신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 in vivo 대사 라벨링과 매크로어레이 분석을 결합하여 생물학적 샘플에서 모든 전달 RNA의 세포 수준을 동시에 측정하는 것입니다. 운반 RNA는 오랫동안 조절 기능이 부족한 하우스키핑 분자로 간주되었습니다. 그러나 점점 더 많은 증거가 세포 tRNA 수준이 세포 유형, 환경 및 스트레스와 같은 다양한 조건에 반응하여 변동한다는 것을 나타냅니다.

tRNA 발현의 변동은 유전자 번역에 직접적인 영향을 미치며, 특정 단백질의 발현을 선호하거나 억제합니다. 단백질 합성의 역학을 이해하려면 고품질 tRNA 프로파일을 제공할 수 있는 방법이 필요합니다. 여기에서는 실험실에서 배양한 유기체에서 전달 RNA 수준을 빠르고 정확하게 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있고 간단한 기술을 제시합니다.

시작하려면 18게이지 바늘로 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 캡 중앙에 단일 구멍을 뚫어 적절한 통기를 허용합니다. 그런 다음 하룻밤 종균 배양에서 추출한 5마이크로리터의 Mycobacterium smegmatis를 사용하여 500마이크로리터의 멸균 7H9 육수를 접종합니다. 표준 방사선 보호 관행에 따라 phosphorus-32-labeled orthophosphate 1ml당 20마이크로큐리로 배양 배지를 스파이크합니다.

섭씨 37도에서 1, 200rpm으로 9mm 두께의 아크릴 보호막 뒤에 놓인 셰이커 인큐베이터에서 박테리아를 성장시킵니다. midlog 단계에, 전체 배양물을 2 밀리리터 나사 모자 관으로 옮기고, 10, 000 시간 중력에 2 분 동안 원심 분리해서 실내 온도에 방사성 박테리아를 펠릿으로 만든다. 비혼입 방사성 오르토인산염을 함유한 상층액을 적절한 폐기물 용기에 모으십시오.

총 RNA를 준비하려면 1ml의 상용 RNA 추출 시약과 약 200마이크로리터의 유리 구슬을 펠릿에 추가합니다. 튜브를 단단히 덮고 2분 동안 최대한의 교반으로 균질기의 박테리아를 파괴합니다. 12의, 000배 중력 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 표본을 분리기로 만드십시오.

그런 다음 상층액을 새 2mm 튜브로 옮기고 비드를 적절하게 폐기합니다. 클로로포름 0.2ml를 넣고 15초 동안 손으로 튜브를 세게 흔듭니다. 다음, 15 분 동안 12의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기

튜브를 45도로 비스듬히 기울여 샘플의 수성상을 새 튜브에 수집합니다. 계면 또는 유기 레이어를 그리지 마십시오. 2 마이크로 리터의 유색 침전제와 0.5 밀리리터의 100 % 이소프로판올을 수성상에 첨가합니다.

튜브를 손으로 5초 동안 세게 흔든 다음 다시 원심분리합니다. 튜브에서 상등액을 제거하고 액체 분획에 미량의 방사능이 포함될 수 있으므로 적절하게 폐기하십시오. 그런 다음 펠릿을 5 분 동안 공기 건조 한 후 부피 SDS 당 0.1 % 중량으로 2X SSC의 200 마이크로 리터에 재현탁시킵니다.

게놈 tRNA 데이터베이스를 사용하여 먼저 tRNA 염기서열 또는 tRNA 인코딩 유전자를 검색하여 DNA 프로브를 설계합니다. 인코딩된 경우 보존된 3-프라임 말단 CCA를 트리밍하고 역보체를 생성한 후 처음 70개의 뉴클레오티드를 기반으로 프로브를 주문합니다. 어레이 인쇄를 수행하려면 96웰 플레이트를 실온에서 해동합니다.

다이아몬드 펜으로 아민 코팅된 유리 슬라이드에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 슬라이드를 인덱싱 단위에 배치합니다. 그리드 배치를 따라 복제기 핀을 우물에 조심스럽게 담그십시오.

최소한의 압력을 사용하여 유리 슬라이드에 어레이를 부드럽게 인쇄합니다. 블록 A.It 작업이 완료될 때까지 어레이어를 청소하지 않고 인쇄를 계속하려면 일관되게 인쇄하려면 약간의 연습이 필요합니다. 세션당 8개에서 10개 이하의 배열을 인쇄하는 것이 좋습니다.

배열당 10분에서 15분까지 계산합니다. 인쇄 패턴 순서를 놓치기 쉽기 때문에 작업에 모든 주의를 기울이고 모든 방해 요소를 끄십시오. 다음 블록으로 이동할 준비가 되면 리플리케이터를 5% 표백제에 담그고 부드럽게 흔듭니다.

리플리케이터를 흡수성 종이에 밀어 넣습니다. 그런 다음 복제기를 증류수에 담그고 부드럽게 흔든 다음 종이에 누릅니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.

다음으로, 복제기를 이소프로판올에 담그고 부드럽게 흔든 다음 종이에 밀어 넣습니다. 96웰 플레이트의 다음 블록으로 이동하기 전에 팬에서 복제기를 약 20초 동안 건조시킵니다. 원하는 인쇄 횟수까지 계속합니다.

그런 다음 슬라이드를 건조시킵니다. 건조된 슬라이드를 254나노미터 UV 가교제의 깨끗한 표면에 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 에너지 수준을 999, 제곱센티미터당 990마이크로줄로 설정한 다음 시작을 누릅니다.

어레이를 450ml의 차단 용액으로 옮기고 밤새 천천히 교반하면서 자석 교반기로 실온에서 배양합니다. 실온에서 500ml의 증류수로 슬라이드를 각각 5분씩 두 번씩 세척합니다. 마이크로어레이 원심분리기에서 10초 동안 실온에서 원심분리하여 슬라이드를 건조시킵니다.

어레이를 건조하고 어두운 곳에 최대 6개월 동안 보관하십시오. 혼성화하기 전에 슬라이드를 끓는 물에 헹구고 원심분리로 건조시킵니다. 어레이를 혼성화 카세트 내부에 배치하고 방사성 표지된 RNA 샘플을 로드합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 최대 재현성을 위해 자동화된 hybridization-washing station에서 샘플을 실행합니다. 실행이 끝나면 원심 분리로 슬라이드를 건조시킵니다. 슬라이드를 얇은 플라스틱으로 감쌉니다.

그런 다음 가장 민감한 설정에서 가이거 계수기를 사용하여 슬라이드에 방사성 신호가 있는지 확인합니다. 신호 강도에 따라 10-90시간 동안 실온에서 노출 카세트의 저장 형광체 스크린에 슬라이드를 노출합니다. 몇 시간에서 며칠까지 지속될 수 있는 노출 시간은 어레이 신호에 직접적으로 의존합니다.

가이거 계수기의 카운트를 노출 시간으로 변환하려면 약간의 연습이 필요합니다. 인광광을 사용하여 50마이크로미터 해상도로 슬라이드를 스캔합니다. 마이크로어레이 프로파일러로 업그레이드된 무료 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 프로브 스폿에서 방사능 강도를 정량화하고 배경 빼기를 할 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 히트 맵을 생성합니다. 여기에 표시된 것은 스캔된 박테리아, 마우스 및 인간 매크로어레이입니다. M.smegmatis 어레이는 마우스와 인간에 사용되는 48개 프로브 대신 43개의 프로브만 사용합니다.

그 결과, 박테리아 배열은 배경과 혼합된 40개의 빈 반점을 표시합니다. 세 가지 독립적인 생물학적 복제는 테스트된 성장 조건에서 모든 M.smegmatis tRNA가 백그라운드 수준 이상으로 발현됨을 보여줍니다. 이 특정 실험에서 각 프로브에 대해 관찰된 표준 편차는 2%아르기닌 TCT와 22% 시스테인 GCA 사이이며 중앙값은 5%입니다. 또한 이 실험은 tRNA 동소수용체의 발현이 균일하지 않음을 보여줍니다.

예를 들어, 모든 알라닌 동수용체는 비슷한 수준으로 발현되는 반면, 가장 높은 아르기닌 수용 tRNA와 가장 낮은 아르기닌 수용 tRNA는 3배 차이가 있습니다. 이 기술을 마스터하면 적절하게 수행되고 스폿 신호가 적절하다면 약 24시간 내에 완료할 수 있습니다. 당사의 방법은 프로브 설계에 게놈을 사용할 수 있는 모든 유기체에 적용할 수 있습니다.

in vitro에서 성장한 모델 유기체는 대사 라벨링에 이상적인 후보입니다. 여기에 제시된 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis에 최적화되어 있지만 E.coli, 효모, 마우스 및 인간 배양 세포에서 tRNA를 프로파일링하는 데에도 성공적으로 사용되었습니다. 우리의 기술은 재현 가능하고 구체적입니다.

넓은 동적 범위와 쉽게 조정할 수 있는 임계값을 통해 어레이 노출 시간을 연장하여 폴리솜과 관련된 tRNA와 같은 소량의 풍부한 종을 프로파일링할