Name: 생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 배우세요 성인 피부에서 1차 인간 각질형성세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 피부 생물학 및 염증성 피부 질환 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 체외 모델을 제공합니다.

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저자는 아네트 Blak 라 스무 센과 크리스틴 Moeller 그들의 기술 지원에 감사 하고자

건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부 샘플 컬렉션 호스트 기관에서 윤리 위원회 로부터 승인을 받아야 합니다. 이 프로토콜은 지역 윤리 위원회의 지역 Midtjylland, 덴마크 (M-20110027)에 의해 승인 되었다. 여기에 설명 된 메서드는 Maciaq 그 외 여러분 에 의해 비슷한 연구에서 파생 된 10 그리고 Liu와 Karasek11.
1입니다. 인간의 피부에서 Keratinocytes의 격리
<ol>
	<li>다음과 같은 솔루션을 제작 하 여 시작: DPBS에 0.25 %trypsin 및 0.1% 포도 당 50ml 솔루션. 믹스와 필터 소독 (0.2 µ m) 솔루션. RPMI-1640 + 2 %FBS 솔루션, DPBS 및 keratinocyte 혈 청 무료 매체 (KSFM)의 50 mL의 10 mL를 준비 합니다. KSFM의 500 ml KSFM 보충 및 gentamycin의 250 µ L를 추가 합니다. 미리 따뜻한 솔루션을 사용 하기 전에 37 ° C.</li>
	<li>건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부를 수집 합니다. 피부 샘플 사용 하지만 약 10 cm x 15 cm, 크기에서 다를 수 있습니다. 냉각 요소를 포함 하는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 운반 하 여 교통 아래 피부 차가운 유지. 필요한 경우, 피부 샘플 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>소독, scalpels가 위와 집게를 사용 하 여 피부 섹션 아래에서 지방을 제거.</li>
	<li>바늘을 사용 하 여 접시 위에 무 균 커버에 피부 섹션 (약 10 cm x 15 cm) 버클. 첫째, 건조 멸 균된 거 즈 패드와 함께 피부를 청소. 다음 70% 에탄올으로 소독된 거 즈 패드를 사용 하 여 피부를 청소.</li>
	<li>발 평면을 사용 하 여, 피부 섹션의 상위 계층 (표 피)의 잘라 고 9 cm 배양 접시에에서 넣어. 다음, 즉시 페 트리 접시 (단계 1.1에서에서 준비) DPBS/트립 신/포도 당 솔루션의 25 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 배양 접시에서 DPBS/트립 신/포도 당 솔루션을 제거 하 고 RPMI 1640 + 2 %FBS 트립 신을 비활성화에 10 mL을 추가.</li>
	<li>두 개의 집게를 사용 하 여, 지금 분리 상피 세포 매체에 부드럽게 된다고 하 고는 표 피와 피부 부분의 피부 구획을 교 반 하십시오.</li>
	<li>표 피 세포 현 탁 액 (1 m m 구멍 크기), 금속 필터를 통해 필터링을 50 mL 튜브에 수집 합니다. FBS와 소용돌이 없이 RPMI-1640의 10 mL를 포함 하는 포함 하는 표 피 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 금속을 통해 서 스 펜 션 필터의 s. 필터 10 개 50 mL 튜브에 나머지 피부 섹션을 추가 합니다. 50 mL의 총 볼륨 DPBS를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션 실내 온도에 450 x g에서 10 분 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 37 ° C KSFM 셀 펠 릿의 크기에 따라 약 10 mL에 상피 세포 pellet을 resuspend. Trypan 블루 얼룩 현미경 메서드를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 10 cm x 15 cm 피부 단면도에서 얻은 세포 수는 약 50-100 x 106 세포입니다. 각 75 cm2 문화 플라스 크를 37 ° C KSFM의 12 mL와 8 x 106 셀을 전송 합니다. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 flasks 흔들.</li>
	<li>Keratinocytes 100% 습도 및 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 품 어. 2 일 후에 세 번 매주 매체를 변경 합니다. 문화는 keratinocytes의 확산 속도 따라 약 2 주 후 70-80% 합칠 때 세포를 통과.</li>
</ol>
2. 뿌리고 Keratinocytes의
<ol>
	<li>인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 4.5 mL를 사용 하 여 75 cm2 문화 플라스 크에 대 한.</li>
	<li>매체는 셀에서 제거 하 고 4.5 mL/75 cm2 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.</li>
	<li>셀의 약 50%는 느슨하게 하면 부드럽게 손 풀고 나머지 셀에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 75 cm2 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 6 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 키를 누릅니다.</li>
	<li>린스 RPMI 1640 + 2%의 3 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 실내 온도에 450 x g에서 10 분에 대 한 셀 원심
	<ol>
		<li>KSFM (37 ° C) 10 mL에 수송과 셀 resuspend 셀을 계산 하 고 KSFM (37 ° C)의 20 mL와 150 cm2 문화 플라스 크에 3 x 106 셀을 전송. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 플라스 크를 흔들어. 문화는 (냉동 프로토콜 아래 섹션 3 참조) keratinocytes의 확산 속도 따라 약 4-6 일 소요 80-90% 합칠 때 셀을 고정 합니다. 적절 한 냉동된 주식을 생성 하 keratinocytes를 확장 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다. 동결 Keratinocytes의
<ol>
	<li>인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 9 mL를 사용 하 여 150 cm2 문화 플라스 크에 대 한.</li>
	<li>매체는 셀에서 제거 하 고 9 mL/150 cm2 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.</li>
	<li>셀의 약 50%는 느슨하게 하면 나머지를 완화 하기 위해 부드럽게 손에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 150 cm2 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 12 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 발음 키를 누릅니다.</li>
	<li>린스 RPMI 1640 + 2%의 6 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 4 ° c.에 450 x g에서 10 분 동안 관을 원심 매체 (KSFM + 10 %DMSO) 얼어 얼음 처럼 차가운 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>Resuspend KSFM + 10 %DMSO 셀 펠 릿, 셀, 및 표준 느린 냉동 cryopreservation 방법12를 사용 하 여 6 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 동결.</li>
	<li>사용할 준비가 될 때까지 액체 질소 (기상) keratinocytes를 저장 합니다.</li>
</ol>
4. 해빙과 동결된 Keratinocytes 경작
<ol>
	<li>빠르게 녹여 37 ° C 물 욕조에 적절 한 냉동된 튜브. 70% 에탄올을 사용 하 여는 cryovial의 외부를 청소. 문화 플라스 크에 세포 (약 15, 000 셀/cm2)의 적절 한 번호를 전송 하 고 즉시 문화 플라스 크를 미리 데워 진된 성장 매체 (KSFM)를 추가 합니다. 문화 플라스 크의 어떤 크기 든 지 실험의 설정에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5 mL 문화 매체를 사용 하 여 25 cm2 문화 플라스 크에 대 한.</li></ol>셀 수 추가 문화 플라스 크는 세포의 성장을 기증자 기증자에서 다르기 때문에 다를 수 있습니다. 셀 100% 습도 및 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 품 어.
	<li>변경 후 2 일 매체 세 번 매주 신선한 미리 데워 진된 KSFM을 사용 하 여. 참고: 데이터 평균 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 분리 하는 세포의 95%는 keratinocyte 마커 cytokeratine-1413에 대 한 긍정적인 것을 증명 하고있다.</li>

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<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
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</ol>

. 저자는 충돌의 관심이 있다.

여기, 우리가 쉽게 기본 인간의 keratinocytes 성인 피부에서 분리 하는 방법과 생체 외에서문화를 설명 합니다. 이 모델의 표 피 세포 생물학, 조사에 대 한 광범위 한 응용 프로그램을 가질 수 있으며 연구자 피부 질병을 공부에 관심이 더 유용할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜의 장점 중 일부입니다 keratinocytes 신생아 남성 할례를 받고에서 얻은 신생아 포 피에서 분리, 달리 성인 환자에서 1 차 인간의 keratinocytes 남성과 여성 모두에서 격리 그리고 모든 나이 ≥18 년 포함 될 수 있습니다. 따라서, 생물 다양성은이 세포와 keratinocytes 신생아 포 피에서 비교에 훨씬 더 큰. 또한, 피부 샘플의 비교적 큰 조각 성형 수술, 유 방 감소 수술 체중 감소 수술 등 환자에 게 서 얻어질 수 있다.
위에서 언급 한 표 피는 keratinocytes의 특정 분화 단계에 해...

피부는 인체의 가장 큰 장기 이며 외부 환경에 대 한 보호벽 역할. 피부는 두 가지 주요 레이어 구성: 진 피와 표 피, 표 피는 피부의 가장 바깥쪽 레이어를 구성 하는 곳. 표 피에서 가장 풍부한 셀 타입 keratinocytes 셀 대량1,2의 95% 이상으로 구성 된입니다. Keratinocytes는 표 피에 차별화의 다양 한 단계에서 유지 하 고 차별화3의 특정 단계에 해당 하는 기초, spinous, 세분화, 및 cornified 계층으로 구성 됩니다. Keratinocytes의 기본 기능은 외부 세계에 그대로 배리어를 생산 함으로써 표 피의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다.
Keratinocytes는 또한 피부에 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 대표 하 고 따라서 타고 난 면역 반응4,5에서 중요 한 역할. 외부 자극에는 keratinocytes의 노출 및 연속적으로, 세포내 신호 통로의 활성화 다양 한 cytokines, 발산, 및 항균 성 펩 티 드를 포함 하 여 다양 한 선 동적인 중개자의 생산 리드. 이러한 keratinocyte 파생 단백질 보충 하 고 활성화 하는 수지상 세포, 호 중구, 특정 T 세포6,7등 면역 세포 염증 반응에 참가. 따라서, keratinocytes 수많은 생물학 과정에 중요 한 역할을 하 고, 때문에 피부 생물학 공부를 생체 외에서 모델을 생성 하 뒤 여기에 제시 된 기술에 근거가 했다. 신생아 포 피에서 얻은 기본 keratinocyte 문화 자주 피부 생물학8,9공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 기술을 두 남녀에서 keratinocytes 셀의 높은 생물 다양성의 결과로 얻어진 다.
여기, 선물이 분리와 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 유지 보수를 포함 하 고는 keratinocytes의 동결. 이 방법의 전반적인 목표 생성 기본 인간의 keratinocytes 피부 생물학 생체 외연구 모델로 사용 될 수 있는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>KSFM 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td> 보충제 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS 칼슘 및 마그네슘 없음</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>디메틸 설폭시드</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>세포 배양 배지 첨가제</td></tr><tr><td>멸균 필터</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>공극 크기가 0.2 &micro인 주사기 필터; m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>세포 트립신화에 사용</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>트립신 겸자를 비활성화하는 데 사용됨</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>모든 회사의 겸자를 사용할</td></tr> <tr>수 있습니다.<td>가위</td><td>-</td><td>-</td><td>어떤 회사의 가위도 사용할 수</td></tr> 있습니다. <tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>어떤 회사의 메스를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>70% 에탄올</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-모든</td> 공급자의 거즈 패드 <td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>거즈 패드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. Foot planer</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>모든 공급자의 Foot planer를 사용할</td></tr> <tr>수 있습니다.<td>페트리 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>모든 공급자의 페트리 접시를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>금속 필터</td> <td>-</td><td></td> <td>사내 1mm 구멍 크기 금속 필터</td></tr><tr><td>75 cm 2 배양 플라스크</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>156499-150 cm 2 배양 플라스크</td><td>TTP</td><td>90151-0.05</td><td></td></tr> <tr><td>% 트립신-EDTA 솔루션</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>계대노화 시 세포를 트립신화하는 데 사용</td></tr></tbody></table>

생성 및 기본 인간 keratinocytes 성인 피부에서의 경작

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Keratinocytes의 주요 기능 표 피, 유지 하 고 외부 세계에 기계적인 방 벽의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다. 또한, keratinocytes 빠른, 일반적인 방식으로 항 원 자극에 응답 하는 타고 난 면역 체계의 부분이 되 고에 의해 개시, 유지 보수, 그리고 피 면역 반응의 규칙에서 필수적인 역할을 재생 합니다. 우리가 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 셀 칼슘 유도 터미널 차별화, 차별화 마커 involucrin의 증가 식에 의해 측정에 응답 입증 하 고. 또한, 우리는 고립 된 keratinocytes p38 MAPK 통로의 활성화에 의해 측정 된 세포내 신호 통로의 활성화 IL 1β 유도 반응 하 보여줍니다. 함께 찍은, 고립과 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 경작 하는 방법을 설명 합니다. Keratinocytes는 표 피에 우위 한 세포 종류 이기 때문에,이 방법은 피부 생물학 생체 외에서 분자 메커니즘 연구 유용 합니다.

칼슘 유도 터미널 차별화 인간의 keratinocytes 칼슘14,,1516치료 시 터미널 차별화를 받 다. 기본 인간 keratinocytes 고립 되었고 위의 프로토콜에 설명 된 대로 양식. 때 약 50-60% 합칠 셀 칼슘 (1.2 m m) 자극 했다 또는 0, 1 및 2 일에 차량 및 셀의 사진을 찍은. 그림 1 에서는 칼슘 자극 시 관찰 keratinocytes의 형태학 변화.
Involucrin의 식이 칼슘 자극 시 증가 교양된 인간 keratinocytes 약 50-60% 합칠 후 셀 칼슘 (1.2 m m) 또는 24 및 48 h 차량 자극 했다까지 성장 했다. 우리는 그는 ke...

인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한 모델

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

이 절차의 전반적인 목표는 in vitro에서 피부 생물학을 연구하기 위한 모델로 사용할 수 있는 1차 인간 각질세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 인간의 각질세포 분화가 어떻게 조절되는지 또는 염증성 피부 질환을 연구하기 위한 모델로 사용되는지와 같은 표피 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 1차 인간 각질세포를 남성과 여성 모두의 성인 피부에서 전통적으로 분리할 수 있으며 18세 이상의 모든 연령의 피부를 포함할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Annette Blak Rasmussen입니다. 시작하려면 DPBS에서 0.25% 트립신과 0.1% 포도당으로 구성된 50ml 용액을 준비합니다. 그런 다음 용액을 혼합하고 여과하여 살균합니다.RPMI 1640 10ml와 2%FBS, DPBS 50mL 및 각질세포 무함유 혈청 배지(KSFM)를 준비합니다. KSFM 보충제와 250마이크로리터의 겐타마이신을 500ml의 KSFM에 첨가합니다. 그런 다음 사용하기 전에 용액을 섭씨 37도로 예열하십시오.성형 수술을 받는 건강한 성인 지원자로부터 10cm x 15cm 크기의 피부 샘플을 수집합니다. 냉각 요소가 들어있는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 넣어 운반하여 피부를 시원하게 유지하십시오. 필요한 경우 피부 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오.멸균된 가위, 메스, 집게를 사용하여 피부 아래의 지방을 제거합니다. 그런 다음 바늘을 사용하여 접시 위에 있는 멸균 덮개의 피부 부분을 버클로 채웁니다. 살균 된 마른 거즈 패드로 피부를 깨끗이 닦습니다.그런 다음 멸균된 거즈 패드에 70% 에탄올을 바릅니다. 그런 다음 발 대패를 사용하여 피부 부분의 상부 표피층을 잘라내어 9cm 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 미리 준비한 DPBS 트립신 포도당 용액 25ml를 즉시 페트리 접시에 첨가합니다.샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 DPBS 트립신 포도당 용액을 제거하고 RPMI 1640 10ml와 2%FBS를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 이제 두 개의 집게로 피부 부분의 표피와 피부 구획을 부드럽게 긁고 교반하여 표피 세포를 배지로 방출합니다.금속 필터를 통해 표피 세포 현탁액을 여과하고 여과액을 50ml 튜브에 수집합니다. FBS와 와류가 없는 10ml의 RPMI 1640이 들어 있는 50ml 튜브에 나머지 피부 절편을 10초 동안 추가합니다. 금속 필터를 통해 이 현탁액을 표피 세포 현탁액이 들어 있는 50ml 튜브로 여과합니다.그런 다음 총 부피 50밀리리터에 DPBS를 추가합니다. 세포 현탁액을 450배 G와 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 세포 펠릿의 크기에 따라 표피 세포 펠릿을 섭씨 37도 KSFM의 약 10ml에 다시 현탁시킵니다.트리판 블루 염색 방법을 사용하여 현미경으로 세포를 계수합니다. 그런 다음 각 75제곱센티미터 배양 플라스크에 섭씨 37도 KSFM 12밀리리터와 함께 10의 8배를 6번째 셀로 옮깁니다. 세포가 균일하게 분포되도록 배양 플라스크를 부드럽게 흔듭니다.습도 100%와 CO2 5%의 섭씨 37도 인큐베이터에서 각질 세포를 배양합니다. 2일 후에 배지를 교체하고 일주일에 세 번 교체합니다. 세포가 70-80% 농도에 도달하면 인큐베이터에서 0.05%트립신 EDTA 용액을 섭씨 37도로 적당량 유지합니다.세포에서 배지를 제거하고 예열 된 0.05 % 트립신 EDTA 용액의 75 평방 센티미터 배양 플라스크 당 4.5 밀리리터를 세포에 첨가합니다. 배양 플라스크를 섭씨 37도의 인큐베이터에 약 5분 동안 넣은 후 현미경으로 세포가 헐거워지기 시작했는지 확인합니다. 세포의 약 50%가 느슨해지면 배양 플라스크를 손으로 가볍게 두드려 남은 세포를 느슨하게 합니다.그런 다음 트립신을 비활성화하기 위해 75제곱센티미터 배양 플라스크에 섭씨 37도 RPMI 1640 6밀리리터와 2%FBS를 첨가하고 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 3ml의 RPMI 1640과 2%FBS로 배양 플라스크를 헹구고 50ml 튜브에 배지를 추가합니다. 그런 다음 450배 G와 실온에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.10밀리리터의 섭씨 37도 KSFM을 사용하여 펠릿화된 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 10의 세 번 곱을 여섯 번째 세포로 세어 150제곱센티미터 배양 플라스크에 넣고 섭씨 37도의 KSFM을 20밀리리터와 함께 넣습니다. 세포가 균일하게 분포되도록 배양 플라스크를 부드럽게 흔든 후 세포를 인큐베이터로 다시 넣습니다.배양액이 80-90% 합류할 때 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 세포를 트립신화하고 50ml 튜브로 옮긴 후 배양 플라스크를 6ml의 RPMI 1640과 2%FBS로 헹구고 50ml 튜브에 추가합니다. 튜브를 G 450회, 섭씨 4도의 온도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 얼음 냉전 냉동 매체를 준비합니다.KSFM에 10%DMSO를 더한 셀 펠릿을 다시 현탁합니다. 그런 다음 세포를 계수한 후 표준 저속 동결 냉동 보존 방법을 사용하여 10의 6배에서 밀리리터당 6번째 세포의 밀도로 동결합니다. 사용할 준비가 될 때까지 각질 세포를 액체 질소에 보관하십시오.여기에서 볼 수 있듯이, 이 비디오에서 보여준 바와 같이 인간의 각질세포를 분리하고 배양한 다음 칼슘으로 자극했습니다. 이 이미지는 대조군 처리된 세포와 비교하여 1일차와 2일차에 칼슘 첨가로 인한 형태학적 변화를 보여줍니다. 형태학적 변화 외에도 칼슘을 첨가하면 분화 마커 인볼루크린(Involucrin)에 대한 mRNA의 전사가 24시간 후 5.5배, 48시간 후 3.5배 증가했습니다.이 실험에서는 배양된 각질세포를 다양한 시간 동안 IL-1 베타로 자극했습니다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)에서 볼 수 있듯이, IL-1 베타 자극은 p38 MAP 키나아제의 총 단백질 수치에 영향을 미치지 않았기 때문에 5분 이내에 IL-1 베타 자극은 p38 MAP 키나아제의 빠른 활성화 인산화로 이어졌습니다. 1시간 후, IL-1 베타에 의해 유도된 p38 MAP 키나아제 인산화는 기저 수준으로 돌아갔다.개발 후 이 기술은 인간 표피 세포 생물학 분야의 연구자들이 선천성 면역 반응과 피부 발달에서 각질 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성인 인간 피부에서 1차 각질 세포를 분리하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 in vitro 피부 생물학을 연구하기 위한 모델로 사용될 수 있습니다.

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

인간의 피부에서 가능한 성인 상피 줄기 세포를 분리의 신속하고 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 모낭과 세포 배양에 대한 단세포 suspensions 또는 조직의 파편의 격리에 따버릴 다음 피부 콜라겐 매트릭스의 효소 소화를 활용합니다.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

이 비디오는 효소 분해와 기계적 파괴 방법을 조합하여 인간 피부의 표피층에서 가장 두드러진 세포인 각질 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 선택적 성장 배지를 사용하여 다른 피부 세포 유형보다 각질 세포의 우선적 성장을 돕습니다.

인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

이 비디오는 유전자 변형 1차 인간 각질 세포 재조합 레트로바이러스를 생산하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 각질 세포에서 유전자 발현을 조작하는 데 사용할 수 있습니다.

1차 인간 각질세포의 유전자 변형: 재조합 레트로바이러스를 이용하여 각질세포를 유전적으로 조작하는 방법

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 논문의 목표는 표피 각질세포와 활력을 잃은 인간 진피로부터 유전적으로 변형된 인간 유기형 피부를 생성하는 방법에 대한 포괄적이고 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

이 프로토콜은 재현 가능하고 견고한 방식으로 3차원 재구성된 인간 표피를 육성하는 간단한 방법을 설명합니다. 또한 표피 장벽 모델의 구조 기능 관계를 특성화합니다. 선동적인 자극에 재구성된 인간 표피의 생물학 반응은 또한 제시됩니다.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

본 프로토콜은 성인용 마우스 입맛에서 파생된 구강 각질 세포의 격리 및 배양을 설명합니다. 면역스테인링을 이용한 평가 방법도 보고된다.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

이 프로토콜은 살아있는 세포 이미징에 사용하기 위해 갓 채취한(계대 0) 각질세포의 배양을 간략하게 설명합니다.

Keratinocyte Live Cell Imaging을 위한 1차 배양 생성

배우세요 성인 피부에서 1차 인간 각질형성세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 피부 생물학 및 염증성 피부 질환 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 체외 모델을 제공합니다.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

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