Name: 인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 학습하세요 인간 췌장 조직의 고해상도 3D 이미징을 위한 수동적 광학 클리어링 방법을 통해 췌도 신경망을 시각화하는 기술을. 이 프로토콜은 당뇨병 신경생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자는 박사 앤 푸와 기술 지원에 대 한 조셉 Canzano, 박사 제니퍼 Treweek 귀중 한 조언, 그리고 닥터 크리스틴 Overton 및 MCT 스탠포드 대학 선명도 워크샵을 통해 교육에 대 한 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. JDRF nPOD 및 장기 조달 조직 조직 샘플을 제공합니다. 이 작품은 JDRF (47-2014-1), 헴 슬 리 자선 신탁 (HCT 2015-PG-T1D052) 및 MCT에 NIDDK 1OT2 TR001773에 의해 투자 되었다.

모든 실험은 플로리다의 대학 기관 검토 위원회 및 연방 정부의 지침에 따라 실시 했다.
주의: Paraformaldehyde 및 아크릴은 독성 irritants입니다. 적절 한 개인 보호 장비 (실험실 외 투, 장갑, 눈 보호)와 증기 두건에서 시 약을 처리 합니다.
1. 포름알데히드 고정 조직 deparaffinization (신선한 조직 작업 하는 경우 2 단계로 건너)
<ol><li>새로운 면도날 또는 메스를 사용 하 여 조직의 표면에 수직인는 파라핀을 극복. 조직 풀어 마무리의 가장자리에는 파라핀을 잘라. 부드럽게 느슨하게 하 고 허가를 받아야하는 광학 조직을 제거 겸 자 또는 주걱을 사용 합니다. 부드럽게 주걱 (그림 1A)를 사용 하 여 조직에서 초과 파라핀 다쳤어요.</li>
	<li>크 실 렌 (3 x 3 x 3 m m 부분의 조직에 대 한 약 30 mL)와 함께 유리 용기를 실 온 (RT)에서 24 시간이 솔루션 조직을 품 어.</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 신선한 자일 렌으로 다른 유리 용기를 채우십시오. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 100% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 튜브에 95% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 70% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>린스 0.01 M 인산에서 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 및 조직 파라핀 (그림 1B, 오른쪽 패널)의 무료는 실시간 확인에서 24 h에 대 한 equilibrate를 원뿔 튜브에 0.01 M PBS에서.</li>
</ol>2. 준비 4 %Paraformaldehyde (PFA) 정착 제
<ol><li>플라스틱 10 mL 16% PFA 50 mL 원뿔 튜브로 4 mL 0.1 M PBS, 추가 하 고 추가 26 mL 증류수 이온 (ddH2O). 뚜껑 닫고 잠시 혼합.</li>
	<li>4%의 더 큰 볼륨 미리와 aliquots에서 냉동 PFA는 만들 수 있습니다. 4 ° C에서 1 주 및 1 개월-20 ° c.에 aliquots는 실 온 (RT)에서 1 일에 대 한 좋은</li>
</ol>3. 췌 장 고정
<ol><li>갓된 4%에서 췌 샘플 (1 x 1 x 2 cm ≤) 수정 PFA 48 h 4 ° C에서. 샘플 1 x 1 x 2 cm를 사용 하 여 메스 또는 면도칼으로 작은 해 부 보다 큰 경우 개 더 이상으로 보다 1 ㎝ 두께. 각 씻어 적어도 15 분 동안 0.01 M PBS의 세 가지 변화에서 조직 샘플을 세척 하 고 사용까지 0.01 %PFA / 0.01 M PBS 또는 0.5% 나트륨 아 지 드/0.01 M PBS에에서 15 mL 원심 분리기 튜브에 저장.</li>
	<li>고정, 후 추가 처리를 위해 1-2 m m 두꺼운 섹션으로 조직 섹션. 하도 단면에 vibratome를 사용 합니다. 참고: 섹션의 마지막 수 시작 샘플의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>4. 하이드로 겔에 조직 포함
<ol><li>다음과 같이 4% 아크릴/1 %paraformaldehyde (A4P1) 하이드로 겔 단위체 솔루션 200ml를 준비:<ol>
<li>마그네틱 볶음 판 위에 양동이에 얼음에 플라스 크를 놓습니다. 플라스 크는 평평 앉아 있는지 확인 하 고 자기 볶음 바 추가 합니다.</li>
		<li>다음 순서로 추가: 147.8 mL 감기 (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0.1 M PBS, 20 mL 감기 (4-8 ° C) 40% 아크릴 솔루션, 12.2 mL 16 %PFA 솔루션, 및 250 mg 버지니아-044 초기자. 적어도 10 분 동안 자기 볶음 바 전체 히드로 솔루션을 혼합 하 고 단계에 대 한 얼음에 솔루션을 떠나.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하이드로 겔 솔루션을 포함 하는 플라스 크가 옆에 얼음에는 장소 15 mL 원뿔 튜브. 단량체 솔루션의 14 mL 튜브에 플라스틱 고 1-2 m m 두께 고정된 조직 샘플의 한 조각을 추가 합니다. 다음 모자는 튜브.</li>
	<li>4 ° C에서 3 일 동안 단위체 솔루션에서 샘플을 품 어 고 빛 으로부터 보호 합니다. Aliquot 어떤 나머지 모노 머 솔루션 및 나중에 사용-20 ° C에서 저장.</li>
</ol>5. 드 모노 머 솔루션 및 유해는 하이드로 겔
<ol><li>가스 N28을 사용 하 여 하이드로 겔 단위체 솔루션에서 산소를 제거 합니다.<ol>
<li>얼음 양동이 준비 하 고 얼음에 하이드로 겔 단위체 솔루션에는 샘플을 배치.</li>
		<li>샘플, 파라핀, 필름과 타이머 당 2-3, 18-게이지 피하 주사 바늘을 수집 합니다. 질소 흐름 수 있도록 질소 탱크에 있는 튜브를 연결 합니다. 얼음에 샘플을 유지 하면서 신중 하 게 한쪽에 샘플을 포함 하는 원뿔 튜브의 뚜껑을 뚫 고 때까지 통해 피하 바늘은 액체 단량체 솔루션의 표면 아래를 누릅니다.</li>
		<li>펑크는 캡의 반대 측에 다른 피하 주사를 사용 하지만 침수 될 그것을 허용 하지 마십시오. 참고: 두 번째 바늘 튜브를 환기 합니다.</li>
		<li>피하 주사는 히드로 아래 물속에 질소 탱크에서 튜브를 연결 하 고 천천히 때까지 액체를 통해 꾸준히 버블링은 질소를 켭니다.</li>
		<li>10 분 동안 액체를 통해 거품을 질소를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>산소 제거 되 면 신속 하 게 두 바늘을 제거 하 고 커버 튜브와 환경 사이 가스의 어떤 더 교류를 방지 하기 위해 파라핀 영화와 모자. 3 h는 히드로 유해를 37 ° C에서 인큐베이터에 degassed 샘플을 놓습니다.</li>
</ol>6. 조직 개간
<ol><li>500 mL 지우기 솔루션 (pH 8.5에서 4 %SDS)를 준비 합니다. DdH2O ~ 300 mL, 50 mL 0.1 M PBS와 20 g SDS 분말 자석 저 어 바 교 반 하면서 추가 합니다. 수산화 나트륨과 염 산이 pH 8.5 사용 하 여 솔루션을 조정 합니다. 마지막 볼륨은 500 mL까지 ddH2O를 추가 합니다.</li>
	<li>중 합, 후 멀리 초과 하이드로 겔을 부 어 하 고 화학 폐기물 용기에 그것을 삭제 합니다. 부드럽게 샘플에서 멀리 하이드로 겔을 닦아 하 고 화학 폐기물 용기에 폐기 종이 타월을 사용 합니다.</li>
	<li>각 세척 단계 샘플 0.01 M PBS의 3-5 교류에 (삭제 세척 액체 화학 폐기물에) 15 분 동안 씻어. 버퍼를 비운의 40 mL 50 mL 원뿔 튜브에 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 개간 버퍼에 샘플을 품 어 하 고 매일 신선한 개간 버퍼에 샘플을 변경 합니다.<ol>
<li>적절 한 청소를 보장 하기 위해 개간 버퍼 (~ 8 주가 3 mm x 3 mm x 3 mm 샘플) 샘플 크기에 따라 2-8 주에 대 한 샘플을 둡니다.</li>
		<li>모니터링 조직 개간 하 고 완료 되 면 중지 합니다. 샘플 확인 하기 위해 적절 한 개간 빛까지 개최 하 여 적절 하 게 투명 인지 확인 (일반적으로 일부 황갈색 색소에에서 남아 exocrine 지역). 참고:-선택된 샘플 가장자리에 닳은 나타나고 텍스처 집게로 집어 매우 부드러운 될 것입니다. 균등 하 게 취소를 샘플에 대 한 일반적입니다. 또한, 조직 설치 미디어 (삽입, 그림 1C)에 배치 될 때까지 완전히 투명 하 게 되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 여러 면역 형광 검사
<ol><li>씻어 60 rpm에서 통에 샘플 RT에서 하루 동안 40 mL 0.01 M PBS (4-5 버퍼 변경 총, 40 mL에 각 세척, 최종 세척까지 모든 h 변경) 종종 신선한 버퍼에 변경. 실시간에서 밤새 계속 최종 세척 하자</li>
	<li>협정 얼룩 버퍼를 준비 합니다. 500 mL 0.01 M PBS, 50 mg 나트륨 아 지 드와 0.5 mL TritonX-100 추가. 잘 믹스.</li>
	<li>1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어.<ol>
<li>2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).</li>
		<li>2% 세럼/협정 버퍼 얼룩에 1 차적인 항 체를 추가 합니다. 협정 얼룩에 대 한 1 차적인 항 체의 양 x 약 5를 사용 하 여 표준 immunohistochemistry (즉 경우 항 체를 위한 표준 immunohistochemistry, 협정 얼룩에 대 한 사용 1: 100 희석된 1: 500) 사용 될 것 이다.</li>
		<li>워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 주 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-4 일 60 rpm에서 통에 RT에서 품 어. 4-5 시간 신선한 버퍼를 변경 하 고 마지막 세척 단계 7.1에서 하룻밤 사이에 떠나는 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 샘플을 철저히 씻으십시오.</li>
	<li>이차 항 체와 함께 샘플을 품 어.<ol>
<li>2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).</li>
		<li>1: 200 (1 mL 버퍼에서 5 µ l)의 농도에 2 차 항 체를 추가 합니다. 참고: 작은 형식 항 체는, 뿐만 아니라 매우 크로스 흡착 항 체 경우 하나 이상의 기본 항 체를 사용 하 여.</li>
		<li>워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 이차 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 일 동안 60 rpm에서 통에 RT에서 incubate 고 빛에서 샘플을 보호 합니다.</li>
	<li>샘플을 철저 하 게 세척, 단계 7.1 시간 4-5 신선한 버퍼를 변경 하 고 떠나는 마지막 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 하룻밤 사이에 세척, 세척 하는 동안 빛에서 보호.</li>
</ol>8. 영상에 대 한 샘플 장착
<ol><li>굴절률 정합된 솔루션 (RIMS) 버퍼를 준비 합니다.<ol>
<li>신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브에 전송 및 비 이온 밀도 그라데이션 매체 (예: Histodenz)의 11 g으로 무게.</li>
		<li>~ 5 mL 0.02 M 인산 버퍼 (PB)8 분말 비 이온 밀도 그라데이션 매체에서 공기를 해제 하는 주걱을 사용 하 여 추가 합니다. 참고: 솔루션은 아주 점성, 잘 혼합.</li>
		<li>10 ml 더 많은 PB를 사용 하 여 볼륨을가지고, 주걱으로 혼합 하 고 튜브에는 주걱을 초과 다쳤어요.</li>
		<li>해산 때까지 37 ° C에서 바퀴를 품 어, 반전 하 고 필요에 따라 부드럽게 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테두리에 샘플을 전송 합니다. 이렇게, 1 mL를 플라스틱 2 mL 평면 하단 튜브로 바퀴. 워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 테두리 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.<ol>
<li>부드럽게 잠수함 테두리에 샘플 튜브를 누릅니다. RT에 빛에서 이미징 하기 전에 2-4 일에 대 한 보호는 벤치에 테두리에 샘플을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지, 적은 양의 8 잘 coverslip 아래쪽 챔버 슬라이드에 테두리를 배치 합니다. 코트 바닥을 충분히 추가, 더 많은 샘플 거꾸로 범위에 이미지를 더 어렵게 하는 float 하면. 우물에 샘플을 추가 하 고 슬라이드 이미징에 대 한 모자.</li>
</ol>9입니다. 영상
<ol><li>Confocal 현미경 검사 법 및 이미징 소프트웨어<ol>
<li>여기 및 협정 샘플 얼룩 사용 fluorophores의 방출 스펙트럼에 대 한 적절 한 레이저를 선택 합니다. 채널 간의 모든 중복 제거 수집 소프트웨어의 설정을 조정 합니다. (두 fluorophores 비슷한 흥분 스펙트럼 때) 필요한 경우 별도 트랙 사용 합니다.</li>
		<li>이미지 수집 설정<ol>
<li>최대 수집 속도, 16 비트, 4 이상의 평균, 및 1024 x 1024 해상도 선택 하거나 더 나은 합니다.</li>
			<li>개체 수 이미지를 확대 합니다. 참고:이 하 사진 표백 줄일 또한 파일 크기와 다운스트림 편집 수집 시간을 줄일 것 이다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Z-스택 설치.<ol>
<li>사용 되 고 목표에 대 한 최적의 단면을 선택 합니다. Deconvolution 나중에 필요한 경우 사용 하 여 z-단계 1 µ m 등 최적의 보다 작은.</li>
			<li>Z-스택 보정을 사용 합니다.<ol>
<li>직물의 표면에 가장 가까운 시작 및 목표 z-비행기를 통해 초점을 맞추고 이득을 증가 하 고 수정 추가. 정정에 대 한 레이저 설정을 변경 하지 마십시오!</li>
				<li>취득 한 평균, 512 x 512 해상도와 최대 수집 속도 테스트 스택. 최종 높은 해상도 z-스택을 취득 하기 전에 각 색상에 대 한 전역 동등한 밝기는 되도록 3d에서 이미지를 확인 하십시오.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lightsheet 영상<ol>
<li>샘플 이상적으로 적어도 24 h. 이미지에 대 한 테두리에 equilibrated 되었습니다 이미징 챔버에 신선한 테두리에 샘플을 전송 고 적어도 하루에 대 한 챔버에 equilibrate 수 있게 확인 하십시오.</li>
		<li>이미징에 대 한 샘플을 탑재<ol>
<li>샘플을 탑재를 작은 (블랙) 모 세관을 선택</li>
			<li>퍼 티 또는 접시를 사용 하 여 모 세관의 끝에 슈퍼 접착제를 적용 하는 동안 샘플을. 감동 만큼 가능한 조직의 표면 모 세관에 조직 접착제.</li>
			<li>이미징에 대 한 예제를 삽입 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 광학 허가 샘플 피벗을 사용 하 여 스캔 옵션에 대 한 5 X 또는 적합 한 25 X 목표를 사용 하 여. 숨김 또는 흐리게 경우 샘플을 회전 다시 시도, 또는 바퀴에 equilibrate 계속 샘플을 보자. 참고: 1 스택 5 분, 설정에 따라 일반적으로 취득 수 있습니다.</li>
		<li>보기 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 스택 편집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Orlich, M., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+qualitative+comparison+of+ten+tissue+clearing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques.</a> Histol Histopathol. , 11903(2017).</li>
<li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).</li>
<li>Hsueh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+clinical+CLARITY%3A+volumetric+analysis+of+irregular%2C+soft%2C+and+heterogeneous+tissues+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease.</a> Sci Rep. 7 (1), 5899(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+donor+specimens%3A+What+can+they+tell+us+about+type+1+diabetes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes?</a> Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).</li>
<li>Kim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+large-scale+visualization+and+quantification+of+pancreatic+islet+mass%2C+size+distribution+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

새로운 광학 개간 방법의 동물 모델에는 중앙의 전례 없는 대규모 시험 및 주변 신경 시스템을 허용 하고있다. 인간의 췌 장의 전반적인 신경 분포 패턴 조직 밀도 높은 품질 biospecimens 인수에 어려움으로 인해 크게 탐험 되지 않습니다. 이 프로토콜은 고정 또는 파라핀 끼워 넣어진 보관 샘플에서 인간의 췌 장 조직에 대 한 프로토콜을 삭제 하는 최적화 된 조직에 제공 합니다.
시간을 지우기 샘플 크기, 통 유형, 기간, 저장 기간에 따라 달라 집니다 고 다음 고려 사항은 중요 한 그래서 1-8 주를 요구할 수 있습니다. 가능 하면 장기 보관 개간 시간 증가 하기 때문에 4 %PFA 고정 후 곧 조직을 지우려면 최상 이다. 청소 시간을 최소화 하기 위해 하이드로 겔 단위체에 PFA의 금액 1%로 고정 단계에서 사용 되는 인간의 췌 장 4%에서 감소 했다. 다른 조직, 특히 마우스 조직에 대 한 PFA 항을 유지 하기 위해 충분 한 하이드로 겔 강성을 제공 하기 위해 필요한 금액은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 적절 한 개간 때문에 항 체 침투 제대로 삭제 된 조직에 감소 되 고 2 차 항 체에 의해 얼룩 표면 증가 또한 필수적 이다. 청소 솔루션을 변경 모든 다른 일 (또는, 심지어 매일)이 pH 상수와 세제를 신선한 유지 좋습니다. 반대로, 부정적인-지우기 세포 형태에 미치는 영향 및 조직 friability 증가. 이후 일부 췌 장 샘플 취소 하지 섬유 증 만성 췌 장 염에서의 지역 등 고유한 병 리 또는 다른 병 리 균등 하 게, 그것은 자주이 프로세스를 모니터링 하는 것이 중요. Vibratome 두꺼운 섹션의 사용 하 여 균일 한 두께 만들기 위해 사용할 수 있습니다 아직 필요 하지 않습니다. 최대한 빨리 빛 샘플, 쉽게 통과 샘플 세제에서 제거 됩니다 개간 과정 모니터링 샘플 충분히 지워집니다 보장 합니다.
항 체 침투 및 표면 얼룩 협정 예제와 함께 고려해 야 할 중요 한 문제가 있습니다. 좋은 항 체 침투를 위해, 그것은 적어도 2 일 동안 1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어 중요입니다. 다양 한 항 체 다른 보급률 있고 개별적으로 최적화 해야 하지만 대부분 항 체, 4 일 1 m m3 샘플에서 전체 침투에 대 한 충분 한 기간. 표면 얼룩이 지는 문제는, 특히 Lightsheet 이미징에 대 한 샘플, 절반 절단 될 수 있습니다 또는 표면 얼룩 후 멀리 해 부. 작은 형식 항 체 사용 가능한 경우 조직 침투8을 지원 하기 위해 예상 될 것 이다. Preconjugated 항 체 같은 결합형된 복제 뿐만 아니라 작동 표시 되지 않습니다 및 일반적인 바인딩 및 빈약한 조직 침투에서 높은 배경 수 만약 그들이 모든 일을 관찰. Preconjugated 항 체와 함께 향상 된 성공, 증가 혈 청 및 TritonX-100 농도 얼룩이 지기에서 버퍼 긴 외피를 사용 (> 4 일). 얼룩, 후 몇 일 동안 바퀴에 샘플의 인큐베이션이 중요 합니다. PBS 및 테두리 외피에 허가 조직 팽창 발생 다시 원래 크기로 축소 합니다. Lightsheet 영상와 특히 샘플 완전히 이미징 하기 전에 equilibrated 되어야 한다.
Confocal 현미경에 샘플 이미지 때 수정에 새 위치를 선택 때마다가 설정 해야 합니다. 다양 한 수집 깊이 강도 조직 전체를 얼룩에 최적의 이미지를 조직의 각 영역에 대 한 조정이 필요로 합니다. 마찬가지로, 사용 하는 2 차 항 체는 신중 하 게 고려 되어야 한다. 스펙트럼 unmixing fluorophores 밝은 신호를 필터링 하는 confocal 현미경에 방출 되도록 낮은 여기 또는 오버랩 적절 하 게 선택 되어야 한다 그래서 협정 샘플, 도전 이다. 사진-표백 하지 않고 최고의 품질 이미지를 얻을 수 있다 그래야 각 응용 프로그램에 대 한 균형 해상도, 이미징 속도 및 소음 감소 사이 삼진 해야 합니다. 해상도 1024 x 1024 보다 큰 인간의 눈으로 감지 하지만 얼룩의 정량화는 필요한 경우 특정 응용 프로그램에 필요한 있을 수 있습니다.
광학 개간 기술을 선택할 때 그리고 다른 전통적인 방법을 통해 광학 개간을 선택할 때 고려해 야 할 많은 것 들이 있다. 낮은 풍부 항 따라서 있다 항 원 탐지에 대 한 제한 협정 방법을 사용 하 여 감지 하지 않을 수 있습니다. 특정 항 원 면역 항 원 (CD3, CD4, CD8, 등) 같은 협정 방법으로 파괴 하 고 그들을 감지 사용할 수 있는 고품질 항 체에도 불구 하 고 감지 되지 않습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 기증자 췌 얼룩을 지운 후 때까지 분별 하기 어려운 사이 고유의 가변성. 각 기증자 조직 명확 하 고 절차, 사이 유사 하 게 얼룩 경향이 있다 하지만 다른 기증자 조직 널리 다양 한 청소 시간 및 조직의 형태학 품질 개간 후. 비록이 철저 하 게 조사 하지는 하나 환자 췌 샘플의 많은 수에 대 한 적절 한 액세스를 가질 수 있다면 보관 조직을 사용 하는 능력이이 제한을 완화 수 있습니다. 여기 보고 협정 프로토콜 저렴 하 고 쉽게 표준 실험실 장비로 구현 될 발견 됐다. 선택된 샘플 전통적인 confocal 현미경 검사 법, 2 광자 및 Lightsheet 기술을 통해 영상에 적합 되었고 고해상도 신경 및 인간의 췌의 큰 섹션에 독도의 3D 이미지를 제공. 이 절차의 미래 응용 프로그램 태아 췌 장 외 분 비 및 내 분 비 구획 및 타입-1에에서 섬 연구 및 2 형 당뇨병의 개발에 대 한 연구를 포함합니다.

최근까지, 큰 조직 또는 전체 장기의 3 차원 (3D) 재건 힘 드는 직렬 단면, 얼룩, 및 여러 섹션의 이미지 재건을 통해 수행 되었다. 이러한 방법은 직렬 섹션, 항 체, 및 비 산 방지 조직 내의 깊은 이미징 빛 가난한 조직 침투의 많은 수에 대 한 신뢰를 포함 하 여 몇 불리가 있었다. 있도록 큰 빛과 항 체 침투, 연구원 지질 빛 산란의 대부분을 제거 하는 동안 단백질 항 원을 보존 하기 위해 화학 방법을 개발. 여러 메서드는 엄밀한 이미징 조직 Clear Lipid-Exchanged 아크릴 때 교배 히드로 (선명도), 수동 선명도 기법 (협정), 및 관류 기반 에이전트 출시 원래의 (동위) ( 1,2 검토 관련 ,,34,,56). 선명도 메서드는 포름알데히드, 아크릴, 및 두번째 히드로 지질 제거 SDS 솔루션2전기 이동 법을 사용 하 여 다음을 사용 하 여 단백질의 안정화를 기반으로 합니다. 이 방법은 수동 삭제에 대 한 수정 나중 되었고 고급 이미징7. 추가 최적화 주도하 고 두번째의 paraformaldehyde 히드로 솔루션 (1-4%)의 다양 한 비율로 최적의 항 안정화를 협정 8이라는 기법에 대 한 짧은 청소 시간. 이러한 광학 개간 기술을 개발 초기 시도 관련 작업을 담금질된 생 형광 단백질 유전자 변형 마우스 모델에서 어려운 유기 또는 다른 화합물. 이러한 추가 메서드 포함 비늘, 가리지 두뇌/신체 칵테일과 Computational 분석 (큐빅), 스위치 및 Dimensional Imaging of Solvent-Cleared 기관 (디스코) 방법, 모두와 함께 다양 한 장점과 단점9, 10,,1112. 원래 선명도 방법은 지질이 풍부한 마우스 뇌 조직에서 개발 되었다 및 광학 개간 방법 인간의 조직7,,811,13,14에서에서 테스트 제한 했다 .
광학 개간 방법 그대로 마우스 중앙 신경 시스템에서 긴 거리 추적 신경에 이상적입니다. 췌 잘 자율 신경 및 감각 신경 시스템에 의해 innervated입니다. 전체 기관 (1-2%)의 아주 작은 부분을 구성 하는 췌 장 내 분 비 실, 독도 Langerhans 및 독도 크기 (50-250 µ m), 내 분 비 세포 비율, 및 ( 15에서에서 검토 한 결과 당뇨병에 특히 밀도에 알고 있다 ,16). 프로토콜 개발, 인간의 췌 장에 대 한 여러 가지 광학 개간 방법을 테스트 하 고 협정 절차 신경 및 독도의 우수한 형태 보존 시간 (~ 2 주)를 최고의 균형을 발견. 여기에 설명 된 마지막 최적화 절차는 대 한 신경 섬 네트워크의 묘사에 대규모 (밀리미터 거리) 및 여러 그대로 췌 장 독도의 고해상도 3D 이미징. 후 샘플으로 저장 중립 버퍼링 된 포 르 말린 고정 파라핀 왁 스에 포함 된 기술은 인간의 췌 장 바로 다음 고정 또는 적당 하다. 샘플은 여 confocal 영상에 대 한 적합 한 또는 lightsheet 현미경 검사 법.

<table><tbody><tr><td>10x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 무수</td><td>Fisher</td><td>S375-500</td><td>PB 완충액(RIMS)</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물</td><td>Sigma</td><td>71507-250</td><td>PB 완충액(RIMS)</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714-5</td><td>침지 고정, 하이드로겔, 저장 용액</td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>하이드로겔</td></tr><tr><td>2% 비스-아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>하이드로겔</td></tr><tr><td>VA-044 개시제</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>하이드로겔</td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이트 (SDS)</td> <td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>클리어링 버퍼</td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td> 시<td>그마</td><td>S8032</td><td>샘플 저장 버퍼</td></tr><tr><td>18 게이지 바늘</td><td>Fisher</td><td>14-840-91</td><td>탈기 하이드로겔 용액</td></tr><tr><td>N2 탱크</td><td>AirGas</td><td>다양한</td><td>탈기 하이드로겔 용액</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100 ml</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>염소, 일반 혈청</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td>차단 버퍼에서 2%로 사용</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma</td><td>D2158-100G</td><td>RIMS</td></tr><tr><td>8-웰 챔버 슬라이드</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>이미징</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>710</td><td>이미징</td></tr><tr><td>LightSheet 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Z1</td><td>이미징</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primary Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>Bioss</td><td>bs-4820R-A488</td><td>Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work</td></tr><tr><td>CD45</td><td>DAKO</td><td>M0754</td><td>호스트 : 마우스 < / > 희석 : 1 : 200 코멘트 :</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td> 호스트가 작동하지 않았습니다 <td>: Rabbit 희석 : 1 : 50 코멘트 :</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>BD Biosciences</td><td>565891</td><td>작업 호스트 : Mouse 희석 : 1 : 50 코멘트 : 글루</td></tr><tr><td>카곤</td><td>세포 신호</td><td>2760S</td> <td>작업호스트 : Rabbit 희석 : 1 : 200 코멘트 : 작동하지 않았다</td></tr><tr><td>글루카곤</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>호스트 : Mouse 희석 : 1 : 200 코멘트 : 인</td></tr><tr><td>슐린</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td>작업 호스트 : 기니피그 희석 : 1 : 200 코멘트 :</td></tr><tr><td>작업 NCAM (CD56)</td> <td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>호스트 : mouse 희석 : 1 : 50 코멘트 : 작동하지 않음</td></tr><tr><td>NCAM (CD56) - FITC 켤레</td><td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>호스트 : 마우스 < / > 희석 : 1 : 50 < / > 코멘트 : 작동하지 않음</td></tr><tr><td>Peripherin</td><td>EnCor</td><td>RPCA - 페리</td><td>호스트 : Rabbit 희석 : 1 : 100 코멘트 :</td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>DAKO</td><td>Z5116</td><td>호스트 : Rabbit 희석 : 1 : 50 코멘트 :</td></tr><tr><td>작동하지 않았다 Secretogranin 3</td><td>시그마</td><td>HPA006880</td><td>호스트: Rabbit 희석: 1:200 코멘트: 평</td></tr><tr><td>활근 액틴</td><td>시그마</td><td>A5228; C6198 (Cy5)</td> <td>호스트 : 마우스 < / > 희석 : 1:200; 1 : 200 < / > 코멘트 : 작동; 접합체가 비접합</td></tr><tr><td>물질 P</td><td>BioRad</td><td>8450-0505</td> 숙주보다 더 잘 작동했습니다 <td>숙주: Rat 희석: 1:200 코멘트: Worked</td></tr><tr><td>Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>숙주: Rabbit 희석: 1:200 코멘트: Worked</td></tr><tr><td>Tyrosine Hydroxylase</td><td>Abcam</td><td>Ab76442</td><td>Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: worked but 약한 염색</td></tr><tr><td>혈관 활성 장 펩타이드 (VIP)</td> <td>Immunostar</td><td>20077</td><td>숙주 : Rabbit 희석 : 1 : 100 코멘트 : Worked</td></tr><tr><td>Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT)</td> <td>Synaptic Systems</td><td>139103</td><td>Host : Rabbit Dilution : 1 : 50 코멘트 : Worked</td></tr><tr><td>Secondary Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guinea 돼지 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>다양한</td><td>숙주: Goat 희석: 1:200 코멘트: AlexaFluor 접합</td></tr>체 <tr><td>마우스 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>다양한</td><td>숙주: Goat 희석: 1:200 코멘트: AlexaFluor conjugates</td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>다양한</td><td>숙주: Goat 희석: 1:200 코멘트: AlexaFluor 접합체</td></tr><tr><td>쥐 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>다양한</td><td>숙주: 염소, 당나귀 희석: 1:200 코멘트: AlexaFluor 접합</td></tr>체 <tr><td>닭 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>다양한</td><td>숙주: Goat 희석: 1:200 코멘트: AlexaFluor 접합체</td></tr></tbody></table>

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3d 이미징

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

전통적인 조직학 방법을 사용 하 여, 연구원은 그들의 능력을 이미지 전체에 방해는 조직이 나 장기 대규모 3d에서. 조직학 단면도 일반적으로 < 20 µ m로 포 르 말린 고정 파라핀 섹션 유리 슬라이드에 또는 < 부동성 고정된 섹션에 대 한 500 µ m. 따라서, 광범위 한 노력은 직렬 단면화 및 샘플에 대 한 3D를 다시 대규모 이미지 재건 방법 > 전통적인 방법을 사용 하 여 500 µ m. 또한, 내 조직, 특히 지질, 고분자에서 빛 없앤다 방지 깊이 영상 > 가장 confocal 현미경으로 150 µ m. 빛 분산을 줄이고 간단한 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 깊은 조직 이미징 수 있도록, 다양 한 광학 개간 방법 그는 설치류와 인간의 조직 샘플에 대 한 관련 고정 침수에 의해 개발 되어 왔다. 여러 가지 방법을 관련 고 아크릴 아 미드와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 지우기 조직 단백질 가교를 사용 합니다. 다른 광학 개간 기술 사용 다양 한 용 매 다양 한 장점과 단점 각 수정 했다. 여기, 인간의 췌 장 신경 분포의 연구와 인간의 독도의 신경 분포의 심문을 위해 특별히 최적화 된 수동 광 개간 방법 설명 되어 있습니다.

이러한 착 절차는 독도 관련 된 자율 고 감각 네트워크를 검사 하는 인간의 췌의 대규모 시험을 제공 하기 위해 개발 되었다. 선명도7,17, iDISCO 포함 하 여 여러 절차를 테스트 하 고 최고의 발견 협정 방법으로 협정8 인간의 췌 장 및 confocal 영상에 적합.
1 차 항 체 처음 테스트에 적합 한 긍정적이 고 부정적인 제어 샘플 인간의 췌 샘플 고정 (뇌, 마우스 다른). 각 실험실 많은 번호와 조직 소스에 따라 항 체 희석 최적화를 기대할 수 있지만 주 항 체 및 제안된 희석 재료의 테이블에 나열 됩니다. 1 차적인 항 체 로트 변형 영향을 얼룩 강렬과 특이성, 고 전 시 약으로 얼룩 강도의 동일한 정도 달성 하기 위해 확인을 요구 수 있습니다.
인간의 췌에서 독도 인슐린, 글 루카 곤, 및 secretogranin 3 (그림 2)에 의해 구분 된 했다. Schwann 세포 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP, 그림 2 및 그림 3A)를 사용 하 여 구분 된 했다. 신경 부 교감 신경 마커 vasoactive 창 자 펩 티 드 (VIP)에 대 한 항 체로 얼룩진 Lightsheet (그림 3B)에 몇 군데 있었다. 교감 신경은 티로신 hydroxylase (표시 되지 않음)에 대 한 얼룩으로 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig1.jpg"> 그림 1입니다. 인간의 췌 광학 개간. (A) 면도날 잘라내어 조직 단면도 제거 하 고 조직 (하단 패널)에서 멀리 초과 파라핀 된다고 하기 전에 파라핀 끼워 넣어진 조직 (상단 패널)의 섹션을 느슨하게 사용 됩니다. 대표 조직 샘플 (오른쪽 B, C 가운데) 광 개간 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 파라핀 끼워 넣어진 조직의 전후 (B 왼쪽된, C 위쪽) 에 표시 됩니다. 취소, 고정 조직 (B, C 최고) 와 종종 조직 후 완전히 투명 하지 않습니다 붓기 수 있습니다 (C, 중간 패널)평가. 허가 조직 바퀴 (C, 하단 패널)에서 평형 후 완전히 투명 하 게 된다. 바 규모: 500 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig2.jpg"> 그림 2입니다. 인간의 신경 섬 네트워크. NPOD 장기 기증자 또는 보관 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 설명 된 대로 인간의 췌 샘플 삭제 했다. (A-D) Schwann 세포 (GFAP + 흰색) 하 고 내 분 비 세포 (빨간색) 인슐린과 글 루카 곤 (녹색)으로 얼룩진 표시 됩니다. (A) Confocal 현미경 검사 법 및 최대 강도 투영 (MIP) 섬 주변에서 혈관 옆 전기가 하 고는 독도에 신경에 Schwann 세포 GFAP (+)의 추적을 보여줍니다. 삽입 된 높은 해상도 고 GFAP + Schwann 세포와 내 분 비 세포 사이 접촉을 보여줍니다 보여줍니다. (B) 패널의 3D 이미지 (규모: x = 50 µ m, y = 20 µ m, z = 25 µ m) a. 파라핀 협정 샘플 confocal 현미경 검사 법을 통해 이미지 표시 됩니다 고 최대 강도 프로젝션 (C) 과 3 차원 (D)에 제시, 확장: x, y = 50 µ m, z = 25 µ m). 스케일 바 , C: 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig3.jpg"> 그림 3. 3D 시각화 및 바느질. 3 바느질된 이미지 스택은 Schwann 세포 GFAP confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 스테인드 및 이미지 분석 소프트웨어에 neurite 추적기 플러그인을 사용 하 여 추적의 인수 했다. (A) 추적의 3D 채우기가 표시 됩니다 (막대를 확장: x = 150 µ m, y = 200 µ m (0.2 m m), z = 120 µ m) (B) A 협정 샘플과 VIP 항 체로 얼룩진 했다 lightsheet 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 스택이 &gt; 1 mm 깊이 신경 섬유에 높은 해상도에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 섬유 포장 (D, 전경) 덕트와 신경 절 (G, 배경)를 볼 수 있습니다 (큰 그리드: x, y, z = 200 µ m; 눈금 표시: x, y, z = 40 µ m). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 췌장 조직에 사용하기에 적합한 최적화된 수동 광학 투명화 방법을 입증하는 것입니다. 이 방법은 섬의 신경 분포에 대한 세부 정보를 제공함으로써 당뇨병과 관련된 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 투명화 방법이 고해상도 컨포칼 이미징에 사용하기 위해 인간 췌장 조직의 투명성을 보장한다는 것입니다.시작하려면 췌장 샘플을 갓 준비한 4%파라포름알데히드에 넣어 고정하고 샘플을 섭씨 4도에서 48시간 동안 배양합니다. 다음으로 플라스크를 얼음이 든 양동이에 넣어 식힙니다. 그런 다음 마그네틱 교반 플레이트 위에 양동이를 놓습니다.플라스크가 평평하게 놓여 있는지 확인하고 마그네틱 교반 막대를 추가합니다. 147.8ml의 얼음처럼 차가운 증류수, 탈이온수를 플라스크에 붓습니다. 그런 다음 0.1몰 PBS 20밀리리터, 얼음처럼 차가운 40% 아크릴아미드 용액 20밀리리터, 16% 파라포름알데히드 용액 12.2밀리리터, VA-044 개시제 250밀리그램을 추가합니다.전체 하이드로겔 용액을 최소 10분 동안 혼합합니다. 다음으로, 하이드로겔 용액이 들어 있는 플라스크 옆의 얼음 속에 15ml 원뿔형 튜브를 놓습니다. 14ml의 단량체 용액을 튜브에 피펫팅합니다.그리고 고정되고 절편화된 조직 샘플의 한 조각을 추가합니다. 그런 다음 튜브를 닫습니다. 단량체 용액에서 시료를 섭씨 4도에서 3일 동안 배양하면서 빛으로부터 보호합니다.배양 후 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로 마개를 통해 튜브를 질소 탱크에 연결합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하면서 18게이지 피하 주사 바늘을 조심스럽게 사용하여 샘플이 들어 있는 원뿔형 튜브의 캡을 한쪽에 뚫습니다.바늘이 액체 단량체 용액의 표면 아래에 있을 때까지 바늘을 튜브에 삽입합니다. 그런 다음 다른 18게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 캡의 반대쪽에 구멍을 뚫되 용액에 잠기지 않도록 하여 통풍구 역할을 할 수 있습니다. 질소 탱크의 튜브를 하이드로겔 아래에 잠긴 피하 주사 바늘에 연결하고 액체를 통해 꾸준히 거품이 일어날 때까지 질소를 천천히 켭니다.산소가 제거되면 두 바늘을 모두 신속하게 제거하고 파라핀 필름으로 캡을 덮어 튜브와 환경 사이의 추가 가스 교환을 방지합니다. 마지막으로, 샘플을 섭씨 37도의 인큐베이터에 3시간 동안 넣어 하이드로겔을 중합합니다. 중합 후 남은 하이드로겔을 붓습니다.그런 다음 각 세척 단계마다 15분 동안 0.01몰 PBS를 3-5회 교환하여 샘플을 세척합니다. 세척이 완료되면 샘플을 40ml가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브 또는 투명 버퍼로 옮깁니다. 섭씨 37도의 세정 완충액에서 시료를 배양하고 격일로 샘플을 새로운 세정 완충액으로 변경합니다.적절한 투명화를 확인하려면 샘플을 빛에 갖다 대고 샘플이 빛을 통과시킬 수 있지만 외분비 영역에서 약간의 황갈색을 유지하는지 확인하십시오. 과도하게 클리어링된 샘플은 가장자리가 닳아 보이며 집게로 집었을 때 텍스처가 매우 부드러워집니다. 샘플이 고르지 않게 투명해지는 것은 일반적입니다.투명화 버퍼를 40밀리리터 0.01몰 PBS로 교환하고 샘플을 60RPM의 셰이커에 실온에서 하루 동안 놓습니다. 4-5번의 완충액 교체를 수행하고 최종 세척을 밤새 계속합니다. 다음으로, 2ml의 평평한 바닥 튜브에 PACT 염색 완충액을 준비하고 1ml의 기본 PACT 완충액에 2%일반 혈청을 추가합니다.그런 다음 표준 1차 항체 양의 약 5배를 염색 완충액에 추가합니다. 주걱을 사용하여 세척 버퍼에서 샘플을 제거하고 여분의 버퍼를 종이 타월에 두드립니다. 샘플을 1차 항체 용액이 있는 튜브에 넣고 2-4일 동안 용액에서 실온의 셰이커에서 60RPM으로 배양합니다.배양 후 항체 용액을 제거하고 0.01 몰 PBS를 첨가합니다. 60RPM으로 셰이커에서 샘플을 철저히 세척하고 새 버퍼로 4-5회 교체하고 셰이커에서 최종 세척을 밤새 그대로 둡니다. 다음으로, 2%가 첨가된 혈청이 포함된 PACT 염색 완충액에 1 - 200의 2차 항체를 추가합니다.주걱을 사용하여 세척 버퍼에서 샘플을 제거하고 여분의 버퍼를 종이 타월에 두드려 제거합니다. 그런 다음 2차 항체 용액이 있는 튜브에 샘플을 넣습니다. 시료를 빛으로부터 보호하면서 60RPM의 쉐이커로 실온에서 2일 동안 시료를 배양합니다.배양 후 항체 용액을 제거하고 0.01 몰 PBS로 교체하십시오. 60RPM으로 셰이커에서 샘플을 철저히 세척하고 새 버퍼로 4-5회 교체한 다음 셰이커에서 최종 세척을 밤새 그대로 둡니다. 먼저 11g의 비이온 밀도 구배 매체의 무게를 측정하고 50ml 원추형 튜브로 조심스럽게 옮겨 굴절률과 일치하는 용액 버퍼를 준비합니다.그런 다음 주걱을 사용하여 5ml의 0.02몰 인산염 완충액을 추가하여 분말형 비이온 밀도 구배 매체에서 공기를 방출합니다. 필요한 경우 0.02 몰 인산염 완충액을 더 많이 사용하여 부피를 최대 10ml까지 가져오고 주걱과 혼합한 다음 주걱에서 초과분을 튜브로 긁어냅니다. 완충액이 완전히 용해될 때까지 섭씨 37도에서 배양하고 주기적으로 뒤집어 부드럽게 혼합합니다.시료를 굴절률 일치 용액 버퍼로 옮기고 이미징하기 전에 2-4일 동안 빛으로부터 보호된 벤치에서 배양합니다. 이미징 직전에 소량의 굴절률 매치 용액을 8웰 커버슬립 바닥 챔버 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 샘플을 우물에 추가하고 슬라이드를 덮습니다.인간의 췌장에서 섬은 베타 세포, 알파 세포 또는 모든 내분비 세포에 대해 각각 인슐린, 글루카곤 및 분비 그라나 3로 묘사 될 수 있습니다. 슈반(Schwann) 세포는 하얗게 나타나고, 내분비 세포는 인슐린(Insulin) 또는 글루카곤(Glucagon)에 의해 염색된 것으로 나타납니다. 섬 주변부의 혈관 옆을 흐르는 신경은 흰 선으로 두드러지며 섬 안으로 뻗어 있습니다.여기에서 슈반 세포와 내분비 세포 사이의 접촉을 명확하게 볼 수 있습니다. 여기서, 이 비디오에 표시된 방법을 사용하여 준비한 샘플을 혈관 활성 장 펩타이드에 대해 염색하고 광시트 현미경을 사용하여 이미지화했습니다. 신경 섬유는 고해상도로 명확하게 보이며 전경에는 관을 감싸고 있고 배경에는 신경절이 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 주요 관과 혈관이 없는 췌장 acinar 영역을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

high-resolution-3d-imaging-of-the-human-pancreas-neuro-insular-network

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

다음 프로토콜은 가상 슬라이스 이미지에 대한 췌장 해부 과정을 설명하고, 전체 췌장에있는 모든 GFP - 태그 베타 세포의 후속 부량.

마우스의 췌장 베타 세포 질량의 원위치 부량에서

immunohistochemically 스테인드 췌장 표본의 대규모 조달 및 분석의 새로운 컴퓨터를 이용한 방법에 설명되어 있습니다 : 전체 섹션 (1) 가상 슬라이스 캡처를, 대규모 데이터 (2) 질량 분석, 2D 가상 조각 (3) 재건 (4) 3D 아일릿 매핑, 그리고 (5) 수학 분석.

컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

우리는 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)의 적응을...

당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

큰 조직 내에서 형광 표지된 세포의 고해상도 이미지를 얻으려면 이상적으로는 생물학적 샘플을 절편 없이 이미지화해야 합니다. 3DISCO는 유기 용매를 사용한 순차적 배양을 기반으로 하는 간단한 조직 세척 절차입니다. 투명화되면 장기가 투명해져 표본의 종단 간 레이저 스캔이 가능합니다.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

이 프로토콜에서 췌장섬은 전용 다중 플랫폼 응용 프로그램에서 구현 된 계산 알고리즘을 사용하여 재구성되고 분석됩니다.

구조 및 기능 분석을위한 도구로서의 췌장섬의 전산 재구성

우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

학습하세요 인간 췌장 조직의 고해상도 3D 이미징을 위한 수동적 광학 클리어링 방법을 통해 췌도 신경망을 시각화하는 기술을. 이 프로토콜은 당뇨병 신경생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

더 많은 동영상 탐색