Name: 대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 학습하세요 대식세포 융합 연구를 위한 광학 유리 표면 조작 방법을. 산 초음파 처리와 고분자 흡착을 통해 융합 유도 표면을 제작하고 실시간 영상 및 초고해상도 현미경으로 면역 세포 행동을 분석하는 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리가 감사 멤버 Ugarova 실험실 및 센터에 수 사관의 대사와 혈관 생물학에 대 한이 작품의 유용한 토론 하고자 합니다. 제임스 파우스트 2015 년에서 유럽 분자 생물학 실험실 슈퍼 해상도 현미경 코스에서 강사에 게 그의 감사를 표현 하고자 합니다. LLSM에 대 한 샘플 준비에 대 한 Janelia에서 Satya 쿠 온 감사 하 길. 검토 하 고이 작품의 촬영 부분 동안 제임스 파우스트 T32 화목 (5T32DK007569-28)에 의해 지원 되었다. 이 작품의 격자 빛 시트 구성 요소는 HHMI 및 베티와 고 든 무어 재단에 의해 지원 되었다. T.U.는 NIH에 의해 투자 된 HL63199를 부여.

동물을 사용 하는 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 메이 요 클리닉, Janelia 연구 캠퍼스와 애리조나 주립 대학에 의해 승인 되었다.
1. 준비 산 청소 커버 유리
참고: 많은 제조 업체에서 구입 하는 커버 유리 예상 대로 깨끗 한 않을 수 있습니다. 현미경은 관여 하는 모든 프로시저 앞 커버 유리의 일괄 처리를 정기적으로 청소 하십시오.
<ol><li>높은 엄중 커버 유리를 구입. 정확한 두께 (0.15 또는 0.17 m m)을 선택 하려면 특별 한 주의 분리 했습니다. 참고: 커버 유리 두께의 선택은 현미경 목표에 따라 달라 집니다 그리고 객관적인 배럴에 나열 됩니다.</li>
	<li>커버 유리 쥡니다 (42 kHz, 70 W)와 1 시간에 대 한 환기가 화학 증기 두건에서 12 M 염 산에서 품 어. 신선한 12 M HCl와 함께 두 개의 추가 시간에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>초순 수로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>순수한 아세톤 쥡니다와 30 분에 대 한 환기가 화학 후드에 덮개 유리를 품 어. 두 개의 추가적인 시간 동안이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>불 임 초순 물으로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>100% 에틸 알코올 쥡니다와 30 분 동안 화학 후드에서에 덮개 유리를 품 어. 두번 추가이 단계를 반복 합니다. 참고: 에틸 알콜의 순수성이 중요 합니다. 녹은 고체의 형태로 오염 물질 유리에 건조 것입니다 고 대 식 세포 융합을 승진 시킬 수 있다.</li>
	<li>장기 저장에 대 한 순수한 에틸 알코올로 가득 컨테이너에 산 성 청소 커버 유리를 놓습니다. 또는 커버 유리 질소 가스와 진공 desiccator에서 건조.</li>
</ol>2. 품질-Fusogenic 광학 표면 준비
<ol><li>DMSO 무료 분해 초순 톨루엔에 포인트 파라핀 왁 스 높은 녹는. 참고: 주식 농도가 10 mg/mL에서 있으며 희석된 1:9 1 mg/mL 작업 솔루션으로 만들기 위해 초순 톨루엔에. 주의: 톨루엔 처리 되어야 합니다 주의 기형 발생 물질으로. 기관 화학 위생 계획에 따라 톨루엔의 처분.</li>
	<li>파라핀 솔루션 건조 산 청소 커버 유리를 균일 하 게 유리 표면을 커버 하는 볼륨에 작업을 적용 합니다. 초과 솔루션을 가만히 따르다 하 고 건조 한 질소 가스 또는 공기 커버 유리. 대량 준비, Coplin jar 커버 유리를 수용 하도록 설계 된 사용 합니다.</li>
	<li>커버 유리 폴란드어 x 축에 3 타 차로 및 다음 보풀 지우기 y 축에 3 타 차로 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>실험을 실시 하기 전에 즉시 살 균 초순, 커버 유리를 세척 하 고 생물 안전 후드에 자외선 빛으로 15-30 분 후 소독. 또는, 에틸렌 산화물 또는 감마 방사선 조사에 의해 커버 유리를 소독.</li>
</ol>3. Micropatterning 탄화수소 포함 된 화합물 융합 제한 미리 지역
<ol><li>건조 한 산 청소 덮개 유리 및 유리는 평평한 표면에 고정.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 신중 하 게 골드 전송 전자 현미경 검사 법 파인더 그리드 탄화수소 compound(s)의 작업 솔루션에 젖어. 실험의 최종 목표를 충족 하는 탄화수소 화합물을 선택 하십시오 ( 표 1참조). 부드럽게 필터 종이에 그리드를 활용 하 여 멀리 초과 솔루션을 심지 하 고 즉시 덮개 유리의 센터에 눈금을 배치. 다음 단계로 진행 하기 전에 2 분 동안 건조 톨루엔을 허용 합니다.</li>
	<li>그리드는 조심 스럽게 거꾸로 유리 유리에 보 세 다는 것을 확인 하십시오. 경우에 그리드 분리 3.2 새로운 커버 유리를 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 참고: 플라즈마 클리너를 사용할 수 없는 경우 3.4 단계를 생략 합니다.</li>
	<li>플라즈마는 진공 가스 플라즈마 처리에 의해 커버 유리를 청소. 참고: finder 그리드는 플라즈마에서 긴 사슬 탄화수소 흡착 내부 표면을 보호 하는 마스크 역할을 합니다. 그리드에 의해 보호 지역 플라즈마에 노출에 의해 비 fusogenic 렌더링 됩니다. 커버 유리는 플라즈마에 노출 시간 실험적으로 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 파인 팁 집게를 사용 하는 micropattern를 노출 유리 표면에서 그리드를 제거.</li>
</ol>4. 조작 유리 하단 요리
<ol><li>35 m m 플라스틱 단계 드릴 비트를 사용 하 여 배양 접시의 바닥에 6 ~ 10 mm 원형 구멍을 드릴 합니다. 참고: 단계 드릴 비트를 사용 하 여 부드러운 가장자리를 만들려고 하는. 가장자리 너무 거친 경우에, 커버 유리 접시의 바닥에 평평 본드 하지 것입니다. 불완전 하 게 평면 어려워질 현미경 검사 법.</li>
	<li>신중 하 게 혼합 하 고 (즉,입니다; 제조업체의 지침에 따라 실리콘 엘라 스토 머를 드 PDMS)입니다.</li>
	<li>탄성 중합체의 가장자리에 그냥 proximate의 얇은 코팅을 적용 (즉, 세포핵) 구멍. 참고:는 탄성 연속 이라도 얇은 밴드 구멍 주변으로 나타납니다.</li>
	<li>부드럽게 적용 fusogenic 커버 유리 (섹션 2 참조), 또는 (섹션 1에서에서 설명한) 건조 산 청소 커버 유리 접시에 탄성에 의해 포위 하는 구멍을 커버 하기 위해. 커버 유리 접시의 바닥에 플러시 나타납니다 확인 하는 유리의 상당한 부분 플라스틱 접촉 구멍의 지름을 확장. 2-3 h 50 ° C에서 굽기 여는 탄성 중합체를 치료.</li>
	<li>Fusogenic 유리 선호 하는 경우, UV 소독 표준 프로토콜에 따라 요리와 문화 셀. 그러나, 선호는 micropattern 이면 micropattern 준비에 대 한 3.2 단계로 진행 (micropatterning 사용 가스 플라즈마 접시 sterilizes을 강하게 PDMS 유리).</li>
</ol>5. Thioglycollate elicited 세포 수집
<ol><li>앞에서 설명한3,,468 주 오래 된 C57BL/6 쥐 4% 맥주의 thioglycollate의 살 균 솔루션의 0.5 mL를 주사.</li>
	<li>72 시간 후, 승인 된 동물 보호에 따라 동물을 안락사 지침, 고 차가운 인산 염 버퍼 염 분 보충 5 m m ethylenediaminetetraacetate와 복 막 게 하 여 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>3 분 x 300g에 대 식 세포를 원심 및 resuspend DMEM:F12 15 mM HEPES, 보충의 1 mL에 10 %FBS, 및 1% 항생제 (배양). 참고: 셀 이후에 Neubauer hemocytometer 함께 계산 됩니다. 대 식 세포는 적절 한 농도를 희석 하 고 표면에 적용. 실험적인 질문을 위해 수 사관에 의해 주어진된 표면에 적용 하는 셀의 수를 신중 하 게 고려 되어야 한다. 기본 문학에서 알려진된 표준을 참조 하십시오.</li>
	<li>30 분 후 HBSS 보충 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 문화 매체와 대체 0.1 %BSA 표면 세척. 문화 인큐베이터 (5% CO2 공기 37 ° C에서)를 반환 합니다.</li>
	<li>2 시간 후, 매체를 발음 하 고 배양 10 ng/mL IL-4의 보충으로 바꿉니다. 4설명 되어 있는 대로 셀을 이미지.</li>
</ol>

<ol><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+induces+foreign+body+giant+cells+from+human+monocytes%2Fmacrophages.+Differential+lymphokine+regulation+of+macrophage+fusion+leads+to+morphological+variants+of+multinucleated+giant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells.</a> Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).</li>
<li>Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mediators+of+macrophage+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mediators of macrophage fusion.</a> Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).</li>
<li>Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4973655/">The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion.</a> Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).</li>
<li>Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fusogenic+glass+surfaces+that+impart+spatiotemporal+control+over+macrophage+fusion%3A+Direct+visualization+of+multinucleated+giant+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation.</a> Biomaterials. 128, 160-171 (2017).</li>
<li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylsilane-modified+surfaces%3A+Inhibition+of+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation.</a> J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).</li>
<li>Vignery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+fuse+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Fusion%3A+Overviews+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to fuse macrophages in vitro.</a> Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign-body+giant+cells+and+polyurethane+biostability%3A+In+vivo+correlation+of+cell+adhesion+and+surface+cracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking.</a> J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).</li>
<li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+body+reaction+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li>
<li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-coupled+polyethylene+oxide+on+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).</li>
<li>DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+and+surface+chemistry+control+of+monocyte%2Fmacrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+by+photochemically+micropatterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces.</a> J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).</li>
<li>Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocyte%2Fmacrophage+adhesion%2C+macrophage+motility%2C+and+IL-4-induced+foreign+body+giant+cell+formation+on+silane-modified+surfaces+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Fölling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+method+for+molecular+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Proposed method for molecular optical imaging.</a> Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM%2C+iPALM%2C+and+correlative+iPALM-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Planchon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+three-dimensional+isotropic+imaging+of+living+cells+using+Bessel+beam+plane+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination.</a> Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

확인 하 고 이후에 대 식 세포 융합을 촉진 하는 품질 광학 유리 표면 개발 필요 사실 더 최근에 출판 된 연구 직접까지 생활의 맥락에서 대 식 세포 융합을 시각에서 비롯 된 표본3, 4. 일반적으로 사용 되는 fusogenic 플라스틱 표면 LWD 목표 요구 되며 단계 대조 광학으로 제한는 사실 때문입니다. 이 방 벽 뿐만 아니라 대 식 세포 융합의 특별 한 요금을 추진 하지만 MGCs의 형성 공간 제어의 놀라운 학위를이 수 한 품질 광학 유리 표면 공학에 의해 극복 되었다.
이 기술은 대 식 세포 융합을 모니터링 고급 이미징 기술 사용할 수 있습니다, 있지만 제한 없이 오지 않는다. 긴 사슬 탄화수소 (예를들면, oleamide, 파라핀 왁 스, 등)와 흡착 광택된 표면 fusogenic 플라스틱 표면에 비해 대 식 세포 융합의 특별 한 ...

MGCs의 대형 다양을 한 만성 염증1고유 인체에 병 적인 상태를 동반 한다. 계약 형태 MGCs2mononucleated 세포 융합에 불구 하 고 의외로 몇 연구 퓨전 생활 맥락에서 표본3,4. 이 때문에 대부분의 이미징 기법에 필요한 깨끗 한 유리 표면 염증 성 cytokines5에 의해 유도 된 때 대 식 세포 융합을 촉진 하지 않습니다. 실제로, 깨끗 한 유리 사용 하는 경우는 기질으로 대 식 세포 융합, 다음에 대 한 중간 확대 목표 (즉, 10-20 X) 하의 연속 이상 15 h 낮은 이미징 종종 필요 단일 퓨전 이벤트를 관찰 합니다.
다른 손, fusogenic 플라스틱 표면 (예를 들어, permanox) 또는 세균 학년 플라스틱에 퓨전2홍보. 그러나, 플라스틱을 통해 영상 이므로 문제가 기판 두께 이며 빛을 없앤다. 이 긴 작업 거리 (LWD) 목표는 필요한 이후 이미징 복잡. 그러나, LWD 목표는 일반적으로 낮은 조명 coverslip 수정 그들의 대응에 비해 용량 수집 있다. 또한, 미분 간섭 명암 등 견본을 통과 하는 빛의 극성에 변화를 악용 하는 기법 없습니다 가능한 플라스틱 birefringent 이므로. 플라스틱의 사용과 관련 된 장벽은 대 식 세포 융합/MGC 형성 표면에 발생 합니다 예측할 수는 없습니다는 사실에 의해 더 강조 된다. 함께, 이러한 제한 제한 단계 대조 광학, 총 이미징 기간 연장에 대 식 세포 융합의 시각화 (> 15 연속 시간), 그리고 낮은 해상도.
우리는 최근 고정 세포/MGCs4단일 분자 슈퍼 해상도 현미경을 수행 하는 동안 매우 fusogenic 유리 표면을 식별. 이 관찰 했다 유리 청소 때문에 외 표면 촉진의 매우 낮은 속도로 퓨전 ~ 5% 후 인터 루 킨-4 (IL-4) 융해에 의해 결정 된 대로 존재 24 h 색인4. 우리는 발견 퓨전 홍보 용량 oleamide 오염 때문. Oleamide 또는 유사 하 게 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 다른 화합물의 흡착 유리 fusogenic를 했다. 대부분 fusogenic 화합물 (파라핀 왁 스) micropatterned, 고 대 식 세포 융합 및 융합 이벤트는 같은 시간 내에 permanox에 비해 관찰 수에 2-fold 증가 spatiotemporal 제어의 높은 학위를이 수 있습니다. 이러한 광학 품질 서피스 형태 기능 및 생활 표본에서 MGCs의 형성을 제어 하는 활동으로 첫 번째 엿볼 제공.
이 프로토콜에 우리 살아있는 표본에서 MGCs의 형성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 유리 표면의 다양 한의 제작을 설명 합니다. 또한, 우리는 이러한 서피스는 의무가 멀리 필드 슈퍼 해상도 기법을 보여줍니다. 표면 제작, 실험의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 각 표면 진행 텍스트에 관련 된 예제와 함께 설명.

<table><tbody><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PCD-32G</td><td></td></tr><tr><td>파인더 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>G400F1-Au</td><td>모든 금 TEM 그리드가 작동합니다</td></tr><tr><td>커버 유리(22x22mm)</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>고강도 커버 유리만 사용</td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17310</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16415</td><td>&알파;-토코페롤이 없어야 합니다</td></tr>. 올<tr><td>레아미드</td>로 대체하는 경우 <td>시그마 알드리치</td><td>O2136</td>은 신선한 <td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td>을 준비합니다. <td>시그마 알드리치</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>시그마 알드리치</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>VWR 국제</td><td>BDH1101</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15050</td><td>사용 저용존 고형물 에탄올</td></tr><tr><td>염산</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212</td><td>사용 산 세척 커버 유리</td></tr><tr><td>Slyguard 184</td><td>VWR International</td><td>102092-312</td><td>1:10 비율로 혼합하고 50 °C에서 경화; C for 4 h</td></tr><tr><td>35 mm 페트리 접시</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-351864</td><td></td></tr><tr><td>Dumont no. 5 forceps</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72705</td><td>섹션 3.5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Corning</td><td>10-092</td><td>에는 15mM HEPES</td></tr><tr><td>펜/스트렙</td>트 <td>코닝</td><td>30-002-Cl</td><td></td>이 포함되어 있습니다.</tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576</td>은 <td>HBSS에서 0.1%로 사용하여 비접착성 대식세포</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Genscript</td><td>Z02996</td><td>분취를 10μ에서 세척합니다. g/mL 및 -20°C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>조영제가 필요하지 않은 고정 샘플이나 기법에 사용</td></tr><tr><td>eGFP-LifeAct 마우스</td><td>해당 없음</td><td></td><td>실시간 형광 이미징에 사용</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark&nbsp;</td><td>34155</td><td>탄화수소 흡착 표면 연마에 사용</td></tr></tbody></table>

대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Multinucleated 거 대 한 세포 (MGCs)의 형성을 시각화 하는 살아있는 표본에서 가장 라이브 이미징 기술이 필요로 유리를 통해, 빛의 전파 이지만 유리에 대 식 세포 융합 드문 이벤트는 사실 때문 도전 하고있다. 이 프로토콜 제공 여러 품질 광학 유리 표면의 제조 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착 fusogenic 표면으로 유리를 변환 합니다. 첫째, 표면 개 질에 대 한 자료를 시작으로 깨끗 한 유리 표면 준비 설명 되어 있습니다. 둘째, fusogenic 기판에 변환 비 fusogenic 유리 하 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 셋째,이 프로토콜 spatiotemporal 제어할 MGC 형성의 높은 학위를 홍보 하는 표면 micropatterns의 제작을 설명 합니다. 마지막으로, 유리 하단 요리 조작 설명 되어 있습니다. 시스템의 사용이 체 외에서 세포 대 식 세포 융합, MGC 형성 연구 모델의 예로 표시 됩니다.

재료의 물리 화학 매개 변수 macrophage 퓨전7,8,,910의 범위에 극적인 영향을 미칠. 또한, 표면 오염 물질 macrophage 퓨전11홍보 알려져 있습니다. 그러므로, 대 식 세포 융합에 대 한 부정적인 제어로 중요 한 시작으로 깨끗 한 커버 유리 하다. 청소 프로토콜 1에에서 설명 된 대로 때는 커버 유리는 매우 명백한 표면 기능, 평면으로 반면 표면 연마 뒤 긴 사슬 탄화수소의 흡착 nanotopography (그림 1)의 정도 만듭니다.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

이 프로토콜에 설명 합니다 품질 광학 유리 표면 흡착 고정 표본 슈퍼 해상도 현미경을 가능 하 게 살아있는 표본의 대 식 세포 융합을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물으로 제조를 .

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비용형적 커버 유리를 모든 형태의 광학 현미경을 사용하여 대식세포 융합을 연구하는 데 사용할 수 있는 용존 표면으로 변환하는 것입니다. 이 방법은 대식세포 융합의 분자 메커니즘과 관련된 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 모든 현미경 기술, 특히 라이브 이미징을 사용하여 대식세포 융합을 연구할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제3연구원인 제임스 파우스트(James Faust)와 제 연구실의 대학원생인 아르나트 발라비예프(Arnat Balabiyev)입니다. 우선, 환기가 잘 되는 화학 흄 후드에서 12몰 염산의 고강성 커버 유리를 1시간 동안 초음파 처리하여 배양합니다. 새로운 12몰 HCL로 단계를 두 번 더 반복합니다.별도의 비커에 초순수를 채우고 커버 유리를 추가합니다. 그런 다음 커버 유리를 5-10분 동안 초음파 처리합니다. 다음으로, 초음파 처리로 30 분 동안 순수한 아세톤으로 커버 유리를 배양합니다.이 단계를 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 별도의 비커에 멸균 초순수를 채우고 커버 유리를 추가합니다. 커버 유리를 5분에서 10분 동안 초음파 처리합니다.초음파 처리로 100 % 에틸 알코올에 커버 유리를 30 분 동안 배양합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 장기 보관을 위해 산으로 세척된 커버 유리를 순수 에틸 알코올이 든 용기에 넣으십시오.또는 덮개 유리를 질소 가스로 건조시키고 진공 데시케이터에 보관하십시오. DMSO가 없는 고융점 파라핀 왁스를 초순수 톨루엔에 용해시킵니다. 유리 피펫을 사용하여 건조한 산 세척 커버 유리에 충분한 파라핀 작업 용액을 바르고 유리 표면을 고르게 코팅합니다.여분의 용액을 디캔팅하고 질소 가스 또는 공기로 덮개 유리를 건조시킵니다. 보푸라기 없는 닦음으로 X축을 따라 세 번 스트로크한 다음 Y축을 따라 세 번 스트로크하여 커버 유리를 연마합니다. 실험 수행 직전에 멸균 초순수를 사용하여 커버 유리를 세척한 후 생물 안전 후드에서 자외선으로 15-30분 동안 살균합니다.산으로 세척된 커버 유리를 건조시키고 유리를 평평한 표면에 고정합니다. 겸자를 사용하여 금 투과 전자 현미경 파인더 그리드를 탄화수소 화합물의 작업 용액에 조심스럽게 담그십시오. 여과지의 그리드를 부드럽게 두드려 여분의 용액을 제거한 다음 즉시 그리드를 커버 유리 중앙에 놓습니다.톨루엔을 2분 동안 건조시킵니다. 유리를 부드럽게 뒤집어 그리드가 유리에 접착되었는지 확인하십시오. 그리드가 분리되면 새 산 세척 커버 유리를 사용하여 접착을 반복합니다.TEM 그리드를 제거한 후 저배율로 마이크로 패턴의 연속성을 검사합니다. 마이크로 패턴은 연속적으로 나타나야 하지만 재료가 패턴의 여백을 넘어 확장되어서는 안 됩니다. 다음으로, 진공 가스 플라즈마가 있는 플라즈마 클리너를 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 커버 유리를 청소합니다.그런 다음 가는 끝 집게를 사용하여 유리 표면에서 그리드를 조심스럽게 제거하여 마이크로 패턴을 노출시킵니다. 스텝 드릴 비트를 사용하여 35mm 플라스틱 페트리 접시 바닥에 가장자리가 부드러운 6-10mm 원형 구멍을 뚫습니다. 제조업체의 지침에 따라 실리콘 엘라스토머를 조심스럽게 혼합하고 가스를 제거하십시오.페트리 접시의 구멍 가장자리에 근접한 엘라스토머의 얇은 코팅을 적용합니다. 엘라스토머는 구멍을 둘러싸고 있는 연속적인 얇은 띠로 나타나야 합니다. 엘라스토머로 둘러싸인 구멍을 덮기 위해 fusogenic 또는 dry acid-cleaned cover glass를 접시에 부드럽게 바릅니다.덮개 유리가 접시 바닥과 같은 높이로 나타나고 구멍의 지름을 넘어 확장되어 유리의 상당 부분이 플라스틱과 접촉하도록 합니다. 엘라스토머를 섭씨 50도에서 2-3시간 동안 굽는 것으로 경화시킵니다. 8주 된 C57 black-6 마우스에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 0.5ml의 4% Brewer's Thioglycolate 멸균 용액을 주입합니다.72시간 후, 승인된 동물 관리 및 사용 지침에 따라 동물을 안락사시킨 후 5밀리몰 EDTA가 보충된 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 복강 세척으로 대식세포를 수집합니다. 대식세포를 300배 G로 3분 동안 원심분리한 후, 15밀리몰 힙 10%FBS 및 1%의 항생제가 보충된 1밀리리터의 DMEM/F-12에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포를 세고 희석하여 30분 동안 표면에 도포한 후 HBSS 0.1%BSA를 사용하여 표면을 세척하고 배양 배지를 교체합니다.그런 다음 배양물을 인큐베이터로 되돌립니다. 2시간 후, 배지를 흡인하고 세포를 이미징하기 전에 IL4 밀리리터당 10나노그램이 보충된 배양 배지로 교체합니다. 이 비디오에 설명된 대로 청소할 때 커버 유리는 뚜렷한 표면 특징 없이 매우 평평합니다. 긴 사슬 탄화수소의 흡수 후 표면 연마는 여기에서 볼 수있는 어느 정도의 나노 지형을 생성합니다.깨끗한 커버 유리 표면에서 대식세포는 매우 낮은 속도로 융합합니다. 대조적으로, IL4가 존재하는 상태에서 24시간이 지나면 장쇄 탄화수소를 포함하는 화합물로 흡착된 표면에 적용된 대식세포는 강력한 융합을 거칩니다. 또한, 용매의 흡수만으로는 유리가 방존 표면이 되지 않습니다.여기서, 광학 현미경의 회절 한계보다 작은 구조의 FWHM(Full Width at Half Maximum)을 사용하여 해상도의 전위차를 정량적으로 평가합니다. 중요한 것은 다양한 표면 간에 100나노미터 형광 비드의 FWHM에서 명백한 차이가 없다는 것인데, 이는 형광 이미징에 필요한 유리의 특성이 충분히 보존되었음을 시사합니다. 이 실험에서는 장쇄 탄화수소를 포함하는 표면에 대식세포를 적용했습니다.그런 다음 3D Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy라고 하는 초고해상도 현미경의 한 형태가 수행되었습니다. 이 비디오는 대식세포를 표면에 적용할 때 다양한 라이브 이미징 기술이 실현 가능하다는 것을 보여줍니다. 일단 마스터하면 유리를 수정하여 표면을 fusogenic으로 만드는 것이 제대로 수행되면 30 분 안에 완료 할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 주의 깊게 따라야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 분자 특이적 대비를 가진 융합 보기를 얻기 위해 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 융합 시 직접 관련된 단백질을 식별하도록 설계된 실험을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 연구자들이 대식세포 융합에 대한 시간 분해 관점을 얻을 수 있는 길을 열었습니다. 앞으로 이것은 대식 세포 융합의 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 대식세포 융합을 연구하기 위해 커버 유리를 수정할 수 있을 것입니다.산과 톨루엔으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 PPE와 적절한 환기를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

fabricating-optical-quality-glass-surfaces-to-study-macrophage-fusion

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

이 비디오는 독립적인 대식세포 매개 적혈구(RBC) 식세포작용 이벤트를 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. 마우스 면역글로불린 G(IgG)-옵소니화된 인간 적혈구를 마우스 대식세포와 함께 배양하고 컨포칼 현미경으로 관찰합니다. 적혈구는 식세포컵(phagocytic cup) 형성을 통해 대식세포에 포위되어 리소좀 분해를 목표로 합니다.

IgG-Opsonized 적혈구의 대식세포 식세포작용(Macrophage Phagocytosis)의 실시간 이미징

이 비디오는 유리 바닥 접시 표면에 부착된 IgG-opsonized 적혈구(RBC)의 대식세포 매개 식세포작용 중 식체(phagosome) 형성 및 폐쇄를 실시간으로 시각화하기 위한 고해상도 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 기술을 보여줍니다. 대식세포는 적혈구 주위로 가성족(pseudopodia)을 확장하고 식체(phagosome) 내부를 삼켜 유리 표면에서 분리합니다.

TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

이 프로토콜은 특정 관심 세포 유형을 분리하기 위해 desthiobiotin, streptavidin, APTES 시스템의 사용자 정의 가능한 표면 기능화를 설명합니다. 또한 이 원고는 이 프로세스의 적용, 최적화 및 검증을 다룹니다.

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

이 프로토콜은 3D 레이저 프린팅을 사용하여 이식형 통합 이미징 창을 제작하는 방법을 설명합니다. 창은 마이크로 스캐폴드와 결합 된 마이크로 렌즈 시스템으로 구성됩니다. 이 방법은 생체 적합성 감광액 SZ2080의 이광자 중합(2PP)을 연속적인 순서로 포함하여 제조 효율성과 서로 다른 구성 요소 간의 정렬을 최적화합니다.

Advanced In Vivo Imaging을 위한 미세 구조 이미징 창에 통합된 이식형 광학 장치의 미세 제작

유리 양모 필터는 전세계 연구 그룹의 숫자 waterborne 바이러스를 집중하는 데 사용되었습니다. 여기 글라스울 필터를 구축하기위한 간단한 접근 방식을 보여 주며 필터도 waterborne 바이러스성, 세균성 및 protozoan 병원균을 집중 효과입니다 보여줍니다.

집중 Waterborne 바이러스와 농업 Zoonotic 병원균에 대한 유리 양모 필터

학습하세요 대식세포 융합 연구를 위한 광학 유리 표면 조작 방법을. 산 초음파 처리와 고분자 흡착을 통해 융합 유도 표면을 제작하고 실시간 영상 및 초고해상도 현미경으로 면역 세포 행동을 분석하는 기술입니다.

대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

더 많은 동영상 탐색