Name: C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 RNAi와 열 충격을 이용한 생식세포-신경세포 재프로그래밍 방법을. CHE-1 과발현과 LIN-53 저해로 세포 운명 전환 메커니즘을 연구하고 재생의학에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리 기술 지원에 대 한 알리 나 엘-칼 릴리, 그리고 마 르 티 나 Hajduskova 감사합니다. 우리 원고에 의견에 대 한 Tursun 그룹의 회원을 감사합니다. 이 작품은 ERC-StG-2014-637530 ERC CIG PCIG12-가-2012-333922에 의해 후원 되었다 하 고 헬름홀츠 협회에 분자 의학에 대 한 최대 Delbrueck 센터에 의해 지원 됩니다.

동물 보호에 관하여 여기에서 설명한 모든 방법 LaGeSo 베를린, 독일에 의해 승인 되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol>
	<li>NGM-한 천 배지 (1 L)
	<ol>
		<li>NaCl의 3 세대, 펩 미디어 (예: Bacto-펩), 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독, 후 추가 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고), 콜레스테롤의 1 mL 1 mL의 1 M MgSO4, 1 mL의 1 M CaCl2, 25 mL의 1 M K2PO4, 고 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM Agar RNAi 접시 (1 L)
	<ol>
		<li>NaCl의 3 세대, 펩 미디어의 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독 후 추가, 콜레스테롤 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고)의 1 mL 1 M MgSO4의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl2, 1 M K2가4의 25 mL, 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL, 1 M IPTG의 1 mL 고 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>파운드-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>효 모 5 g 추출, 5 g의 NaCl, 한 천, 10 mL의 1 M Tris pH 8.0의 20 g, 펩 미디어의 10 g를 추가 합니다. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL와 5 mg/mL 항생물질의 2.5 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 매체 (1 L)
	<ol>
		<li>펩 미디어의 10 g을 추가, 효 모 5 g, NaCl의 5 g 및 10 mL 1 M Tris pH 8.0의 추출. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-버퍼 (1 L)
	<ol>
		<li>나2HPO4의 6.0 g, KH2포4의 3 세대, 5 g의 NaCl, 그리고 젤라틴의 50 밀리 그램을 추가 합니다. 사용 하기 전에 1 M MgSO4의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>표백 솔루션 (10 mL)
	<ol>
		<li>1 mL NaClO와 5 N NaOH의 2 개 mL를 추가 합니다. 10 mL에 H2O를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2입니다. RNAi 접시의 준비
참고: C. 선 충 은 선 충 류 성장 매체 한 천 (Agar NGM)10,11의 7.5 mL를 포함 하는 6 cm 배양 접시에 실험실에서 일반적으로 경작 된다. 이 프로토콜은 15 ° c.에서 보관 하는 벌레에 대 한 최적화 NGM 접시를 준비 하려면 곰 팡이 및 세균 오염을 방지 하기 위해 표준 무 균 기법을 사용 합니다. 다음은 RNAi에 대 한 시 약으로 보충 NGM 접시를 준비 하는 프로토콜입니다.
<ol>
	<li>1mm 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 및 50 µ g/mL carbenicillin 6 cm NGM Agar RNAi 접시를 준비 합니다. 그들은 어두운12실 온에서 24-48 h 동안 건조 하자.
	<ol>
		<li>어둠 속에서 4 ° C에서 RNAi 번호판을 유지. 14 일 보다 오래 된 경우 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>50 µ g/mL를 포함 하는 파운드-한 천 배지에서 사용 가능한 RNAi 도서관13 에서 냉동된 글리세롤 주식에서 린-53 유전자 DNA 시퀀스와 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 (대장균 HT115) 클론 선택 carbenicillin와 3 상 줄이 패턴을 사용 하 여 12.5 µ g/mL 항생물질. 37 ° C 하룻밤12에서 박테리아 성장. 이 복제는 박테리아에 린-53 dsRNA의 IPTG 종속 생산을 수 있습니다.
	<ol>
		<li>또한, 빈 벡터 제어14유전자 시퀀스 없이 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 성장.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>다음 날, 린-53 에서 단일 식민지 나 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 빈 벡터 파운드-한 천 격판덮개 팁과 액체 LB 중간14 50 µ g/mL carbenicillin 보충의 2 개 mL를 포함 하는 별도 문화 관으로 그들의 각각을 예방. 성장 37 ° C에서 하룻밤 문화 광학 밀도 (OD)를 도달할 때까지 600 nm의 0.6-0.8. 외경15분 광 광도 계 사용 하 여 측정 합니다. 주의: 액체 LB 미디어 없어야 감소 RNAi 효율 12 리드를 먹이 동안 항생물질의 포함부터 박테리아 글리세롤 주식에서 질주 사용 파운드-한 천 배지와 달리 항생물질</li>
	<li>6 cm NGM Agar RNAi 번호판은 multipipette를 사용 하 여 각 세균성 문화 (린-53 또는 빈 벡터)의 500 µ L를 추가 합니다. 건조를 어둠 속에서 실 온에서 하룻밤 닫힌된 뚜껑 접시를 품 어. 이 기간 동안, NGM 접시에서 IPTG dsRNA 박테리아에서의 생산을 유발 한다.
	<ol>
		<li>실험 당 세균성 문화 당 3 접시를 사용 합니다. 이 기술 3 각 실험에 대 한 복제를 제공할 것입니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 박테리아와 말린된 NGM agar RNAi 접시를 저장.</li>
</ol>
3. 선 충 C. 변형 BAT28의 준비
<ol>
	<li>웜 변형 transgenes otIs305 를 포함 하는 BAT288 유지 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] 및 ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 표준 NGM-한 천 배지를 사용 하 여 15 ° c.에 OP50 박테리아에 참고: 선 충 문화에 자세한 프로토콜에 대 한10를 참조 하십시오. Rol-6(su1006) 는 지배적인 대립 유전자 이며, 일반적으로 사용 하는 phenotypic 주입 마커16 일반적인 회전 이동 시키는. 그것은 otIs305 transgene에서 추적을 사용 hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>15 ° C에서 BAT28 긴장의 precautious 활성화를 방지 하기 위해 항상 유지는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. 가능한 만큼 많이 긴장을 처리 하는 동안 15 ° C 보다 높은 온도에 노출 줄일.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>나이-동기화 웜, 표백 기술17을 사용 합니다.
	<ol>
		<li>성인과 900 µ L M9 버퍼를 사용 하 여 BAT28의 계란을 포함 하 6 cm NGM Agar 접시를 씻어. 펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>0.5-솔루션을 표백의 1 mL을 추가 하 고 어른 벌레 버스트 오픈 시작 때까지 대략 1 분 동안 튜브를 흔들어. 모니터는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여입니다.</li>
		<li>펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>M9 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 900 x g에서 centrifuging 여 웜 펠 릿 3 번을 씻어.</li>
		<li>청소 계란 OP50 박테리아와 시드 신선한 NGM 접시에 놓습니다. 성장 15 ° C에 OP50 박테리아에 표백된 인구 L4 단계 (약 4 일)에 도달할 때까지. 표준 stereomicroscope를 사용 하 여 웜18 의 복 부 측에 따라서 대략 중간 흰색 패치 L4 애벌레를 인식할 수 있습니다. 참고: 세균 셀 린-53의 고갈에 따라 신경 변환 형을 달성 하기 위해, 그것은 부모의 세대 (P0)에 고갈 될 필요가 있다.</li></ol></li></ol>변환 형에 대 한 점수는 다음 세대 (자식 세대 f 1)에 착수 된다. 달성 하기 위하여는 P0에 이미 파괴 린-53 , L4 동물 RNAi를 받게 됩니다.
	
	
	<li>수동으로 전송 50 L4 단계 웜 NGM 접시에 백 금 철사를 사용 하 여 복제 당 그 어떤 박테리아를 포함 하지 않으며 모든 전송된 OP50 박테리아에서 벌레를 하자. 벌레에 약 5 분 동안 이동 하자. NGM Agar RNAi 격판덮개에서 사용 박테리아는 이전 린 53 RNAi 박테리아 (또는 빈 벡터 제어) 각각 RNAi 번호판을 시드.
	<ol>
		<li>실제 RNAi 번호판 OP50 박테리아를 전송 하지 마십시오. 온도 15 ° c. 보다 높은 긴장의 노출 시간을 최소화 하기 위해 빠른 작업</li>
	</ol>
	</li>
	<li>벌레의 F1 자손 L3-L4 단계에 도달할 때까지 약 7 일에 대 한 15 ° C에서 NGM Agar RNAi 접시에 벌레를 품 어. 그들은 수 있다 명확 하 게 구분 P0 동물에서 크고 F1 자손 보다 두꺼운 이기 때문.
	<ol>
		<li>시각적으로 확인 하십시오 표준 stereomicroscope 아래 그림 1에서 보듯이 F1 자손 웜 튀어나온 음부 (pvul) 표현 형을 표시 하는지 여부. 린-53 에 대 한 RNAi는 다 면 발현 성 효과 고 RNAi 린-53 에 대 한 성공 여부를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다 pvul 표현 형. 참고: 린-53 에 대 한 RNAi는 F1 배아의 치 사 율을 일으킬 수 있습니다. 이 효과 동물 L3-L4 단계에 도달 하기 전에 접시 15 ° C 보다 더 높은 학위에 노출 되는 경우 증가 합니다. 죽은 태아 체포 개발 및 해칭의 부족에 의해 인식 될 수 있다.</li>
		<li>IPTG 이기 때문에 빛에 민감한 접시 어둠 속에 품 어.</li>
	</ol>
	</li>

4입니다. 생식 세포 프로그래밍의 유도
<ol>
	<li>품 어 시험된 RNAi 판 린-53 를 포함 하 고 빈 체 1을 활성화 하기 위해 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 벡터 RNAi 대우 F1 자손. 발명된 인큐베이터를 사용 하 여 보다 효율적인 열-충격에 대 한 수 있기 때문.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 30 분 동안 복구 하 고 어둠 속에서 하룻밤 25 ° C에서 번호판을 품 어에 열 충격을 동물 허용.</li>
	<li>Gcy-5prom::gfp의 GFP 필터 동물 검사 형광 광원에 결합 하는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여- 그림 2와 같이 벌레의 중간 본문 영역에서 신호를 파생. GFP 신호에 대 한 설정된 현미경: 여기 488에서 최대 방출 최대 509에서 nm nm.</li>
	<li>천 패드 포함 된 현미경 슬라이드19중순 신체 영역에 GFP 신호와 장착 동물에 의해 생식 세포 신경 변환의 정도 평가 합니다.
	<ol>
		<li>평가 형 penetrance 어두운 동물 대 신경 변환 세균 셀을 보여주는 동물의 수를 계산 합니다. 일반적으로, 약 동물의 30% 표시 개별 GFP 신호 린 53 고갈에 따라 생식에 반면 동물의 5% 이상 빈 벡터 RNAi 시 생식에 확산 GFP 신호.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li>
<li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+barriers+and+enhancers%3A+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regen%22%5BJournal%5D)">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li>
<li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-Dependent+Heterochromatin%3A+Barrier+to+Cell+Fate+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Gent%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li>
<li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li>
<li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li>
<li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).</li>
<li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li>
<li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100(2017).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_introreversegenetics/introreversegenetics.html">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).</li>
<li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li>
<li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li>
<li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li>
<li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_intromethodscellbiology/intromethodscellbiology.html">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li>
</ol>

저자는 아무 경쟁 관심사 존재 선언.

유전자 변형 C. 선 충 을 사용 하 여 설명된 프로토콜 동안 BAT28 변형 및 린-53 에 대 한 RNAi는 간단, 단계 수는 중요 한 순서에 신경 프로그래밍을 생식 세포의 예상된 결과 보장 하기 위해. 그것은 중요 한 실험 전에 항상 긴장 BAT28 15 ° C에서 유지 됩니다. 처리 및 긴장의 유지 보수, 동안 15 ° C 이상의 온도에서 시간 필요가 최소화 가능 한 한 많이 있다. 적절 한 열 충격 조건을 체 1 overexpression의 부족 한 유도 하지 ASE 신경 변환 생식 세포 귀 착될 것 이다 때문에 중요 하다. 이 프로토콜에 설명 된 대로 형 penetrance를 측정 하 여 검출 될 수 있다. 광범위 한 열-충격 동물의 치 명도 될 수 있습니다. 예를 들어, 배치 된 안 벽 근처 또는 정적 공기 인큐베이터의 하단 바닥에 종종 접시 광범위 한 열 처리 경험. 따라서, 배기 열 인큐베이터를 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 열-충격 유도의 타이밍은 애벌레 단계 이전 체 1 의 오버 식 이후 중요 L3 소성 gcy 5prom::gfp 유도 (그림 3) 외 음부 등의 다른 지역에서 발생할 수 있습니다 다음 9. 또한, 광범위 한 열-충격 형 penetrance 5% 그리고 다른 조직, 즉 내장의 증가 자동 형광을 확장 해야 하는 빈 벡터 RNAi 동물에 의해 검출 될 수 있다.
산발적으로, RNAi 박테리아는 그들의 활동을 효율적으로 대상 유전자의 dsRNA를 생산을 잃을 수 있습니다. 불행히도,이 RNAi 실험 검색된 사전 수 없습니다. 이러한 경우에는 글리세롤에서 신선한 행진 프로토콜의 섹션 2에 설명 된 대로 성장 한다. 경우 아직 아무 RNAi 발생 다 면 발현 성 형 pvul 표현 형 린-53, 다음 플라스 미드에 대 한 성공적인 RNAi 기인한 각각 박테리아에서 DNA 격리와 같은 표시를 수행 해야 하 고 신선한 HT115 박테리아가 될 필요가 린-53 시퀀스가 포함 된 L4400 플라스 미드와 변형.
중요 한 것은, BAT28 긴장은 한 사출 마커 pRF4와 동물의 transgenesis 동안에 사용 되었다에 의해 발생 하는 롤러 형은 hsp-16.2prom::che-1 DNA 구조. 때때로, 동물의 입을 수 있습니다 나타내는 롤링 형을 잃고는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. BAT28 긴장을 제대로 유지 하려면 신선한 접시 10 롤러 동물을 선택 하 고 전파 동물을 압 연에 대 한 선택.
응용 프로그램 프로토콜의 동물 부모 (P0 세대)는 린-53 RNAi에 노출 되지 생식 세포 신경 변환 모성 구조4때문에 표시 되지 것입니다 즉 F1 RNAi 절차로 제한 됩니다. 세균 세포 뉴런으로 변환 하는 다른 절차 Ciosk와 동료15 RNAi 노크 다운 gld-1 의 녹음 방송 요인의 이상의 식 없이 mex-3 를 사용 하 여 설명 하고있다. 그러나, 얻은 뉴런 뉴런의 특정 종류에 속하지 않는 및 생식 세포는 또한 gld-1 및 mex-315의 RNAi 중재 고갈 시 근육 처럼 세포로 변환. 이전에, 그것은 입증 되었습니다 RNAi 린-53 에 대 한 허용-표현의 Pitx 형 homoedomain 녹음 방송 요인 체-14 대신 UNC-3016 시 GABAergic 신경-같은 세포로 생식 세포 변환 . 미래 방향에 대 한 다른 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인 린-53 고갈 세균 세포 여부를 테스트할 수 있습니다 특정 뉴런 보다 다른 셀 형식으로 변환할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 조직적 bHLH 녹음 방송 요인 HLH-1, 포유류 MyoD17체의 overexpression 린-53 RNAi5 시 근육에 생식 세포의 전환을 유도합니다. 다른 유전 스크린의 숫자에 대 한 세균 셀 린-53 RNAi 시 특정 신체 세포 유형 및 적절 한 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인의 과다 식 설립 프로그래밍을 사용할 수 있습니다. 이러한 억압 또는 증강 화면 셀 운명 변환 하는 동안 역할 규정 경로 해 부 수 있습니다.

세포 운명 조직적 TF MyoD 같은 소성 TF 식으로 프로그래밍을 때 overexpressed, 근육 같은 셀1에 직접 변환 fibroblasts 수십 년 동안 연구 집중 되었습니다. 그러나, 차별화 된 셀이이 과정, 그들의 세포질 신원을 보호 메커니즘 때문에 내 화 많습니다. 세균 세포 보호의 유사한 정도 보여 고 종종 운명을 유도 TF의 이상의 표현 시 다른 세포 유형으로 생식 세포 변환 방지 하기 위해 방 벽으로 작동 하는 기본 메커니즘이 있습니다. 일반적으로, 히스톤 수정 및 chromatin 구조 같은 후 성적인 규칙 세포 운명을2,3의 변환에 대 한 장애를 부과 한다. 우리 이전 반전 유전학 C. 선 충 에 RNAi 노크-다운을 사용 하 여 적용 하 고 셀룰러 정체성을 보호 하 고 그로 인하여 세균 세포의 신경4로 프로그래밍을 중화 하는 요인 확인. 특히, polycomb 억압 적인 복잡 한 2 (PRC2) 및 높은 보존된 히스톤 보호자 린-53 (CAF-1/RBBP/4/7 인간의) C. 선 충에서 glutamatergic 맛 신경 세포 등 특정 신체 세포 유형으로 생식 세포의 직접 변환 방지 4 , 5. 장벽 요소 프로그래밍이 세균 세포를 식별 하기 위해 사용 하는 열 충격 유도할 수 있는 Zn 손가락 TF 체-1을 운반 하는 유전자 변형 동물. C. 선 충, glutamatergic 맛 신경 세포의 운명을 ASE6라고 지정의 두 머리 신경 체-1 일반적으로 표현 된다. ASE 신경 운명 ASE 특정 형광 기자 gcy 5prom::gfp의 표현에 의해 구상 될 수 있다. GCY-5 chemoreceptor ASE 오른쪽 신경7만 표현 이다. RNAi에 의해 린 53 소모 및 열 충격에 의해 체 1의 광범위 한 소성 식의 유도, 생식 세포는4,5 생체 내에서뉴런으로 변환할 수 있습니다. 중요 한 것은, RNAi 치료의 타이밍은 린-53 RNAi에 노출만 어른 벌레 (P0 세대) F1 자손 동물 신경4에 프로그래밍에 대 한 허용은 생식을 일으키로 중요 합니다.
C. 선 충 에서 신경 변환 절차를 위에 설명 된 생식 세포 생물학 질문 셀 운명 프로그래밍에 경로 신호의 의미 등의 다양 한 연구를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 노치 신호 전달 경로 생식 세포8프로그래밍 과정의 의미를 공부 하기 위하여 린-53 에 대 한 RNAi 따라 ASE 뉴런으로 재프로그래밍 체 1 유발 세균 셀을 사용 합니다. 린-53 와 demethylase 인코딩 히스톤 공동 고갈에 더블 RNAi를 수행 하 여 우리 노치 신호 통로 중화 PRC2 중재 유전자 표현의 UTX-1 생식8에서에서 활성화 하 여 입을 보여주는 유전자 utx-1 . 이 생식 세포 변환할이이 프로토콜에서 설명 하는 신경 세포 프로그래밍의 컨텍스트에서 다른 발달 및 환경 그대로 유기 체에와 같은 복잡 한 생물 학적 과정을 공부 하 사용 될 수 보여 줍니다. 조건입니다. 또한, 그것은 과도 다른 운명을 유도 TFs 셀룰러 소성9의 금지에서 그들의 역할을 연구 하거나 유도 하는 세균 세포의 프로그래밍에 대 한 그들의 잠재력을 평가 표현 하 여 생식 세포를 도전 하는 관점을 제공 한다 다른 셀에 비보를 입력합니다.
포유류 조직 문화는 또한 세포 운명 프로그래밍의 다양 한 측면을 공부 허용, 문화에서 성장 하는 세포 신호 경로 조건 그대로 체에 비해 모방 하는 능력을 제한 했다. 따라서, C. 선 충 검사 vivo에서프로그래밍 하는 동안 노치 신호 등 다양 한 생물 학적 과정의 역할에 대 한 다재 다능 한 모델 이다. 또한, 상대적으로 쉽게 유지 하 고 낮은 비용에 대 한 유전자 수정 유전 스크린에 대 한 강력한 모델입니다.

<table><tbody><tr><td><강력한>화학물질&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>박토펩톤&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>펩톤 미디어&nbsp;</td></tr><tr><td>효모 추출물&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>로스</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>로스</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>시그마</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터&nbsp;</td><td>열 충격</td>인큐베이터용 <td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>산요 MIR-5</td><td>5534210</td><td>15 &deg에서 웜 균주의 유지 보수; C 또는 25 &deg; C</td></tr><tr><td>Microscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>M205 FA</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Imaging) + camera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>microscope (Imaging) + camera</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial 균주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus).</td></tr><tr><td>대장균 OP50&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Uracil auxotroph E. coli strain</td></tr><tr><td>Worm strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td>N2RNAi Clones</strong<td>와 4배 더 많은 교차 OH9846에서 파생</td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer 라이브러리 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>빈 vetor: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>Misc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>웜 픽&nbsp;</td><td></td><td></td><td>파스퇴르 피펫과 백금 와이어를 사용하여 자체 제작</td></tr></tbody></table>

c. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 rnai 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

세포 생물학 과정을 공부 하 고 특정 종류의 id를 변환 하는 동안 유지 하 고 세포 정체성 보호 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 합니다. 선 충 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 있는 특정 신경 세포로 생식 세포의 전환 설립된 셀 정체성 보호 규정 경로 해 부 하기 위해 유전 스크린을 수행 하기 위한 강력한 도구입니다. 특정 유형의 신경 ASE 라고 세균 세포의 프로그래밍 아연 손가락 녹음 방송의 광범위 한 이상 식 허용 하는 유전자 변형 동물 요인 (TF) 체-1 필요 합니다. 생 체-1은 두 개의 머리 뉴런에 독점적으로 표현 되며 gcy 5prom::gfp 기자에 의해 쉽게 구상 될 수 있다 glutamatergic ASE 신경 세포 운명을 지정 하는 데 필요한. 열 충격 발기인 구동 체 1 유전자 식 구조를 포함 하는 횡단 유전자 열 충격 처리 시 전체 동물에 체 1의 광범위 한 잘못 표현 수 있습니다. Chromatin 규제 요소 린-53와 열 충격 유발 체 1 -식에 대 한 RNAi의 조합을 ASE 신경-같은 세포로 생식 세포의 프로그래밍 이끌어 낸다. 우리 기술 여기 유전자 변형 동물의 열 충격 처리에 대 한 적절 한 조건과 특정 RNAi 절차 성공적으로 신경 변환 생식 세포를 유도 하기 위하여.

그림 1에서 보듯이, F1 동물 pvul 표현 형을 전시 하는 린-53 RNAi의 성공적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 이 동물 들은 그림 2에서 볼 수 있듯이 체 1 -식의 열 충격 유도 따라 ASE 신경-같은 세포로 그들의 생식 세포의 변환을 허용 하는 경향이 있다. 빈 컨트롤에 자란 벌레는 달리 RNAi 린-53 RNAi 치료 기술된 이전4, 으로 하룻밤 사이 열 충격 및 25 ° C 부 화 후 중간 본문 영역에서 소성 GFP 신호를 표시 하는 동물을 얻을 것입니다 벡터 8.이 벌레의 epifluorescence 현미경 가까이 시험 드러내 보여주는 GFP 신호 또한 세포는 신경 세포에 대 한 전형적인 신경 같은 계획 (그림 2B, 흰색 화살표) 표시. 린-53 에 대 한 RNAi 실패 했다 또는 열 충격 조건을 적절 한 되지 않은 경우 치료 동물 (그림 2) GFP 신호 제어 RNAi에 닮은 것 이다. 중요 한 것은, 동물 중반 L3 단계에 도달 하기 전에 체 1 의 오버 식 열 유도 의해 유도 하지 마십시오. 체 1 overexpression 유도 시간에 너무 젊은 했다 동물 그림 313에서 같이 개발 외 음부 같은 본문의 다른 지역에서 소성 gcy 5prom::gfp 식을 표시할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
그림 1: 린-53에 대 한 RNAi에 의해 발생 하는 Pvul 형. (맨 위) L4/젊은 성인 단계 F1 자손 벌레의 DIC 그림 컨트롤이 나 린-53 RNAi 대우 어머니에서 파생. 바 규모 = 20 µ m. (하단) 동물 린-53 RNAi 디스플레이 튀어나온 음부 (pvul) 형 (검정 화살표 머리)로 치료. Pvul 형 린-53 에 대 한 RNAi 되었는지 확인 합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
그림 2: 웜 성공적으로 재설정된 생식 세포와 신경에. (A) 빈 벡터에 성장 하는 BAT28 변형 동물 체 1 overexpression의 열 충격 유도 후 GFP 신호는 생식에 표시 하지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. (B) BAT28 변형 동물 성장 빈 벡터 제어에 린-53 에 RNAi 디스플레이 gcy 5prom::gfp 신호 중간 몸 지역에 성장 하는 RNAi 동물 달리. 그림 63 X 배율에서 GFP 신호와 중반 바디 섹션의 GFP-긍정적인 세포 돌출 (흰색 화살표 머리)을 보여주는 공개. 이 형태학 기능 세균 세포 ASE 같은 신경 세포로 변환 받았습니다 나타냅니다. 화이트 별표 소장 파생 된 자동 형광 표시합니다. 모든 사진 확대 및 63 X 배율 X 20 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 흰색 파선 웜 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
그림 3: 소성 GFP와 초기 단계 웜. BAT28 변형 동물 열-충격 체 1 overexpression L2 등 초기 애벌레 단계에 대 한 유도 했다 빈 벡터 RNAi 박테리아에 성장 중순 신체 영역 (흰색 별표)에서 GFP 신호를 표시 합니다. 이러한 신호는 생식 세포 프로그래밍으로 인해 되지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

이 절차의 전반적인 목표는 생식 세포가 예쁜꼬마선충의 뉴런으로 전환되도록 유도하는 것입니다. 이 방법은 세포 운명 재프로그래밍의 조절에서 신호 경로 또는 후성 유전학과 같은 생물학적 과정의 의미를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 방법의 주요 장점은 살아있는 동물에서 생식 세포가 운명을 유도하는 전사 인자의 과발현에 의해 도전받을 수 있다는 것입니다.이와 병행하여 RNAi 스크리닝과 같은 유전자 스크리닝을 수행하여 세포 재프로그래밍을 조절하는 데 관련된 새로운 요인을 식별할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 재생 요법으로 확장됩니다. 이 생체 내 방법은 다양한 발달 및 환경 조건에서 세포 재프로그래밍을 연구하는 데 사용할 수 있기 때문입니다.재프로그래밍 단계는 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 생식세포에서 뉴런으로의 전환 표현형은 lin-53이 고갈되면 신중하게 통제된 조건에서만 발생하기 때문입니다. RNAi 플레이트의 경우 IPTG와 카르베니실린을 함유한 NGM 한천으로 6cm 플레이트를 로드합니다.어두운 곳에서 실온에서 24-48시간 동안 건조시킵니다. 그런 다음 최대 14일 동안 섭씨 4도까지 옮깁니다. 다음으로, 카르베니실린과 테트라사이클린을 포함하는 선택적 플레이트를 lin-53 유전자를 운반하는 L4440 플라스미드와 RNAi 박테리아 클론으로 만듭니다.3상 줄무늬 패턴을 사용하고 빈 벡터 컨트롤을 플레이트해야 합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 접시를 성장시킵니다. 다음 날, 최소 3개의 단일 콜로니를 선택하고 각 콜로니를 별도의 배양 튜브에 2밀리리터의 LB에 접종하고 카르베니실린은 보충하지만 테트라사이클린은 보충하지 않습니다.상태당 세 가지 건강한 배양을 계획하십시오. 다음으로, 섭씨 37도에서 600나노미터의 광학 밀도가 0.6에서 0.8에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양물을 성장시킵니다. 그런 다음 각 박테리아 배양액 500마이크로리터를 6cm NGM 한천 RNAi 플레이트에 추가합니다.어두운 곳에서 실온에서 밤새 플레이트를 배양하십시오. 이 프로토콜은 전이유전자가 가장 안정적인 섭씨 15도에서 유지되는 BAT28 균주 웜에 최적화되어 있습니다. 균주 유전학에 대한 자세한 내용은 텍스트에 나와 있습니다.기생충의 연령 동기화는 매우 중요합니다. 표백 기술을 사용하십시오. 800마이크로리터의 M9를 사용하여 성인과 난자가 들어 있는 6cm NGM 한천 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 원심 분리로 벌레를 펠릿으로 만들고 상등액을 제거합니다.다음으로, 1ml의 표백 용액에 1/2을 추가합니다. 그리고 입체경으로 벌레를 관찰하면서 성인 벌레가 터지기 시작할 때까지 튜브를 흔든 다음 알을 모으십시오. 이제 계란에서 배설물을 분리하십시오.먼저 튜브를 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 그런 다음 800 마이크로 리터의 M9로 조직 펠릿을 세 번 씻습니다. 세척 사이에 조직을 모으기 위해 원심 분리를 사용하십시오.이제 세척된 난자를 OP50 박테리아가 파종된 신선한 NGM 플레이트로 옮깁니다. 배아의 성공적인 분리와 NGM 플레이트로의 이동을 간략하게 확인합니다. 섭씨 15도에서 동물을 성장시킵니다.lin-53 고갈 시 생식세포에서 뉴런으로의 전환을 이루기 위해서는, 고갈은 부모 세대에서 시작되어야 한다. lin-53을 고갈시키기 위해, L4 동물에게 RNAi를 투여한다. 복제당 50개의 L4 웜을 박테리아가 없는 NGM RNAi 플레이트로 수동으로 옮깁니다.백금선을 사용하십시오. L4 기생충은 복부 측면을 따라 대략 절반 정도의 흰색 반점으로 식별할 수 있습니다. 이제 약 7일 동안 어둠 속에서 섭씨 15도의 기생충을 배양합니다.IPTG는 빛에 민감합니다. F1 자손이 L3 및 L4 단계에 도달하면 더 크고 두꺼운 부모 동물과 분리하십시오. 이 시점에서 F1에서 돌출된 외음부 표현형을 스크리닝하는데, 이는 lin-53에 대한 RNAi가 성공적이었음을 나타냅니다.RNAi 활성은 또한 섭씨 15도 이상으로 증가하는 치사율을 초래할 수 있습니다. che-1을 활성화하고 F1 자손에서 생식 세포에서 뉴런으로의 전환을 유도하려면 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 동안 벌레에게 열 충격을 가합니다. 보다 효율적인 열 충격을 허용하므로 통풍 인큐베이터를 사용하십시오.열 쇼크 후 어둠 속에서 밤새 섭씨 25도의 플레이트를 배양합니다. 동물이 L3 단계 중반에 도달하기 전에 열 충격에 의해 che-1의 과발현을 유도하지 않는 것이 중요합니다. 이는 비표적 조직에서 che-1 단백질의 발현으로 이어질 수 있습니다.다음 날, 형광 광원과 GFP 필터를 설정하여 동물의 몸 중간 부위에서 형광유전자 유래 형광을 검사합니다. 표현형 침투도를 평가하려면 형광 신호를 방출하는 동물의 비율을 찾으십시오. 일반적으로 약 30%는 이산 GFP 신호를 나타냅니다.이에 비해, 빈 벡터 RNAi를 가진 동물에서는 생식세포의 확산 신호조차도 개체군의 5% 이상에서 보이지 않습니다. 돌출된 외음부 표현형을 보이는 F1 동물은 lin-53 RNAi의 성공적인 적용을 보여줍니다. 이 동물에서는 che-1의 열충격 유도 시 생식 세포가 ASE 뉴런 유사 세포로 전환되는 것이 일반적입니다.면밀한 검사는 생식세포 세포의 뉴런에서 전형적인 뉴런과 같은 돌기를 보여줍니다. 대조적으로, 빈 벡터 대조군은 GFP의 최소 발현을 보였으며, 이는 기껏해야 확산성이었습니다. 이 동물들의 생식세포는 뉴런과 같은 특징이 없었다.che-1 과발현 유도 시점에 동물이 너무 어렸을 때, 그들은 종종 발달 중인 외음부와 같은 신체의 다른 영역에서 이소성 이식 유전자 발현을 나타내곤 했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생식 세포를 뉴런으로 다시 프로그래밍하기 위해 살아있는 벌레를 사용하여 실험을 신중하게 계획하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 비디오에 설명된 방법을 통해 이제 세포 재프로그래밍(cellular reprogramming) 조절에 있어 다양한 요인의 영향을 조사할 수 있습니다.이 절차를 마스터하면 10일 안에 완료할 수 있습니다. 실험을 시도하는 동안 재프로그래밍을 유도하기 전에 동물을 조심스럽게 단계화하고 BAT28 변형을 15도로 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이중 RNAi와 같은 다른 방법을 수행하여 '세포 운명 변환 중에 역할을 하는 기본 메커니즘은 무엇입니까?'와 같은 추가 질문을 해결할 수 있습니다.

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Neurexins 및 neuroligins는 시냅스 차별화 및 전송에 필수적인 역할을 수행하는 막 - 신경 세포의 접착 단백질입니다. 의 Neuroligin 부족한...

의 삼투 회피 Caenorhabditis 엘레간스 : 두 유전자의 시냅틱 기능, 인간의 Orthologues NRXN1과 NLGN1</em자폐증을위한>로 후보

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

우리가 사용하는 프로토콜을...

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

이 비디오는 예쁜꼬마선충에서 RNAi 처리의 원리를 설명하고 형질전환 웜 균주에서 lin-35를 knockdown하는 프로토콜을 보여줍니다.

예쁜꼬마선충 공급을 위한 RNAi 도금: 대장균에서 표적 dsRNA 발현을 유도하는 기술

RNAi는 예쁜꼬마선충 연구자들이 사용할 수 있는 강력한 유전 도구입니다. 이 동영상은 액체 배양 조건을 활용하여 플레이트 공급보다 RNAi로 더 많은 기생충을 처리하는 방법을 소개합니다.

액체 배양에서 RNAi 공급: 예쁜꼬마선충에서 유전자 발현을 knockdown하는 고처리량 방법

이 비디오는 선충 생식 세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 세포 운명을 보여줍니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 형질전환 유충은 RNA 간섭(RNAi)을 받아 특정 염색질 조절 인자를 무너뜨려 자손의 생식 세포를 세포 운명 재프로그래밍에 더 취약하게 만듭니다. 열 충격은 자손에 가해져 생식 세포가 뉴런으로의 변형을 유발하는 뉴런 특이적 전사 인자를 발현하도록 유도하며, 이는 발현된 형광 리포터를 사용하여 식별됩니다.

선충 생식 세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 세포 운명

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

여기서, 표준화된 프로토콜은 분자 수준에서 RT-qPCR을 이용하여, 세포 수준에서 형광 기자, 유기체 수준에서의 열회수를 사용하여 Caenorhabditis elegans에서 열 충격 반응(HSR)의 유도를 평가하기 위해 제시된다.

Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 RNAi 유도 침묵 및 관련 염색질 변형의 후성유전학적 유전을 연구하기 위한 RNA 간섭 및 ChIP 분석을 설명합니다.

형광 리포터 및 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)를 사용한 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 세대 간 후성유전학적 유전 분석

배우세요 C. elegans에서 RNAi와 열 충격을 이용한 생식세포-신경세포 재프로그래밍 방법을. CHE-1 과발현과 LIN-53 저해로 세포 운명 전환 메커니즘을 연구하고 재생의학에 활용할 수 있습니다.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

더 많은 동영상 탐색