December 22nd, 2017
인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한 모델
이 절차의 전반적인 목표는 in vitro에서 피부 생물학을 연구하기 위한 모델로 사용할 수 있는 1차 인간 각질세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 인간의 각질세포 분화가 어떻게 조절되는지 또는 염증성 피부 질환을 연구하기 위한 모델로 사용되는지와 같은 표피 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 1차 인간 각질세포를 남성과 여성 모두의 성인 피부에서 전통적으로 분리할 수 있으며 18세 이상의 모든 연령의 피부를 포함할 수 있다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Annette Blak Rasmussen입니다. 시작하려면 DPBS에서 0.25% 트립신과 0.1% 포도당으로 구성된 50ml 용액을 준비합니다. 그런 다음 용액을 혼합하고 여과하여 살균합니다.
RPMI 1640 10ml와 2%FBS, DPBS 50mL 및 각질세포 무함유 혈청 배지(KSFM)를 준비합니다. KSFM 보충제와 250마이크로리터의 겐타마이신을 500ml의 KSFM에 첨가합니다. 그런 다음 사용하기 전에 용액을 섭씨 37도로 예열하십시오.
성형 수술을 받는 건강한 성인 지원자로부터 10cm x 15cm 크기의 피부 샘플을 수집합니다. 냉각 요소가 들어있는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 넣어 운반하여 피부를 시원하게 유지하십시오. 필요한 경우 피부 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오.
멸균된 가위, 메스, 집게를 사용하여 피부 아래의 지방을 제거합니다. 그런 다음 바늘을 사용하여 접시 위에 있는 멸균 덮개의 피부 부분을 버클로 채웁니다. 살균 된 마른 거즈 패드로 피부를 깨끗이 닦습니다.
그런 다음 멸균된 거즈 패드에 70% 에탄올을 바릅니다. 그런 다음 발 대패를 사용하여 피부 부분의 상부 표피층을 잘라내어 9cm 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 미리 준비한 DPBS 트립신 포도당 용액 25ml를 즉시 페트리 접시에 첨가합니다.
샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 DPBS 트립신 포도당 용액을 제거하고 RPMI 1640 10ml와 2%FBS를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 이제 두 개의 집게로 피부 부분의 표피와 피부 구획을 부드럽게 긁고 교반하여 표피 세포를 배지로 방출합니다.
금속 필터를 통해 표피 세포 현탁액을 여과하고 여과액을 50ml 튜브에 수집합니다. FBS와 와류가 없는 10ml의 RPMI 1640이 들어 있는 50ml 튜브에 나머지 피부 절편을 10초 동안 추가합니다. 금속 필터를 통해 이 현탁액을 표피 세포 현탁액이 들어 있는 50ml 튜브로 여과합니다.
그런 다음 총 부피 50밀리리터에 DPBS를 추가합니다. 세포 현탁액을 450배 G와 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 세포 펠릿의 크기에 따라 표피 세포 펠릿을 섭씨 37도 KSFM의 약 10ml에 다시 현탁시킵니다.
트리판 블루 염색 방법을 사용하여 현미경으로 세포를 계수합니다. 그런 다음 각 75제곱센티미터 배양 플라스크에 섭씨 37도 KSFM 12밀리리터와 함께 10의 8배를 6번째 셀로 옮깁니다. 세포가 균일하게 분포되도록 배양 플라스크를 부드럽게 흔듭니다.
습도 100%와 CO2 5%의 섭씨 37도 인큐베이터에서 각질 세포를 배양합니다. 2일 후에 배지를 교체하고 일주일에 세 번 교체합니다. 세포가 70-80% 농도에 도달하면 인큐베이터에서 0.05%트립신 EDTA 용액을 섭씨 37도로 적당량 유지합니다.
세포에서 배지를 제거하고 예열 된 0.05 % 트립신 EDTA 용액의 75 평방 센티미터 배양 플라스크 당 4.5 밀리리터를 세포에 첨가합니다. 배양 플라스크를 섭씨 37도의 인큐베이터에 약 5분 동안 넣은 후 현미경으로 세포가 헐거워지기 시작했는지 확인합니다. 세포의 약 50%가 느슨해지면 배양 플라스크를 손으로 가볍게 두드려 남은 세포를 느슨하게 합니다.
그런 다음 트립신을 비활성화하기 위해 75제곱센티미터 배양 플라스크에 섭씨 37도 RPMI 1640 6밀리리터와 2%FBS를 첨가하고 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 3ml의 RPMI 1640과 2%FBS로 배양 플라스크를 헹구고 50ml 튜브에 배지를 추가합니다. 그런 다음 450배 G와 실온에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.
10밀리리터의 섭씨 37도 KSFM을 사용하여 펠릿화된 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 10의 세 번 곱을 여섯 번째 세포로 세어 150제곱센티미터 배양 플라스크에 넣고 섭씨 37도의 KSFM을 20밀리리터와 함께 넣습니다. 세포가 균일하게 분포되도록 배양 플라스크를 부드럽게 흔든 후 세포를 인큐베이터로 다시 넣습니다.
배양액이 80-90% 합류할 때 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 세포를 트립신화하고 50ml 튜브로 옮긴 후 배양 플라스크를 6ml의 RPMI 1640과 2%FBS로 헹구고 50ml 튜브에 추가합니다. 튜브를 G 450회, 섭씨 4도의 온도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 얼음 냉전 냉동 매체를 준비합니다.
KSFM에 10%DMSO를 더한 셀 펠릿을 다시 현탁합니다. 그런 다음 세포를 계수한 후 표준 저속 동결 냉동 보존 방법을 사용하여 10의 6배에서 밀리리터당 6번째 세포의 밀도로 동결합니다. 사용할 준비가 될 때까지 각질 세포를 액체 질소에 보관하십시오.
여기에서 볼 수 있듯이, 이 비디오에서 보여준 바와 같이 인간의 각질세포를 분리하고 배양한 다음 칼슘으로 자극했습니다. 이 이미지는 대조군 처리된 세포와 비교하여 1일차와 2일차에 칼슘 첨가로 인한 형태학적 변화를 보여줍니다. 형태학적 변화 외에도 칼슘을 첨가하면 분화 마커 인볼루크린(Involucrin)에 대한 mRNA의 전사가 24시간 후 5.5배, 48시간 후 3.5배 증가했습니다.
이 실험에서는 배양된 각질세포를 다양한 시간 동안 IL-1 베타로 자극했습니다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)에서 볼 수 있듯이, IL-1 베타 자극은 p38 MAP 키나아제의 총 단백질 수치에 영향을 미치지 않았기 때문에 5분 이내에 IL-1 베타 자극은 p38 MAP 키나아제의 빠른 활성화 인산화로 이어졌습니다. 1시간 후, IL-1 베타에 의해 유도된 p38 MAP 키나아제 인산화는 기저 수준으로 돌아갔다.
개발 후 이 기술은 인간 표피 세포 생물학 분야의 연구자들이 선천성 면역 반응과 피부 발달에서 각질 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성인 인간 피부에서 1차 각질 세포를 분리하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 in vitro 피부 생물학을 연구하기 위한 모델로 사용될 수 있습니다.
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이 기사는 체외 피부 생물학 연구를 위한 모델로 사용되는 성인 피부에서 1차 인간 각질세포를 분리하는 방법을 소개합니다. 이 기술은 18세 이상의 개인의 피부에 적용할 수 있으며, 표피 세포 생물학 및 염증성 피부 질환에 대한 통찰을 제공합니다.
Primary human keratinocyte models enable mechanistic de-risking in cutaneous biology by providing a human-relevant system for studying epidermal barrier function and immune responses. This approach supports target validation and assay development for inflammatory skin diseases, improving predictive confidence in preclinical programs. The method facilitates translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating scalable, reproducible primary cell preparations.
The keratinocyte isolation method integrates into early discovery workflows by supplying validated human epidermal cells for target engagement and pathway modulation studies.