Name: 높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 조직 수준에서 단백질의 절대 정량을 위한 고처리량 양적 도트 블롯(QDB) 분석법을. 마우스 조직에서 CAPG 바이오마커 검증을 통해 신뢰성과 정확성을 입증한 이 방법은 프로테오믹스 연구와 임상 진단에 널리 활용됩니다.

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이 작품은 지원 하 여 대 산 학자 건설 엔지니어링 (gt는), 산동 우수한 젊은 과학자 상 (ZR2016JL026 G. T.), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31771284, 3167070448, 및 81641108), 산동 지방 자연 과학 재단 (ZR2016JL026, 2017GSF18103), 산동 지방 과학 및 기술 (J14LE01와 J15LK03), 옌타이 과학과 기술 plan(2015ZH083) 계획과 Binzhou 의료 대학 과학 연구 기금 (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), 스웨덴 연구 위원회 621-2011-4423 2015-4870을 부여 합니다. 이 작품은 또한 "연대 더블 백 재능 계획" 및 "연대 하이테크 영역 블루 오션 재능 계획" 주최.

모든 동물 절차 Binzhou 의료 대학 동물 사용 지침에 따라 실시 되었고 Binzhou 의과대학의 윤리적 검토 위원회에 의해 승인.
1. 샘플 준비
<ol><li>1.5 mL 튜브에 50mg 마우스 조직 고려. 200 µ L 세포의 용 해 버퍼를 추가 (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 m m NaCl, 5 mM EDTA, 5mm EGTA, 1 mM MgCl2, 10 m m 나2P2O7, 1% 트라이 톤 X-100, 10% 글리세롤), 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 (100 m m NaF, 0.1 m m phenylmethylsulfonyl와 보충 불 소, 5 µ g/mL pepstatin, 10 µ g/mL leupeptin, 5 µ g/mL aprotinin).</li>
	<li>얼음에 1 분 동안 균질 화기로 조직 균질.</li>
	<li>4 ° c.에 8 000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>새로운 튜브 (1.5 mL)에 상쾌한을 수집 하 고 1 µ L BCA 키트 단백질 농도 분석 결과 대 한 밖으로. 참고: 서쪽 오 점 분석 및 점 오 점 분석에 대 한 모든 일반적으로 사용 되 세포의 용 해 버퍼 QDB 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 항 체의 특이성을 결정
<ol><li>1.4 단원의 샘플 lysates (20 µ g)을 준비, 무료 BSA IgG (20 µ g), 서쪽 오 점 분석을 위한 표준 단백질 (600 페이지). 참고: IgG 무료 BSA 부정적인 제어로 사용 되 고 표준 단백질 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 항 체의 특이성은 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 적당 한 크기의 한 밴드를 표시 하 여 보여 줍니다.</li>
</ol>3. QDB 분석의 선형 범위 정의
<ol><li>DdH2O. Dilute 1200 pg / µ L의 농도에 단백질 표준 단백질 분해.</li>
	<li>섹션 4에 1.4 µ g / µ L의 준비 된 샘플에서 집중된 단백질을 희석.</li>
	<li>BSA ddH2O. Dilute 1200 pg / µ L와 4 µ g / µ L의 농도에 단백질 분해.</li>
	<li>표준 단백질 및 준비 샘플의 희석의 시리즈는 표 1 과 표 2의 지도 함께 준비 되었다.</li>
	<li>혼합 10 µ L 희석 표준 단백질 또는 희석 준비 샘플 및 버퍼 로드 x 10 µ L 2 (120 mM Tris HCl pH 6.8, 20% 글리세롤, 4 %SDS, 0.2 %Bromphenol 블루, 200mm DTT) 함께.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg / µ l)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µ l)</td>
			<td>S3 (100pg / µ l)</td>
			<td>S3 (300pg / µ l)</td>
			<td>S5 (600pg / µ l)</td>
			<td>S6 (1200pg / µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 protein(1200pg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>무료 BSA igG (4pg / µ l)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 표준 단백질 곡선에 대 한 희석 체계입니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg / µ l)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µ l)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µ l)</td>
			<td>X4 (1µg / µ l)</td>
			<td>X5 (2µg / µ l)</td>
			<td>X6 (4 µ g / µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>무료 BSA(4µg/µl) igG</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. 준비 된 샘플에 대 한 희석 체계
<ol start="6"><li>5 분 동안 85 ° C에 혼합물이 열.</li>
</ol>4입니다. QDB 분석의 과정
<ol><li>
샘플 응용 프로그램
	<ol>
<li>테이블의 표면을 접시의 바닥을 피하기 위해 QDB 접시를 지원 합니다. 예를 들어, 빈 피 펫 팁 상자를 사용 하 여 지원.</li>
		<li>QDB 플레이트의 개별 단위의 맨 아래에 막의 중심을 샘플의 최대 2 µ L을 로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
접시 건조
	<ol>
<li>룸 온대 (RT)에서 1 시간에 대 한 로드 QDB 접시를 두고 또는 환기가 공간에서 15 분 동안 37 ° C에서 로드 된 접시 안으로 두고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
접시를 차단
	<ol>
<li>전송 버퍼 (0.039 M 글리신, 0.048 M Tris 0.37 %SDS, 20% 메 틸 알콜)에 QDB 접시를 찍어와 부드럽게 흔들어 10 접시 s.</li>
		<li>린스 부드럽게 TBST 가진 QDB 플레이트 (식 염 수, 0.1 %Tris 버퍼 트윈 20) 세 번 및 다음 세척 일정 떨고 아래 TBST에 5 분 동안 접시.</li>
		<li>QDB 플레이트 블로킹 버퍼와 차단 (TBST에 5% 탈지 우유 (100 µ L/잘) 상수 떨고 아래 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차적인 항 체 외피
	<ol>
<li>(1: 1:5 000 500)에서 선택한 농도에서 블로킹 버퍼에 1 차적인 항 체를 희석 하 고 일반 96 잘 접시의 각 개별 음을 100 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시에 QDB 플레이트를 삽입 하 고 결합된 플레이트 RT 또는 하룻밤 상수 떨고 아래 4 ° C에서 2 시간에 대 한 중 하나를 품 어.</li>
		<li>또는 QDB 접시, 상자 안에 놓고 전체 접시 같은 항 체를 사용 하는 경우 블로킹 버퍼 판의 막 부분 위에 2 ~ 3 mm와 상자를 작성 합니다. 선택한 농도에서 1 차적인 항 체를 추가 하 고 접시 RT 또는 하룻밤 상수 떨고 아래 여 4 ° C에서 2 시간에 대 한 중 하나를 품 어.</li>
		<li>세 번, 일정 떨고 아래 5 분 동안 각 시간에 대 한 TBST를 가진 씻어 전에 세 번에 대 한 부드럽게 TBST 가진 접시를 헹 구 십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 차 항 체 외피
	<ol>
<li>2 차 항 체 (1:1, 000 1:50, 000에)에서 선택한 농도 및 중 aliquot 100 µ L/잘 차단 버퍼에 96 잘 접시 또는 4.4.2, 단원의 설명 대로 상자에 희석 하 고 중 하나 내부 QDB 접시를 로드 96 잘 pla 품 어 테 나 상수 떨고 아래 RT에 1 시간에 대 한 상자.</li>
		<li>QDB 플레이트 부드럽게 3 회로 씻어 TBST, 다음 3 시간, 5 분 각 TBST 가진 지속적인 떨고 아래 접시를 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량화
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 향상 된 화학 기판 (ECL)를 준비 합니다.</li>
		<li>96 잘 접시 (100 µ L/잘) 및 삽입 일정 떨고 아래 2 분 96 잘 접시 안에 QDB 플레이트 aliquot ECL 기판.</li>
		<li>96 잘 접시를 짧게 과잉 액체를 제거 하는 쉐이크 QDB 플레이트를 제거 합니다. 흰색 결정 접시에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>켜고 microplate 리더 microplate 리더 정량화에 대 한 내부 결합된 플레이트 (QDB 플레이트 + 화이트 플레이트 어댑터)를 배치 하기 전에 사용자 인터페이스에서 "커버 플레이트"를 선택 합니다. 참고: 사용 하 여 흰색, 투명 하지 않은 결정 플레이트 어댑터로 접시에서 어떤 방해를 피하기 위해 있는지 확인 합니다. "커버 플레이트"를 선택할 수 있는지 확인 기계 결합 될 때 방해를 피하기 위해 번호판 (QDB 플레이트 + 96 잘 접시 어댑터) microplate 리더 안에 배치 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li>
<li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29.+Quantitative+assay+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22G.+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li>
<li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen%2C+immunoglobulin+G%2C+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li>
<li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li>
<li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+array%3A+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li>
<li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot+blot+analysis+%28QDB%29%2C+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li>
</ol>

Yunyun 장, 백 장 Jiandi 장 작가이 문서에서 사용 되는 QDB 접시를 생성 하는 Zestern Biotechniques의 직원이 있습니다. 백 장 및 Yunyun 장 관심의 충돌을 선언 하 고 Jiandi 장 특허 출원을 제기 했다. 다른 사람 없는 경쟁 관심사 주장 한다.

모든 현재 사용 가능한 immunoassay의 기술을 ELISA 제외한 단백질 분석, 중 QDB 분석 높은 처리량 형태로 휴대 및 조직 수준에서 특정 단백질의 절대 콘텐츠를 달성 하는 유일한 방법입니다. 안정 동위 원소 분류 표준, 질량 분석은 몇 가지 단백질의 절대 정량화를 얻을 수 있다, 하지만이 메서드는 아직 높은 처리량 성능을 위해 설계 되지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 CAPG 단백질 수준 마우스 조직 신장, 비장, 전립선 등의 절대적인 결정을 달성 하기 위해 QDB 분석의 과정 시연. CAPG 레벨 360을 200 pg/g 마우스 신장 조직에, 460 650 pg/g 마우스 spleens, 및 330 390 pg/g 마우스 전립선 조직에 사이 발견 됐다.
ELISA에 비해, QDB 분석 일반 실험실에서 개발 최소 노력을 요구 한다. 첫째, QDB 격판덮개는 ELISA에 코팅 단계를 제거 하는 니트로 막에 따라 이다. 둘째, QDB 분석만 대신 샌드위치 ELISA에에서 두 개의 특정 항 체 하나가 필요합니다. 셋째, ELISA 격판덮개 표면에 비해 니트로 막의 높은 바인딩 용량 또한 막을 배경 간섭을 줄이기 위해 immunoblot 분석에서 일반적으로 사용 되는 엄격한 세척 단계를 견딜 수 있습니다. 이 기능은 세포와 조직에서 준비 하는 복잡 한 lysates 분석에 매우 유용 합니다. 반면, ELISA 격판덮개의 상대적으로 낮은 바인딩 용량으로 인해 복잡 한 세포와 조직 lysates를 분석할 때 백그라운드의 감소 발달 과정에서 진정한 도전이 된다.
QDB 분석 특정 항 체의 액세스와 모든 실험실에서 쉽게 채택 될 수 있다. 그러나, 그것은 항 체의 특이성 종, 조직 유형 및 종류를 포함 하 여 요인에 의해 제한 된 상대적인 용어는 언급 하는 것이 중요. 그림 1A같이 CAPG 항 체 특정 마우스 신장, 비장, 그리고 전립선, lysate를 분석할 때 이며 아직 때 일반적인 마우스 간 분석. 사실, 우리는 정기적으로 다른 조직 유형 동일한 종에서 특정 한 조직 유형, 하지만 항상 특정 수 한 항 체를 발견. 따라서, 이전 서쪽 오 점 분석은 QDB 분석의 특이성을 확인 해야 합니다. 사실, 상대 특이성 항 체의 제조 회사 보낸 수 있습니다. 얼마나 많은 노력이 아무리 분석 결과, 특이성을 보장 하기 위해 그들은 수 없습니다 배출 가능한 모든으로 종종 ELISA 분석, 연관 false 결과의 원인이 있을 수 있습니다. 샘플 사용자 유형의 분석 ELISA 제품을 사용 하 여 선택할 수 있습니다.
모든 immunoassays과 마찬가지로 QDB 분석 방법으로 잠재적인 문제는 상업 항 체의 품질의 일관성의 부족 이다. 경우에 같은 항 체의 명백한 품질 회사 (동일한 카탈로그 번호, 등) 사용 하는, 일괄 배치 다양성으로 인해 다른 한 구매에서 큰 차이가 있을 수 있습니다. 따라서, 사용할 수 있는 항 체의 질에 완전 한 자신감을 얻을 하지 않는 한 모든 구매 시 항 체를 다시 특성화이 중요 합니다.
요약, 제공 여기 상세한 프로토콜 예를 들어 조직 수준에서 특정 단백질의 절대 양적 결정 달성 하기 위해 QDB 분석 메서드를 사용할 때. 우리는 QDB 분석 방법은 높은 처리량, 양적 immunoblot 분석에에서 관심이 있는 사람에 대 한 편리한 도구 임을 보여줍니다. 셀룰러 및 조직 수준에서 특정 단백질의 내용의 절대 결정을 달성 하는 능력 또한 전통적인 immunoblot 기법에서이 기법을 구별. 이 기능은 여러 분석, 특히 더 큰 인구 연구에에서 필요한 단계를 가까운 장래에 관련 협회 연구는 단백질 수준에서의 실현 결과의 비교와 조합 수 있습니다.

와 함께 최근 몇 년 동안, 게놈 연구에 흥미 진 진한 발전와 생물 의학 연구 분야 또한 증인 proteomic 연구에 중요 한 발전. 둘 다 게놈 생물학 데이터의 축적을 증가 함께 및 proteomic 수준 인지할 미래에 생물 의학 연구의 초점이 되었다 bioinformatic 공구를 사용 하 여 이러한 데이터를 분석. 따라서, bioinformatical 연구의 성공을 점점 더 나은 품질의 생물 학적 및 생물 의학 연구 커뮤니티에서 데이터에 대 한 수요를 제기, 작업 게놈에서 기술 발전을 통해 달성 될 수 있다 및 proteomic 수준.
질량 분석 (MS)와 immunoblot 분석 단백질 분석의 두 가지 일반적인 기술을 현재 있습니다. MS는 동시에 개별 단백질의 수천의 분석을 가능 하 게 최근 몇 년 동안에서 proteomic 연구를 지배 했다. Immunoblot 기반 기술을, 포함 서쪽 오 점 및 점 오 점, 다른 한편으로, 또한 역할 중요 한 단백질 연구에 그것의 발명1,2,,34, 이후도 5. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)5,,67 와 역 위상 단백질 microarray (RPPM)8,9 immunoblot의 높은 처리량 형식으로 간주 될 수 있습니다. 분석입니다. 그러나, ELISA, 제외 하 고 이러한 모든 immunoassay 방법을 특정 단백질의 상대적 식 수준을 측정합니다. 분석 여러 분석을 통해 풀 크기를 증가 시키는 어떤 노력 든 지 방지를 동시에 수행 되어야 합니다 이러한 방법의 상대적인 자연 인구 연구에 대 한 진짜 문제가 될 것입니다. 또한, 이러한 연구에서 파생 된 결과 반 정량, 따라서 데이터 분석에서 어떤 생물 정보학의 노력을 복잡 하 게만. 한편, ELISA는 높은 처리량 절대 분석 단백질 견본을 위한 적합,이 기술은 낮은 바인딩 용량 및 멀티플렉싱10세포 또는 조직 같은 복잡 한 환경에서 과제를 충족 것으로 보인다.
우리 단백질 함량의 절대 측정에 적합 하 고 양적, 편리 하 고, 높은 처리량의 주요 특성을 가진 인구 연구에 적합 한 immunoblot 방법을 개발 하 고 명명 된이 기술은 양적 점 오 점 분석 (QDB)11. 이 연구에서 우리는 QDB 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 특정 단백질의, CAPG, 신장, 비장, 전립선 등 세 가지 다른 마우스 조직에 절대 단백질 함량을 결정 하 여 메서드를 보여 줍니다. 우리가 생각 하는이 상세한 프로토콜을 잘 타당성과이 방법의 설명이 방법의 연습에서 잠재적인 함정을 피하기 위해 하는 방법에 지침을 제공 하 고.

<table><tbody><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>Tecan Infinite 200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>QDB 플레이트</td><td>Yantai Zestern Co.Ltd</td><td></td><td>플레이트는 이메일 또는 방문 www.zestern.net 를 통해 확인 목적으로 요청 시 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure 당나귀 안티-래빗 IgG (H+L) (최소 X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td><td>잭슨</td><td>&nbsp; 711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>향상된 화학발광 기판</td><td>Thermo</td><td>32134</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CAPG&nbsp;</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-T52</td><td></td></tr><tr><td>CAPG 단백질</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-HNAE</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Tianjin Ruiji Jin Special Chemical Co., Ltd</td><td>10461220</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl2</td><td>Tianjin Zhiyuan 화학 시약 Co., Ltd</td><td>20120802</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>BNN1913</td><td></td></tr><tr><td>Na2P2O7</td><td>하이투오 한의학 검사</td><td>20160914</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>시그마</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴</td><td>시그마</td><td>Z290033</td><td></td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>시그마</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>시그마</td><td>A3428</td><td></td></tr><tr><td>트리스 HCL</td><td>시그마</td><td>T6455</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마</td><td>L5750-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>브롬페놀 블루</td><td>시그마</td><td>B-0126</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>시그마</td><td>S7920</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (qdb)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

세포 및 조직 수준에서 특정 단백질의 내용의 절대 결심을 위한 양적, 높은 처리량 immunoblot 방법은 크게 proteomic 연구에서 진행 지장을 초래할 수는 편리한 부족. 현재 사용 가능한 immunoblot 기법에서 파생 된 결과 상대, 대규모 분석 단백질 견본을 가진 독립적인 연구를 결합 하는 어떤 노력 든 지 방지도 있습니다. 이 연구에서 양적 점 오 점 분석 (QDB) 높은 처리량 형태로 절대 정량화를 달성 하기의 과정을 설명 합니다. 우리는 상한 걸 단백질, 단백질 견본 함께 상세한 3 다른 마우스 조직 (신장, 비장, 그리고 전립선)에서 준비에 gelsolin 같은 (CAPG)의 절대 콘텐츠를 확인할 수 있습니다 상용 단백질 표준을 사용 하 여, 실험 내용을 설명. 우리는 세포와 조직 수준에서 개별 단백질의 절대 정량화의 편리 하 고, 양적, 높은 처리량 immunoblot 방법으로 QDB 분석을 제안합니다. 이 방법은 바이오 마커 검증 및 생물 학적 및 생물 의학 연구의 다양 한 분야에서 경로 확인에 실질적으로 도움이 됩니다.

마우스 조직에서 CAPG 단백질을 포함 하 여 어떤 단백질의 절대 금액의 결정 기준으로 특정 항 체와 순화 된 단백질을 요구 한다. 표준 단백질 및는 lysates의 분석의 선형 범위는 또한 대규모 분석 전에 설립 될 필요가 있다. 선형의 범위 항 체는 항 체에 상당히 의존 라기보다, 고 특정 항 체의 적절 한 희석 범위 각 개별 사용자에 의해 확인 될 필요가 있다.
우리는 먼저 비장 및 전립선 조직 부정적인 제어 (IgG 무료 BSA)와 긍정적인 제어 (상용 CAPG 단백질) 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 마우스 신장에서 CAPG 항 체의 특이성을 결정 (그림 1A). 안티-CAPG 항 체 lysates 마우스 비장, 심장, 근육, 및 전립선 (한 밴드 감지)에 대 한 특정 했다. 비 특정 밴드에서 신장과 간 lysates에서 관찰 되었다. 그러나, lysate 신장, 일반적인 밴드는 항 체는 신장 조직 분석에 적합 제안 특정 밴드 보다 훨씬 약한 했다. 다음, 분석 lysates의 양과 표준 단백질의 선형 범위 두 나란히 복용량 곡선에 의해 결정 되었다. 우리의 과거의 경험, 그리고 조직 lysates의 마우스 신장에 따라 표 1 에 표시 된 대로 상용 CAPG 단백질 희석 직렬로 했다, 비장 및 전립선 결정 lysates의 총 단백질의 금액에 따라 또한 희석 했다 의해 BCA 총 단백질 결정 키트. 2 개의 복용량 연구 병행 하 여 수행 되었고 그림 1B에 함께 꾸몄다. 마우스 신장, 비장 및 전립선의 lysates의 적절 한 금액은 임의의 단위로 microplate 리더에 의해 측정 하는 QDB 신호에 따라 선정 됐다. 이 실험에 대 한 원래 읽기 표 3에 표시 됩니다.
마지막 단계에서 연속적으로 희석된 CAPG 단백질 표준 마우스 신장에서 lysates, 비장 및 전립선 QDB 격판덮개에 로드 되었습니다. 이 경우에, 우리 하기로 부하 0.3 µ g/샘플 lysates 마우스 신장과 비장 및 1 µ g/샘플 마우스 prostates 분석에서 lysates 되면서 이러한 수준 QDB 읽기에 적어도 20-fold 분석의 선형 범위 내에서 잘 동안 배경 위에 lysates의 단백질 표준 복용량 곡선을 기반으로 합니다. 접시는 접시 microplate 리더에 의해 직접 계량은 전에 설명된 QDB 프로토콜을 복종 되었다. 순차적으로 희석된 순화 CAPG 단백질을 사용 하 여, 우리 설정할 수 복용량 응답 곡선, 방정식, 및 R2 사용할 수 있는 소프트웨어 (예: Microsoft office excel)를 사용 하 여 단순 회귀 분석에 의해. Spleens, prostates 설립된 방정식을 사용 하 여 이러한 lysates의 CAPG 단백질의 절대 금액으로 변환 되었습니다 lysates의 마우스 신장에서 신호는 QDB 및 결과 총 단백질 양에 의해,이 경우에, 0.3 µ g에서 lysates에 대 한 수정 했다 마우스 spleens 및 신장, 1 µ g lysates pg / µ g으로 이러한 조직에 CAPG 단백질의 최종 농도 대 한 마우스 prostates에서에 대 한. 결과 그림 1C 에서처럼 원래 읽기와 표시 됩니다 표 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> 그림 1 . 3 마우스 조직 (신장, 비장, 전립선)에 절대 CAPG 수준을 결정 하는 QDB 분석의 대표적인 결과입니다. A. 마우스 조직 lysates 비장에서 준비를 사용 하 여 토끼 안티-CAPG 항 체의 특이성을 검사, 심장, 근육, 신장, 간, 그리고 서 부를 사용 하 여 전립선 오 점 부정적인 제어 (IgG 무료 BSA)와 긍정적인 제어 분석 (상업적으로 사용 가능한 CAPG 단백질)입니다. B. lysates 전립선에서 준비를 사용 하 여 토끼 안티-CAPG 항 체의 선형 QDB 분석 정의 신장, 비장, 그리고를 사용 하 여 재조합 표준 CAPG 단백질 정화. 결과 triplicates의 평균 했다입니다. C. 절대 결정의 CAPG 수준 lysates 마우스 신장, spleens, 및 prostates에서 준비. 각 막대는 개별 마우스에서 한 조직을 나타냅니다. 결과 3 중의 평균 했다입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> 표 3: 복용량 연구 직렬로 희석, 둘 다를 사용 하 여 마우스 spleens, 신장, 그리고 prostates 및 순화 된 재조합 CAPG 단백질에서 풀링된 lysates의 microplate 리더에서 유래한 다.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
표 4: 마우스 신장 (8), spleens (4), prostates (5) 표준으로 재조합 CAPG 단백질을 사용 하 여 절대 CAPG 레벨의 QDB 분석의 microplate 리더에서 결과.

여기 설명 양적 점 오 점 분석 (QDB)의 상세한 과정 대상된 단백질의 절대 내용을 확인 하 여 상한 걸 단백질, 3 개의 다른 마우스 조직에서 gelsolin 같은 (CAPG), 합니다. 높은 처리량, 세포 및 조직 수준에서 바이오 마커 검증에 대 한 편리 하 고, 양적 immunoblot 기술을 설명합니다.

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

이 방법은 현재 연구실과 임상 진단 분야에서 표준인 세포 및 조직 수준에서 단백질 함량의 전통적인 상대적 반정량적 정량화와 거리를 두기 위해 조직 수준에서 ELISA라고 불릴 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 high-throughput, quantitative 및 absolute의 세 단어로 설명할 수 있습니다. 다른 단어를 덧붙이자면, 간단할 것입니다.이 기술의 의미는 단백질체학 분야로 확장되는 반면 바이오마커의 검증은 고처리량 형식으로 달성할 수 있습니다. 이 방법은 연구 및 임상 분야 전반에 걸쳐 광범위하게 적용됩니다. 세포 및 조직 수준에서 단백질 양의 정량화는 현재로서는 여전히 원시적입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이 기술을 배우는 데 문제가 없으며 매우 기본적이며 수행하는 데 최소한의 실험실 기술이 필요합니다. 우리는 동물 모델을 사용하여 기술의 신뢰성, 단순성 및 정확성을 입증하게 되어 기쁩니다. 샘플은 MP40 또는 Triton과 같은 세제의 유무에 관계없이 연구실에서 일반적으로 사용되는 모든 용해 버퍼를 사용하여 기존의 샘플 준비 방법으로 준비할 수 X.In 당사의 경우 Triton X 용해 버퍼를 사용합니다.1.5ml 튜브에 5-100mg의 조직 조각을 넣는다. 다음으로, 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제가 보충된 200마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로, 얼음 위에서 1분 동안 균질화기로 조직을 균질화합니다.다음 8, 4 섭씨 온도에 g 곱하기 10 분 동안 표본을 분리기하십시오. 상층액을 새 튜브에 모으고 BCA 분석과 같은 단백질 측정 키트를 사용하여 단백질 용해물의 총 단백질 양을 측정하기 위해 1마이크로리터를 꺼냅니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 다음 마이크로플레이트 리더에서 562나노미터의 흡광도를 측정합니다.이 단계에서는, 표준으로 알려진 농도를 가진 재조합형 단백질을 사용하여, 12의 농도, 원액으로 마이크로리터 당 000 피코그램의 농도로 단백질을 묽게 하십시오. 한편, 준비된 샘플 용해물을 마이크로리터당 4마이크로그램으로 희석합니다. 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 개별 샘플 간의 차이를 방지하기 위해 샘플 용해물을 혼합하여 사용하는 것이 좋습니다.일반적인 용량 연구를 위해 표준 단백질과 준비된 샘플을 모두 연속적으로 희석합니다. BSA는 각 샘플에 대해 거의 동일한 양의 단백질이 적재되도록 보충되었습니다. 그 후, 10마이크로리터의 연속으로 희석된 표준 단백질 또는 샘플 용해물을 10마이크로리터의 2X 로딩 버퍼와 혼합합니다.그런 다음 혼합물을 섭씨 85도에서 5분 동안 가열합니다. 이 절차에서는 플레이트의 바닥이 테이블 표면에 닿지 않도록 QDB 플레이트 아래에 빈 피펫 팁 상자를 놓습니다. 최대 2마이크로리터의 샘플을 QDB 플레이트의 개별 장치 하단에 있는 멤브레인 중앙에 로드합니다.적재하는 동안 QDB 플레이트의 바닥이 표면에 닿지 않도록 하고 개별 우물에 너무 많이 적재하지 마십시오. 우리의 경험에 따르면 우물당 4마이크로리터를 넘지 않습니다. 다음으로, 적재된 QDB 플레이트를 실온에서 1시간 동안 그대로 두거나 환기가 잘 되는 공간에서 섭씨 37도에서 15분 동안 적재된 상태로 두십시오.플레이트를 막으려면 QDB 플레이트를 전송 버퍼에 담그고 10초 동안 부드럽게 흔듭니다. 그 후, TBST로 QDB 플레이트를 부드럽게 세 번 헹군 다음 TBST에서 5분 동안 지속적으로 흔들면서 플레이트를 세척합니다. 그 후, 지속적인 흔들림으로 1시간 동안 차단 버퍼로 QDB 플레이트를 차단합니다.이제 차단 버퍼의 1차 항체를 선택한 농도로 희석하고 100마이크로리터를 일반 96웰 플레이트의 각 개별 웰에 추가합니다. QDB 플레이트를 96웰 플레이트에 삽입하고 결합된 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 지속적으로 흔들어 배양합니다. 그 후, TBST로 플레이트를 세 번 부드럽게 헹구고 TBST로 세 번 씻으십시오.다음으로, 선택한 농도의 차단 완충액에 있는 2차 항체를 희석하고 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다. 그런 다음 로드된 96웰 플레이트 내부의 QDB 플레이트를 실온에서 일정한 쉐이킹으로 1시간 동안 배양합니다. TBST로 QDB 플레이트를 세 번 부드럽게 헹군 다음 TBST로 5분씩 계속 흔들면서 플레이트를 세 번 세척합니다.정량화를 위해 ECL 기질을 준비하고 웰당 100마이크로리터의 96웰 플레이트로 분취합니다. 그런 다음 QDB 플레이트를 96웰 플레이트 내부에 2분 동안 계속 흔들어 삽입합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 QDB 플레이트를 제거하고 짧게 흔들어 여분의 액체를 제거합니다.그런 다음 플레이트를 흰색 마이크로타이터 플레이트에 놓습니다. 다음으로, 정량화를 위해 결합된 플레이트를 마이크로플레이트 리더 내부에 배치하기 전에 마이크로플레이트 리더를 켜고 사용자 인터페이스에서 덮개가 있는 플레이트를 선택합니다. 실수를 방지하기 위해 덮개가 있는 플레이트를 선택해야 합니다.이 그림은 웨스턴 블롯 분석을 통해 비장, 심장, 근육, 신장, 간 및 전립선에서 준비한 마우스 조직 용해물을 사용하여 토끼 항-CAPG 항체의 특이성을 보여줍니다. 전립선, 신장, 비장에서 준비된 용해물을 사용하고 정제된 재조합 CAPG 단백질 표준물질을 사용하여 토끼 항 CAPG 항체의 QDB 분석의 선형 범위를 정의했습니다. 결과는 평균 3배였습니다.그리고 여기에 표시된 것은 쥐의 신장, 비장 및 전립선에서 준비된 용해물에서 CAPG 수치의 절대 측정입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 4시간에서 24시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 절차에 대해 미리 결정된 특정 항체를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 세포 또는 조직 수준에서 개별 단백질 함량의 절대 측정을 통해서만 달성할 수 있는 추가 질문에 답하기 위해 생물 통계 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 이후 이 기술은 단백질체학 연구 분야의 연구자들이 인구 수준에서 다양한 질병과 단백질 바이오마커의 추정 관계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고처리량 형식으로 QDB 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.사람이나 동물의 조직으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

이 동영상은 조직 샘플에서 관심 단백질의 절대 정량화를 위한 정량적 점 블롯(QDB) 기술을 보여줍니다. 샘플의 단백질은 QDB 플레이트의 웰 내부에 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 고정되어 있습니다. 과산화효소(peroxidase enzyme)로 표지된 표적 단백질 특이적 항체를 활용하여 화학발광 기질을 산화시켜 빛을 생성하고, 이 광을 측정하여 시료의 단백질 농도를 측정합니다.

조직 용해물에서 표적 단백질을 추정하기 위한 정량적 점 블롯

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문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

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