꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

이 기술의 전반적인 목표는 고처리량 분석에서 모델 유기체 C.elegans에 대한 다양한 화합물의 효과를 테스트하는 것입니다. 이 방법은 화학, 생물학 및 노화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 특정 화학 구조가 예쁜꼬마선충의 수명을 연장합니까? 이 기술의 주요 장점은 시간 효율적이고 빠른 방식으로 수많은 화합물을 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

많은 수의 벌레 생산을 위해 대량 배양 플레이트를 준비하려면 층류 캐비닛에서 먼저 섭씨 60도의 선충 성장 배지 30ml를 10cm 배양 플레이트에 분배하여 하룻밤 동안 응고시킵니다. 다음 날 아침, 각 플레이트에 2ml의 농축 대장균을 넣고 플레이트를 기울이고 회전시켜 플레이트 표면 전체에 박테리아를 완전히 퍼뜨립니다. 대량 배양 플레이트가 건조되면 최대 2주 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.

스크리닝을 위해 고처리량 분석 배양 플레이트를 준비하려면 자동화된 8채널 디스펜서를 사용하여 0.15ml의 용융 선충 성장 배지 한천을 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 한천이 하룻밤 사이에 굳어지도록 합니다. 그런 다음 고처리량 분석 플레이트를 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관합니다.

예쁜꼬마선충 배양을 설정하려면 지렁이 픽과 해부 현미경을 사용하여 20개의 알을 각 질량 배양 플레이트에 옮기고 플레이트를 섭씨 20도에서 6일 동안 배양합니다. 7일째에는 해부 현미경을 사용하여 자궁에 난자가 있는지 육안으로 확인합니다. 임신한 성충을 채취하려면 유리 피펫을 사용하여 플레이트당 2-3ml의 S 기초 용액을 넣고 각 플레이트 주위를 손으로 휘젓습니다.

유리 피펫을 사용하여 웜을 15ml 튜브로 옮기고 원심분리로 웜을 펠릿화합니다. 10ml의 차아염소산염 용액에 웜을 다시 현탁시키고 5초 동안 튜브를 위아래로 빠르게 흔듭니다. 그런 다음 2.5분마다 흔들면서 실온에서 5분 동안 벌레를 배양합니다.

배양이 끝나면 벌레를 다시 원심 분리하십시오. 펠릿은 황갈색이어야 합니다. 상층액을 10ml의 새 차아염소산염 용액으로 교체하고 튜브를 다시 세게 흔듭니다.

가끔 흔들면서 1-3분 더 벌레를 배양합니다. 난자만 남으면 튜브를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 펠릿은 갈색이 아닌 흰색이어야 합니다.

멸균 기술을 사용하여 멸균 층류 캐비닛의 튜브를 열고 각 펠릿에 14ml의 S 기저 용액을 추가합니다. 펠릿을 14ml의 S Basal로 세 번 세척합니다. 원심분리로 세 번 씻은 후 2-3ml의 신선한 S 기초 용액에 계란을 다시 현탁시킵니다.

L1 단계 유충 C.elegans를 준비하려면 상등액을 튜브당 하나의 멸균 유리 페트리 접시에 옮기고 2-3밀리리터의 S 기초 용액을 사용하여 튜브의 나머지 난자를 각 접시에 헹굽니다. 각 접시에 5ml의 S 기초 용액을 첨가하여 붐비는 것을 완화하고 접시를 섭씨 20도 및 20rpm의 궤도 셰이커에 16-24시간 동안 올려 부화를 촉진합니다. 모든 부화한 새끼는 먹이 부족으로 인해 첫 번째 유충 단계에서 체포됩니다.

혈청학적 피펫을 사용하여 L1 유충을 15ml 튜브로 옮겨 원심분리합니다. 부화한 모든 L1이 반복적인 원심분리와 흡인을 통해 통합된 후, 유충 펠릿을 10ml의 멸균 S 기초 용액으로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 10 마이크로 리터를 파종되지 않은 플레이트로 옮기고 플레이트에 존재하는 유충의 수를 계산합니다.

이 작업을 10회 반복하여 용액에서 L1의 평균 밀도를 구합니다. 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 L1을 포함하는 용액의 총 부피를 측정합니다. 다음으로, L1 솔루션의 부피와 솔루션의 L1 밀도를 사용하여 솔루션에 존재하는 총 L1 수를 계산합니다.

96웰 고처리량 분석 플레이트에 기생충을 플레이트화하려면 적당히 느리게 회전하는 교반 막대가 장착된 멸균된 원형 배지 병에 L1 현탁액을 마이크로리터당 L1 유충 1개로 희석하고 분석 플레이트를 실온으로 예열합니다. 다음으로, 층류 캐비닛에서 각 웰에 5마이크로리터의 농축 E.coli를 추가한 다음 웰당 10마이크로리터의 L1 현탁액을 추가하여 웰당 평균 10개의 웜을 생성합니다. 모든 벌레가 플레이트를 덮고 섭씨 25도에서 이틀 동안 벌레를 부화시켜 유충이 성충으로 성장할 수 있도록 합니다.

배양이 끝나면 화학 라이브러리 플레이트를 동결에서 실온으로 가져옵니다. 사용 직전에 마이크로플레이트 셰이커에서 60rpm으로 해동된 플레이트를 1분 동안 부드럽게 흔듭니다. 자동화된 96웰 리퀴드 핸들러를 사용하여 라이브러리 플레이트에서 분석 플레이트로 0.75마이크로리터의 화합물을 이송합니다.

모든 웰이 처리되면 층류 캐비닛의 플레이트 표면에서 화합물을 4-8시간 동안 자연 건조하고 건조되는 즉시 개별 플레이트를 제거합니다. 건조된 접시를 투명 필름으로 밀봉하고 뚜껑을 덮습니다. 그런 다음 1000G에서 45초 동안 플레이트를 회전시키고 섭씨 25도에서 거꾸로 된 위치에 보관하십시오.

관심 화합물에 대한 예쁜꼬마선충의 반응을 테스트하기 위해 음성 대조판을 사용하여 대조 동물의 95%가 죽을 때까지 총 생존 점수를 매길 수 있으며, 이 시점에서 모든 테스트 플레이트에 점수를 매길 수 있습니다. 예를 들어, 이 연구에서는 179개 화합물의 재검사 라이브러리에서 57개의 적중이 관찰되었으며, 이는 재검사 화학 물질의 32%가 총 양성 반응을 보였음을 보여줍니다. 음성 대조군 및 테스트 우물에 대한 평균 활성 백분율 점수의 비닝은 테스트 우물이 대조군 우물보다 성능이 우수하다는 것을 나타냅니다.

테스트 화합물의 50 마이크로 몰 및 100 마이크로 몰 농도가 사용 된이 대표적인 테스트 분석에서 입증 된 바와 같이 소규모 스크리닝도 수행 할 수 있습니다. 음성 대조군 처리 동물의 99% 이상이 죽었을 때 이러한 소형 스크린 분석 테스트 플레이트를 다시 채점한 결과, 양성 대조군 웰이 음성 대조군보다 약간 더 나은 성능을 보였다는 점에서 양성 대조군 웰이 음성 대조군 및 테스트 웰보다 훨씬 우수한 성능을 보였음을 나타냅니다. 이 실험에서 후자의 결과는 많은 테스트 웰이 대조군 처리에 비해 독성을 나타내는 것으로 보인다는 표시에 의해 편향되어 이러한 간단한 해석을 혼란스럽게 했습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2-4주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 분석 플레이트의 무결성을 유지하고 사용하기 전에 깨끗한 상태인지 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술에 따라 이러한 화합물 중 어떤 것이 mytophagy를 유도합니까?

mytophagy 분석의 경우 mytophagy 리포터 가닥이 사용됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 예쁜꼬마선충을 모델 유기체로 사용하여 고처리량 화학 스크리닝을 수행하는 방법에 대한 좋은 아이디어를 얻을 수 있을 것입니다.