드합니다.

나머지 웰에 30마이크로리터의 TE 버퍼를 추가합니다. 1열에 있는 30마이크로리터의 용액을 2행의 동일한 컬럼 위치로 이동시켜 96웰 플레이트에서 수직으로 2배 연속 희석을 수행합니다. 다시 혼합하고 경계에 도달할 때까지 30마이크로리터의 용액을 다음 행의 우물로 옮깁니다.

그런 다음 우물에서 마지막 30마이크로리터를 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 20마이크로리터의 1몰 수산화나트륨과 10밀리몰 EDTA를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 혼합물을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열하여 DNA 이중체를 완전히 변성시킵니다.

즉시 얼음에서 샘플을 식히십시오. 각 웰에 50마이크로리터의 얼음처럼 차가운 2몰 암모늄 아세테이트를 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 한편, 미리 담근 멤브레인과 함께 dot-blot 장치를 조립합니다.

완전 진공을 사용하여 잔류 버퍼를 제거합니다. dot-blot 장치의 각 well에 200마이크로리터의 TE 버퍼를 추가하여 멤브레인을 세척합니다. 진공 청소기를 켜서 TE 버퍼를 제거합니다.

다음으로, 변성된 DNA를 dot-blot 장치의 각 well에 로드합니다. 용액을 제거하려면 진공 청소기를 켜십시오. 200마이크로리터의 2X SSC를 첨가하여 멤브레인을 세척하고 진공을 사용하여 잔류 용액을 완전히 제거합니다.

도트 블롯 장치를 분해합니다. 그런 다음 멤브레인을 꺼내고 20mL의 2X SSC로 멤브레인 전체를 헹굽니다. 멤브레인을 20분 동안 자연 건조시킵니다.

멤브레인을 더 건조시키려면 진공 상태에서 80도에서 2시간 동안 굽습니다. 멤브레인에 차단 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 차단 용액을 버린 후 희석된 5-hmC 또는 5-mC 항체를 멤브레인에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

TBST로 멤브레인을 10분 동안 3회 세척하여 잔류 항체를 제거합니다. TBST를 철저히 제거한 후 멤브레인에 HRP 접합 2차 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다.

TBST로 멤브레인을 10분 동안 3회 세척합니다. 마지막으로, 화학발광 검출기를 사용하여 5-hmC 신호를 시각화하기 위해 멤브레인에 ECL 웨스턴 블로팅 기질을 추가합니다. 유세포 분석에 의한 CiDER 매개 5-hmC 생산의 대표적인 정량 결과가 여기에 나와 있습니다.

라파마이신 처리된 조건에서 CiDER를 발현하는 세포만이 5-hmC 수준의 현저한 증가를 보여줍니다. dot-blot assay에 의한 전체 세포 집단에서 5-hmC 수준의 전반적인 변화의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 로딩 제어는 입력 DNA의 총량에 대한 에틸렌 블루 염색으로 시각화됩니다.

결과는 Rapamycin 처리가 무시할 수 있는 배경 활성을 가진 CiDER 발현 HEK293T 세포에서 5-hmC의 강력한 생산을 유도한다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 후성유전학 분야의 연구자들이 유전 코드를 변경하지 않고 세포 기능을 탐구하고 다양한 생물학적 시스템에서 후성유전형과 표현형 관계를 조사할 수 있는 길을 열었습니다.