Name: 효율적인된 3D 소 뇌 분화 프로토콜 옵션 2D 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 학습하세요 hPSC를 이용한 3D 소뇌 분화 프로토콜로 신경줄기세포에서 소뇌 세포 계통을 생성하는 방법을 배우세요. 이 기술은 어린 시절 뇌 질환 연구에 활용됩니다.

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우리는 Gerbren 제이콥스와 Jurjen Broeke Prisca 리사 Gasparotto 생성 및 두 개의 제어 iPSC 라인의 특성을 보여주는 우리의 절차에 대 한 기여에 대 한 Leferink를 그들의 전문 기술 지원에 대 한 감사.

<ol><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

복잡성 및 비용 요인이 관련 줄기 세포 연구자 선택 또는 분화 프로토콜을 개발 하는 경우입니다. 그것은 얼마나 많은 외부 컨트롤 원하는 세포 유형, 생성 하는 데 필요한의 미결 문제 이것은 특히 사실 이다 또는-다르게 포즈-얼마나 유능한 hPSCs 생산 하는 그들의 자신의 개발 환경에 두고 자신에 게 충분 한 경우 영양소입니다. 체 외에 외적 요인의 소개 아주 잘 원하는 셀 제품을 생산할 수 있습니다 하지만 그들은 또한 방해 수 내장 발달 용량 세포 vivo에서전시는 것 이다. 그런 고려는 목표는 질병 모델링 환자 파생 Ipsc의 사용 하는 경우에 특히 중요 하다. 패턴화 성장 요인의 광범위 한 사용 질병 고기 마스크 수 있습니다. 이 보고서에 대 한 자세한 프로토콜 복잡성, 비용, 또는 모방 하는 외부 요인8,9의 사용을 줄이기 위해 이전 연구의 추세에 따라.
그것은 이전 연구 다 vivo에서 조건 재현 공동된 노력 없이 소 뇌 운명 향해 차별화를 달성 하는 것은 나타납니다 보고 Muguruma 그 외 여러분, 그리고 우리 자신의 최근 연구 결과 바탕으로, 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. 흥미로운 점은 두 연구 모두 사용 FGF2 어느 설정 필요, 했다 제안 성장 요인의 다른 세트를 사용. 우리 도망 추가 테스트, 어디 FGFs 선택적으로 프로토콜을에서 제외 되었고 셀 외부 FGFs10없이 동일한 제품을 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 우리의 연구 간의 차이 사실 우리가 다른 hPSC 라인과 문화 방법을 사용, RA, 신경 감 별 법을 유도 하 고과 립 세포 생존과 성숙 (BDNF GDNF, SAG, KCL)을 지 원하는 구성 요소를 포함 하 여 한정 했다11 -14. 또한, Muguruma 그 외 여러분에 비해 덜 복잡 한 시작 방법 채택 되었다. 그들의 프로토콜 96WPs, 그들에 게 서로 다른 물리적 및 화학적 절연에 균일 한 EBs를 생성 하 여 시작 했다. 여기에 프로토콜 모든 PSCs 상대적으로 EB 형성, 자유롭게 상호 작용 하도록 허용 하는 동안 6WPs에서 함께 혼잡 했다. 어떻게이 수 있습니다. 차동 영향을 EBs와 나중에 organoids (를 포함 하 여 신호 화합물의 본질적인 생산)의 물리적, 화학적 환경 알, 그리고 탐험 될 수 있습니다. 또한, 우리의 식을 표시 하는 동안 유전자 연관-그래서의 암시-형태학 상으로 비슷한 구조 내에 있는 소 뇌 근원 보고 Muguruma 그 외 여러분, 우리 제외할 수 없습니다 같은 신경의 구조는 소 뇌 비 정체성의 있습니다. 미래 연구, Muguruma 그 외 여러분 보고 그 같은 항 체의 대형 패널을 사용 하 여 (즉, ATOH1, CALB, 등) 같은 할당 및 비교 더 결정적인 두 프로토콜의 제품을 만들 것입니다.
3D 프로토콜 내에서 중요 한 시작 이며 셀 문화 분석에 대 한 최종 제품의 충분 한 숫자를 보장 하기에 충분 한 수를 유지 합니다. EBs/잘 문화 (그림 1)에서 첫 3 일 동안 500 이상 부터는 감안할 때 상당한 죽는 일찍 프로토콜, 좋습니다. 이 hPSCs 지류 무료 문화에 대 한 주어진된 식민지 크기를 달성 하기 어려울 수 없습니다 하지만 여전히 급지대 종속 방법을 사용 하 여 그에 대 한 쉽지 않을 수도 있습니다. 셀의 많은 수를 감안할 때, 매체 (pH 변화를 나타내는), 그리고 죽은 세포의 축적에서 색상 변경에 대 한 감시에 중요 하다. 두 문화권의 붕괴를 방지 하기 위해 수정 해야 합니다. 도 있을 수 있습니다 셀 및 집계의 응집으로 대규모 구조. 비록 아직도 분석 될 수 있다 집계 될 수도, 제품 수량 줄어들 것입니다 크게, 그래서 부드러운 분쇄와 작은 집계에 그들을 깨는 유용할 수 있습니다. 그러나, 방해 일반 집계를 피하기는 스스로 성장할 수 있는 큰 크기 (그림 4). 집계 될 경우 너무 스파스, 집계는 완전히 격리 된 있도록 웰 스를 결합 하는 것이 좋습니다. 제품 다양성 (숫자, 크기 및 형태)은 3 차원 세포 배양, 덜 복잡 한 시작 프로시저 (예: 여기에 설명 된 프로토콜 절연, 균일 한 EB 형성 단계, 제안 하는 시작 하는 이러한 프로토콜에 대 한 포함 한 잘 알려진 문제 ) 더 실용적인8,15수. 이 연구자 명심, 특히 분석, 중 필요가 뭔가 보고 프로토콜 제품 다른 3D 프로토콜8,,915에서 발견 된 일치를 생성. 크기와 형태에 따라, 그들은을 신경 근 엽의 범위 안에 대뇌 organoid Kelava 및 랭 커스터15, 회전 타원 체의 분류를 피팅 하는 가장 최근의 리뷰에 설명 된 대로. 특히 주목할 만한 3D 구조의 존재를 루멘, (하위) 심 실 영역와 마름모꼴-입술 기능 같은 신경 근 엽의 암시는 (그림 5 와 그림 6) 구분으로 다른 그룹8 , 15 , 16 , 17. 모든 실험에서 이상 생산 이후 putative VZ/SVZs와 소 뇌 관련 마커 (ZIC1, KIRREL2), 집계 그는 RL 같은 우리의 프로토콜을 사용 하 여 3D 차별화의 성공 결정을 위한 유용한 기준 추가 지원을 제공 하는 기능. 과거 35 일 문화의 길이 연장 하지 테스트, 하지만, 복잡성, 성장과 성숙이이 기술에 의해 허용의 최대 범위를 결정 하 추진 수 있습니다.
2D 프로토콜 3D 프로토콜로 같은 비 부착 EB 형성 및 신경 유도 과정을 사용 하 고 그래서 위의 코멘트에도 적용. 도금, 일단 고려의 다른 세트는 고려 되어야 한다. EBs는 접시에 바깥쪽에 셀에 대 한 신속 하 게 준수 해야 합니다. 준수, RI (해당 되는 경우 이미 사용)의 추가 문제가 매체의 볼륨 감소 또는 PLO/램 농도 실험 변경 적용 될 수 있습니다 경우. 세포 성장에서 너무 조밀한 또는 스파스 (20-80 %confluency 사이 성장 선호)로 유지 하는 것이 중요 하다 우물; 일일 모니터링 및 적시 뿌리고 오버-confluency 또는 부동 셀을 피하기 위해 중요 하다. 3D 프로토콜 달리 거기 해서는 안됩니다 상당한 죽는 문화 중의 가난한 성장, 지역 또는 확산 속도 둔화 될 수 있습니다. 뿌리고 (예: 셀 프로세스와 셀 사이의 개발된 네트워크 제거) 세포의 성숙 상태에 영향을 하 고 포인트 셀을 수집 것 이다 또는 어떤 방식으로 분석 접근 하는 때 염두에 보관 해야 합니다. 예를 들어 칼슘에 대 한 그것을 이미징 분석 2-6 일전 사이 통로 세포에 매우 중요 하다. 너무 가까이 뿌리고 분석 셀에 연결 하는 시간이 없 또는 성숙, 그리고 너무 멀리 셀과 밀, 이미징 어렵게 될 수 있습니다 의미할 수 있습니다. 실험 사이 변이 있을 수 있지만 결과 그 초기 2D 소 뇌 프로토콜1,2보고와 일치. ICC 얼룩 및 유전자 표정 분석 또한 식별 하는 표식 (그림 7 , 그림 8) 다른 신경 및 소 뇌 id와 관련 된과 립 세포 마커 ZIC1에 대 한 긍정적인 세포의 존재를 확증. 칼슘 이미징, 세포 fluor5 염료와 incubated의 전기 자극을 포함, 기능 신경 활동 (그림 9, 보충 그림 1, 그림 2 보충), 표시는 확인 되지 않고 있지만 이러한 과 립 세포를 했다. 그것은 arguable 함으로써 세포 더 많은 시간 과거 35 일 문화의 길이 확장 하 여 성숙, 기능 신경 활동의 양을 증가 한다. 이 잠재적인 나중에 탐험 수 있습니다.
위에 제안 하는 연구의 라인 이외 것 제품 id (수량 및 품질) 차이 결정 하는 관심의 2D 및 3D 프로토콜 사이. 외부 FGFs의 중요성은 2D 프로토콜에서 테스트 하지 및 알고 도움이 될 것 이라고 후 도금, 3 차원 구조의 부족 그리고 그래서 관련된 신호 경로 만들 것 이다 2D 문화 다소 일찍 화합물을 패턴화에 의존. 축소 된 기본 프로토콜 (예, RA, BDNF SAG)은 동등 하 게 그럴듯한 추가 조사에 대 한 됩니다. 마지막으로, 미래의 연구는 새로운 연구 및 도구를 더 나은 특성 (발전 효율의 평가)에서 유익할 수 있습니다 특정 인간 소 뇌 신경 하위.
마음에 주어진된 주의 둘 다 보고 프로토콜 소 뇌 차별점, 다른 목적에 적합 한 제품으로 사용 될 수 있습니다. 그들은 셀 라인 같은 차별점 또는 타겟된 신경 감 별 법의 다른 유형에 대 한 기본 모델의 생존 능력을 테스트, 파일럿 연구를 수행 연구원에 대 한 실질적인 출발점으로 봉사 할지도 모른다.

처음 소 뇌 혈통으로 hPSCs를 차별화 하는 데 체 외에서 프로토콜 vivo에서 소 뇌 개발1,2,,34를 흉내 낸의 원리에 운영 한다. 이와 같이, 그들은 프로-소 뇌 패턴 및 성숙에 특정 시간에 도입 요인의 승계 요구. 이러한 가운데 최고 morphogenetic 단백질 (BMPs), 그리고 섬유 아 세포 성장 인자 (FGFs) 중간 hindbrain 개발 및 isthmic 주최자5,,67의 형성에서 알려진된 역할 뼈 WNT, 했다. 물론, 각 추가 단계 및 요소는 연구원에 대 한 노동 집약적인 조작 및 큰 비용의 증가 의미 하 고 그래서 동등한 결과 달성 가능한 간단한 프로토콜 개발 관심입니다. 그들의 개발 시험관같은, 외부 제어를 필요로 하는 셀 든이 실제적인 문제 가상 질문으로 멋지게 dovetails.
소 뇌 차별화, 2015 년에 출판 하는 프로토콜 목적8패턴화 FGF2, FGF19, 및 stromal 세포 파생 요소 1 (SDF1)만 사용 하 여 성장 요인의 광범위 한 번호를 사용 하 여의 필요성을 해결. 이 연구는 또한 자유 롭 뜨 3D 문화 시스템을 사용 하 여 이전 소 뇌 프로토콜에서 달랐다. 소 뇌 표식에 대 한 긍정적인 세포를 생산, 이외에 두뇌 "organoids" 그들의 기술에 의해 생성 된 관련 형태학, 마름모꼴 입술 모양의 구조와 같은 전통적인 2D 단층 문화에서 사용할 수 없는 전시를 표시 했다. 비록 덜 복잡 하 고 비용이 많이 드는 성장 요인, 유니폼 embryoid 몸 (EBs)와 96 잘 접시 (96WPs), 문화 형성 등의 기능에 관하여 했다 절차 복잡 한 초기 단계. 또 다른 3D 프로토콜 같은 해 출판, 일반적이 고 저렴 한 셀 문화 기술9를 사용 하 여 신경 계보에 성공적인 차별화를 보고. 비록이 그룹 소 뇌 차별화 보다 대뇌 피 질의 조사, 소 뇌 차별화에 대 한 그들의 개념의 응용 프로그램 할인 하지 수 없습니다.
우리는 최근 보고 패턴화 요인의 감소 된 수를 사용 하 여 3D 소 뇌 분화 프로토콜 (즉, FGF2, 4, 및 8), 중간 요구 사항10을 최소화 하기 위해 전체 6 잘 플레이트 (6WPs)에서 세포를 유지 하 여 간소화 된 설치 뿐만 아니라. 과 립 세포의 생산을 돕기 위해, 흐려져 주 작동 근 (SAG) 최종 성숙 단계 동안 사용 되었다. SAG 소닉 고슴도치 (쉬), 이전 소 뇌 프로토콜과 립 세포 선구자 (GCPs) vivo에서1,2, 의 성장을 촉진 하는 역할 때문에 사용 했다 보다 적게 비싼 화학 대안입니다 11,,1213. 차별화 제품 형태학 상으로 관련 구조8,9소 뇌 관련 마커의 존재를 포함 하 여 다른 3D 프로토콜에서 그와 일치 했다. 이러한 결과 강화 흉내 상세한 이전 메시지는 vivo에서 의 환경 복잡 한 3 차원 체 외에서 분화 프로토콜에 필요한 않을 수 있습니다.
3D 프로토콜 외에도이 보고서에 설명 합니다 같은 빠른 설치, 기본 재료, 설계 2D 프로토콜 및 성장 요인의 수를 감소. 표식에 대 한 긍정적인 조기와 관련 된, 그것은 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 셀 수 또는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 소 뇌, 신경 및과 립 세포 id. 또한, 칼슘 이미징 기능 인간의 뉴런의 존재를 나타냅니다. 프로토콜 중에서 선택할 수 중 하나에 관심이 연구원에 대 한 유연성의 수준을 추가: (1) 생성 특정 세포 유형, 모델링 (2) 인간의 두뇌 개발 및 구조, (3) 분석 단층에서 최적화 된 관련 설정 (예를 들어, 패치 클램프 기록), 또는 혼합 신경 문화에서 (4) 세포 세포 상호 작용. 그들의 간단 하 고 저가 자연 적합 그들 액세스할 수 연구자의 hPSC 필드에 새로 또는 기본 hPSC 절차에서 더 차별화 옵션 필요 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>글루타민 강화 DMEM/F12</td></tr><tr><td>Neurobasal 배지</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>신경 기본 매체</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴</td><td>시그마</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>일명 폴리-헤마</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 배지 및 보충제</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC 배지 및 보충제</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (ROCK 억제제)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>hPSC-적절한 접착 코팅(PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0.2 um 필터</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>랩 배양 플레이트</td></tr><tr><td>cryotubes</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>트립신 기반 해리제</td></tr><tr><td>정의 트립신 억제제(DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R& D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>뇌 유래 신경 영양 인자</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>신경교 유래 신경 영양 인자</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>신경 영양 Factor 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened Agonist (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Axiovert 40C 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>명시야 이미징 현미경</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>명시야 이미징 - 이미지 획득</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>세포 배양용 원심분리기</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 혈청학 피펫</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청학 피펫</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESC</td><td>WiCELL</td><td></td><td>라인 H01</td></tr></tbody></table>

효율적인된 3d 소 뇌 분화 프로토콜 옵션 2d 수정

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

복잡성과 분화 프로토콜의 비용을 감소 하는 것이 연구자에 대 한 중요 합니다. 이 관심이 모방 하는 외부 요인 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로 두뇌 개발 또는 이상, 질병 표현 형을 마스킹 등의 모델 소개 수 있습니다 가능한 의도 하지 않은 효과 대 한 우려와 맞는. 여기, 우리 hPSCs, 소재 요구 사항 이전 프로토콜 보다 덜 간단한 시작 방법, 적은 패턴 요소와 설계에 대 한 두 개의 소 뇌 분화 프로토콜을 제시. 최근, 우리 문화 절차, 형태학 등 하위/심 실 영역-두뇌 개발 모델링 관련 및 마름모꼴을 포함 한 다른 뇌 "organoid" 프로토콜 일치 부동성 3 차원 (3D) 제품을 생성 하는 개발 입술 모양의 구조입니다. 두 번째 제품 소 뇌 관련 된 표식에 대 한 긍정적인 고 신경 같은 칼슘 유입 전시 기능 소 뇌 신경 세포를 생성할 수 표시 되는 완전 한 차별화를 부착, 2 차원 단층 프로시저를 사용 합니다. 함께, 이러한 프로토콜 테스트 유선형된 신경 차별점의 기본 모델 뿐 아니라 다른 연구 목적에 적합 한 옵션 선택 과학자를 제공 합니다.

감소 된 성장에 대 한 시각적 개요는 2D 및 3D 소 뇌 분화 프로토콜 요소 그림 1 에서는 2D 및 3D 소 뇌 분화 프로토콜에 대 한 전체 일정 외적 요소와 도금의 시간. HPSCs 3D 소 뇌 차별화 진행에 대 한 일반적인 진행 그림 2에 표시: hESC 라인 h01-식민지로 시작 하는 피더 무료 문화에 0에서 (그림의 왼쪽 위); 하루 2 (위 가운데); EB 형성을 겪고 다음 주 14 (오른쪽 위);에서 RA와 FGF8 신경 유도 명백한 루멘과 더 큰 셀 집계로 성장 다양 한 크기와 모양 하루 28 (왼쪽 아래);의 집계를 형성 하루 28 (아래 가운데);에 표시 단일 집계의 다른 구조와 복잡성에 개발 고와 (오른쪽 아래) 하루 35에서 동일한 구조를 형태학 상 변화를 계속 했다. 2D 소 뇌 차별화를 진행 하는 hPSCs에 대 한 일반적인 진행은 그림 3에서 묘사: hESC와 피더 무료 문화 날 0 (hESC 식민지 가운데 차별화 된 셀의 영역을 나타내는 동그라미 그림의 왼쪽 위)에 식민지로 h01-라인 ; 하루 2 (위 가운데); EB 형성을 겪고 다음 날 13 (오른쪽 위);에서 RA와 FGF8 신경 유도 명백한 루멘과 더 큰 셀 집계로 성장 (왼쪽 아래); 주 14에서 도금 후 부착 세포로 확산 그리고 하루 35 낮은 (더 낮은 중간) 및 고배율 (오른쪽 아래)에 더 많은 복잡 한/성숙한 형태를 가진 세포의 단층으로 다음.
3D 제품 전시 마커 및 초기 Neuroepithelium의 구조 그림 2 (아래 왼쪽된 이미지) 그림 4 확률적 병합 뿐 아니라 성장 및 성숙 속도, 변화 또는 집계의 떨어져 깨고 경작을 통해 본 3D 집계 형태가 고. 이에 불구 하 고 각 차별화 immunocytochemistry (ICC) 그림 5에 얼룩으로 소 뇌과 립 마커 ZIC1을 포함 한 초기 신경 및 신경 마커를 전시 하는 집계를 생성 합니다. 더 중요 한 것은, 그림 5 와 그림 6 간단한 3D 문화, 감소 성장 요인, 초기 neuroepithelium 마름모꼴 입술 등 두뇌 개발에 관련 된 복잡 한 구조와 집계를 생성할 수는 건의 한다.
2D 제품 전시 소 뇌 마커 및 기능 신경 활동 2D 문화는 복잡 한 3 차원 구조를 재현할 수 없는, 그들은 ICC 얼룩 그림7에서에 표시 된 대로 소 뇌과 립 세포 마커 ZIC1을 포함 한 초기 신경 및 신경 마커를 전시 하는 세포를 생성할 수 있습니다. RT-PCR을 통해 유전자 표정 분석 그림 8에서 보듯이 비록 초기과 립 세포 마커 ATOH1 의 존재는 변수를 실험과 라인 사이의 ICC 얼룩 결과 지원 합니다. 칼슘 이미징 2D 문화에 더 쉽게 처리 됩니다. 그림 9, 보충 비디오 1및 추가 비디오 2에서 보듯이 전기적 자극된을 세포 신경 발사 패턴, 기능적 뉴런의 생성 제안의 전형적인 칼슘 유입 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> 그림 1: 차별화 프로토콜 (차별화의 하루 0에서 시작)의 타임 라인. 실선 상자는 특정 요소 문화 매체에 추가 하 고 점선 상자 표시 판-코팅 옵션 2D 수정에 대 한 나타냅니다. FGF2, 아래쪽 화살표는 낮은 농도 (4 ng/mL), 참조 및 위쪽 화살표는 높은 농도 (20 ng/mL)를 말합니다. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> 그림 2: 3D 프로토콜의 대표 명시 이미지. d0, d2에서 EBs에서 hESC 식민지 유도 d14, 다양 한 크기와 형태 (번호 1-5) d28, d28에 독특한, 식별 기능 (문자는 는-c로 표시)와 단일 집계의 집계에 따라 집계 및 d35에 동일한 기능에서 볼 수 변경 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> 그림 3: 2D 프로토콜의 대표 명시 이미지. hESC 식민지 d0, d2에서 EBs 20 x 확대 및 확대, x 5에서 보듯이 d35에서 성숙 후 d14에서 집계를 도금 후 d13에서 유도 후 집계 합니다. 상단 왼쪽된 패널에서 백색 원형 hESC 식민지 가운데 차별화 된 셀의 영역을 표시합니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> 그림 4: 3 차원 문화에 다양 한 크기와 복잡성을 보여주는 명시 이미지. (A) 주 8에서 집계 (hESCs), 및 (B) d35 (hiPSCs). 후자의 이미지 전체 집계 표시 하려면 세 가지 별도 이미지 구성 됩니다. 두 집계 작은 집계 또는 (속보) 구조의 손실의 병합에 의해 영향을 받은 수 있습니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 재 공포. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> 그림 5: 3D 제품의 ICC 이미지 표시 관련 마커 및 구조. 문화 d35에 3D 제품 전시: PAX6 (녹색) 및 신경 장미 같은 대형의 루멘으로 (빨강) TBR2 (첫 번째 행); DCX (녹색) 및 외부 가장자리 심 실 영역 (VZ)에서 확산 NeuN (레드)-같은 구조 (두 번째 행); KIRREL2, neuroepithelium 소 뇌와 관련 된 마커 (3 행, 왼쪽); 그리고 ZIC1는 마커 관련 된 소 뇌과 립 세포 (오른쪽 세 번째 행). 여러 번 사용 하 여 4 개의 다른 hPSC 라인 실험 실시: hESC 라인 h01-(n = 5), 및 iPSC 라인 hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), 및 hvs51 (n = 1). 화살표 마름모꼴 입술 (RL)을 가리킨-구조와 같은. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 재 공포. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> 그림 6: 3D 제품에서 대규모 심 실 영역 같은 구조. 문화 d35에서 hESC 파생 집계 PAX6 (녹색) 및 TBR2 (적색) 일반적으로 관련 된 심 실 영역 (VZs) 및 subventricular 영역 (SVZs) 에서 vivo에서 발견 하는 초기 뉴런에 대 한 긍정적 이다. (맨 위) 별표 (*) 표시 VZ 같은 지역 괄호 VZ의 깊이/부서를 나타내는 집계의 가장자리를 따라 실행의 꼭대기 쪽 / SVZs. (중간) 결합 된 신호 표시 PAX6 흩어져 섹션 + TBR2-셀 상단 오른쪽 끝으로 크기에서 증가 하 고 VZ. (아래) 중간 패널에 사각형으로 표시 된 섹션의 높은 확대 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> 그림 7: 2D 제품의 ICC 이미지 표시 관련 마커. 문화 d35에서 2D 제품 전시, hESCs (위쪽 행)와 hiPSCs (아래쪽 행), 셀에 대 한 긍정적인:과 립 세포 마커 ZIC1 및 철새 소 뇌 신경 마커 TAG1 (왼쪽 열); 그리고 신경 마커 neurofilament (NF)와 TAG1 (오른쪽 열). 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> 그림 8: 2D 제품의 RT-PCR. h01-hESC 선의 mRNA 표정 분석 (위쪽 행)와 hiPSC 라인 hvs60 (아래쪽 행)는 2D의 끝에 프로토콜 제품에 젤 전기 이동 법을 보여줍니다:과 립 세포 마커 ZIC1과 립 세포 마커 ATOH1, 철새 소 뇌 신경 마커 TAG1, Purkinje 셀 표식 Calbindin (CALB), 전압 종속 칼슘 채널 CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), 감마-aminobutyric 산 (GABA) B 수용 체 1 (G-Br1), 및 내부 관리 유전자 EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> 그림 9: 칼슘 이미징/2D 제품의 분석. 문화 d35에 hPSC 차별화 제품 fluor5 염료를 가진 외피 후 현미경, 2 분 동안 기록 되었다. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 s에서 10 Hz. (A) 스틸 이미지 보기 hESCs 0에서 s (왼쪽)와 30에서 전기 자극의 시작 후 s (오른쪽). 화살표 (ROI) 칼슘 유입의 분석에 대 한 관심의 영역을 나타냅니다. 투자 수익에 대 한 시간 대 상대 형광에 (B) 그래픽 분석 표시 변경 (형광 변화 = (F F0) /F0, 어디 F0 = (∑F1-n) / n), 신경 같은 급격 한 발생 하기 전에, 도중, 그리고 후 자극입니다. 검정색 막대는 전기 자극의 길이 나타냅니다. (화이트) 바 규모 50 µ m. 전체 기록에 대 한 hESC (로 여기에 본) 하 고 (표시 되지 않음)는 hiPSC 라인 보충 비디오 1 , 비디오 2 보충, 각각 =. 녹음 4 배속에서 AVI 형식으로 되어있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 1: 칼슘 hESC 선에서 h01-2D 제품의 비디오 이미징. 문화 d35에 h01-현미경, 아래 2 분 fluor5 가진 외피 후 기록 하는 hESC 선에서 차별화 제품 염료. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 10 Hz. 녹음에 s 2 프레임/s에서 되었고 ~ 7 프레임/s, ~ 30 지속 비디오에서 AVI 비디오로 처리 ~ 4 배속에서 s. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 2: 칼슘 hiPSC 라인 hvs51에서 2D 제품의 비디오 이미징. 문화 d35에 hiPSC 라인 hvs51에서 차별화 제품 fluor5 염료를 가진 외피 후 현미경, 2 분 동안 기록 되었다. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 10 Hz. 녹음에 s 2 프레임/s에서 되었고 ~ 7 프레임/s, ~ 30 지속 비디오에서 AVI 비디오로 처리 ~ 4 배속에서 s. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

우리 간단한 3D 차별화를 사용 하 여 hPSCs에 대 한 프로토콜 정의 매체를 설명 하 고 초기 neuroepithelial 구조와 셀 집계를 생성할 수와 소 뇌 관련 표식으로 옵션에 대 한 긍정적인 성장 요인 감소 기능적 뉴런을 생성 하는 단층으로 셀을 차별화 하는 데 2D 수정.

효율적인된 3D 소 뇌 분화 프로토콜 옵션 2D 수정

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

이러한 분화 배양의 전반적인 목표는 2D 또는 3D 환경에서 소뇌 세포 계통을 생성하는 것입니다. 이러한 방법은 환자 유래 줄기 세포를 사용하여 소아 뇌 장애의 기저에 있는 새로운 개발 또는 질병 메커니즘에 관한 기본적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 요인이 거의 없이 간단한 시작 및 유지 관리가 가능하고 더 복잡한 신경 프로토콜을 테스트하기 위한 기반으로 사용할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Lisa가 맡을 것입니다. 변형된 방법으로 분화를 설정하기 위해, g-hPSC를 통과하는 방법, 필요한 양의 신경 유지 배지를 멸균 튜브로 전달하고 밀리리터당 4나노그램, FGF2 및 10마이크로몰 암석 억제제를 보충합니다. 그런 다음 매체 튜브를 실온 또는 수조에서 37도로 유지하십시오

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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