C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

이 절차의 전반적인 목표는 생식 세포가 예쁜꼬마선충의 뉴런으로 전환되도록 유도하는 것입니다. 이 방법은 세포 운명 재프로그래밍의 조절에서 신호 경로 또는 후성 유전학과 같은 생물학적 과정의 의미를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 방법의 주요 장점은 살아있는 동물에서 생식 세포가 운명을 유도하는 전사 인자의 과발현에 의해 도전받을 수 있다는 것입니다.

이와 병행하여 RNAi 스크리닝과 같은 유전자 스크리닝을 수행하여 세포 재프로그래밍을 조절하는 데 관련된 새로운 요인을 식별할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 재생 요법으로 확장됩니다. 이 생체 내 방법은 다양한 발달 및 환경 조건에서 세포 재프로그래밍을 연구하는 데 사용할 수 있기 때문입니다.

재프로그래밍 단계는 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 생식세포에서 뉴런으로의 전환 표현형은 lin-53이 고갈되면 신중하게 통제된 조건에서만 발생하기 때문입니다. RNAi 플레이트의 경우 IPTG와 카르베니실린을 함유한 NGM 한천으로 6cm 플레이트를 로드합니다.

어두운 곳에서 실온에서 24-48시간 동안 건조시킵니다. 그런 다음 최대 14일 동안 섭씨 4도까지 옮깁니다. 다음으로, 카르베니실린과 테트라사이클린을 포함하는 선택적 플레이트를 lin-53 유전자를 운반하는 L4440 플라스미드와 RNAi 박테리아 클론으로 만듭니다.

3상 줄무늬 패턴을 사용하고 빈 벡터 컨트롤을 플레이트해야 합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 접시를 성장시킵니다. 다음 날, 최소 3개의 단일 콜로니를 선택하고 각 콜로니를 별도의 배양 튜브에 2밀리리터의 LB에 접종하고 카르베니실린은 보충하지만 테트라사이클린

상태당 세 가지 건강한 배양을 계획하십시오. 다음으로, 섭씨 37도에서 600나노미터의 광학 밀도가 0.6에서 0.8에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양물을 성장시킵니다. 그런 다음 각 박테리아 배양액 500마이크로리터를 6cm NGM 한천 RNAi 플레이트에 추가합니다.

어두운 곳에서 실온에서 밤새 플레이트를 배양하십시오. 이 프로토콜은 전이유전자가 가장 안정적인 섭씨 15도에서 유지되는 BAT28 균주 웜에 최적화되어 있습니다. 균주 유전학에 대한 자세한 내용은 텍스트에 나와 있습니다.

기생충의 연령 동기화는 매우 중요합니다. 표백 기술을 사용하십시오. 800마이크로리터의 M9를 사용하여 성인과 난자가 들어 있는 6cm NGM 한천 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 원심 분리로 벌레를 펠릿으로 만들고 상등액을 제거합니다.

다음으로, 1ml의 표백 용액에 1/2을 추가합니다. 그리고 입체경으로 벌레를 관찰하면서 성인 벌레가 터지기 시작할 때까지 튜브를 흔든 다음 알을 모으십시오. 이제 계란에서 배설물을 분리하십시오.

먼저 튜브를 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 그런 다음 800 마이크로 리터의 M9로 조직 펠릿을 세 번 씻습니다. 세척 사이에 조직을 모으기 위해 원심 분리를 사용하십시오.

이제 세척된 난자를 OP50 박테리아가 파종된 신선한 NGM 플레이트로 옮깁니다. 배아의 성공적인 분리와 NGM 플레이트로의 이동을 간략하게 확인합니다. 섭씨 15도에서 동물을 성장시킵니다.

lin-53 고갈 시 생식세포에서 뉴런으로의 전환을 이루기 위해서는, 고갈은 부모 세대에서 시작되어야 한다. lin-53을 고갈시키기 위해, L4 동물에게 RNAi를 투여한다. 복제당 50개의 L4 웜을 박테리아가 없는 NGM RNAi 플레이트로 수동으로 옮깁니다.

백금선을 사용하십시오. L4 기생충은 복부 측면을 따라 대략 절반 정도의 흰색 반점으로 식별할 수 있습니다. 이제 약 7일 동안 어둠 속에서 섭씨 15도의 기생충을 배양합니다.

IPTG는 빛에 민감합니다. F1 자손이 L3 및 L4 단계에 도달하면 더 크고 두꺼운 부모 동물과 분리하십시오. 이 시점에서 F1에서 돌출된 외음부 표현형을 스크리닝하는데, 이는 lin-53에 대한 RNAi가 성공적이었음을 나타냅니다.

RNAi 활성은 또한 섭씨 15도 이상으로 증가하는 치사율을 초래할 수 있습니다. che-1을 활성화하고 F1 자손에서 생식 세포에서 뉴런으로의 전환을 유도하려면 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 동안 벌레에게 열 충격을 가합니다. 보다 효율적인 열 충격을 허용하므로 통풍 인큐베이터를 사용하십시오.

열 쇼크 후 어둠 속에서 밤새 섭씨 25도의 플레이트를 배양합니다. 동물이 L3 단계 중반에 도달하기 전에 열 충격에 의해 che-1의 과발현을 유도하지 않는 것이 중요합니다. 이는 비표적 조직에서 che-1 단백질의 발현으로 이어질 수 있습니다.

다음 날, 형광 광원과 GFP 필터를 설정하여 동물의 몸 중간 부위에서 형광유전자 유래 형광을 검사합니다. 표현형 침투도를 평가하려면 형광 신호를 방출하는 동물의 비율을 찾으십시오. 일반적으로 약 30%는 이산 GFP 신호를 나타냅니다.

이에 비해, 빈 벡터 RNAi를 가진 동물에서는 생식세포의 확산 신호조차도 개체군의 5% 이상에서 보이지 않습니다. 돌출된 외음부 표현형을 보이는 F1 동물은 lin-53 RNAi의 성공적인 적용을 보여줍니다. 이 동물에서는 che-1의 열충격 유도 시 생식 세포가 ASE 뉴런 유사 세포로 전환되는 것이 일반적입니다.

면밀한 검사는 생식세포 세포의 뉴런에서 전형적인 뉴런과 같은 돌기를 보여줍니다. 대조적으로, 빈 벡터 대조군은 GFP의 최소 발현을 보였으며, 이는 기껏해야 확산성이었습니다. 이 동물들의 생식세포는 뉴런과 같은 특징이 없었다.

che-1 과발현 유도 시점에 동물이 너무 어렸을 때, 그들은 종종 발달 중인 외음부와 같은 신체의 다른 영역에서 이소성 이식 유전자 발현을 나타내곤 했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생식 세포를 뉴런으로 다시 프로그래밍하기 위해 살아있는 벌레를 사용하여 실험을 신중하게 계획하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 비디오에 설명된 방법을 통해 이제 세포 재프로그래밍(cellular reprogramming) 조절에 있어 다양한 요인의 영향을 조사할 수 있습니다.

이 절차를 마스터하면 10일 안에 완료할 수 있습니다. 실험을 시도하는 동안 재프로그래밍을 유도하기 전에 동물을 조심스럽게 단계화하고 BAT28 변형을 15도로 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이중 RNAi와 같은 다른 방법을 수행하여 '세포 운명 변환 중에 역할을 하는 기본 메커니즘은 무엇입니까?'와 같은 추가 질문을 해결할 수 있습니다.