Name: 신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 학습하세요 생체 내 신진 대사 라벨링과 매크로어레이 분석을 결합한 tRNA 프로파일링 방법을. Mycobacterium smegmatis 등 다양한 생물체에서 24시간 이내에 모든 전송 RNA 수준을 동시에 정량화할 수 있습니다.

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이 작업을 지원 했다 사우스 캐롤라이나 INBRE 교부 금에서 국립 연구소의 종합 의료 과학-NIH에 의해 (립에 P20GM103499) 국립 암 연구소에서 P.H.H. CA555536 및 CA154664를 부여 이 프로그램 지원 부분에서 전 대학 & 학부 과학 교육 프로그램을 통해 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 차 알 스턴의 대학에 교부 금에 의해 그리고 국립 센터에서 교부 금에 의해 연구 자원 (P20 RR016461 5) 그리고 국립 연구소의 일반 의료 과학 (8 P20 GM103499) 건강의 국가 학회에서.

1. 문화 및 대사 라벨
<ol><li>적절 한 환기를 허용 하도록 18 게이지 바늘 한 번 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브의 뚜껑의 중심 찌른. 보충된 살 균 7 H 9의 500 µ L를 접종 선발에서 M. smegmatis 의 5 µ L로 국물 문화 성장된 하룻밤12. 참고: 7 H 9의 1 리터에 대 한 제조 법 국물은: 4.7 g 상업 7 H 9 분말, 2 mL 글리세롤, 1 mL 트윈 80, 0.85 g NaCl, 5 g 알 부 민, 2 g 포도 당, H2O (1 l 총 볼륨 려).<ol>
<li>
(주의) 표준 radioprotection 관행에 따라 스파이크 [32P] 나2HPO420 µCi/mL와 함께 문화 미디어. 9 m m 두꺼운 아크릴 방패 뒤에 흔드는 인큐베이터에서 37 ° C와 1200 rpm 동요에서 박테리아 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Midlog 단계 (O.D.600 nm ~ 0.5)에서 전체 문화 2 mL 스크류 캡 튜브에 전송과 centrifuging 여 실 온에서 방사성 박테리아 작은 공의 10000 x g. 2 분 수집 표면에 뜨는 포함 비법 인된 방사성 orthophosphate에 대 한 적절 한 폐기물 컨테이너입니다.</li>
</ol>2입니다. 총 RNAs의 준비
참고: 총 RNAs (guanidinium 안산, 페 놀, 클로 프롬 포함) 상업적인 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 세균성 알갱이에서 추출 제조 업체의 프로토콜을 따르고.
<ol><li>상업적인 RNA 추출 시 약의 1 mL 및 펠 릿에 유리 구슬의 약 200 µ L를 추가 합니다. 튜브를 안전 하 게 뚜껑과 최대 교 반, 아래 2 분 동안 균질 화기에 박테리아를 방해 (번호 5 선택한 악기에 설정 ( 재료의 표참조)).</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 샘플 새로운 2 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬을 적절 하 게 삭제. 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 하 고 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 15 s. 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어</li>
	<li>낚시 튜브 45 °에 의해 새로운 관으로 샘플의 수성 단계를 수집 합니다. Interphase 또는 유기 레이어 그리기 하지 마십시오. 2 컬러 비례적의 µ L, 100% 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에 5 미 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어</li>
	<li>상쾌한 튜브에서 제거 하 고 적절 하 게 폐기 액체 분수 방사능의 흔적을 포함 수 있습니다. 공기 건조 펠 렛 5 분 후 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 0.1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 마지막 X 2의 200 µ L에서 resuspend. 참고: 구성 주식 20 X SSC는 3.0 M NaCl, 0.3 M 나트륨 구 연산 염, pH 7.0.</li>
</ol>3입니다. 96 잘 프린터 접시의 준비
참고: tRNA microarrays 40 2 70-메 르 DNA oligonucleotides 8 핀 arrayer를 사용 하 여 각 M. smegmatis tRNA (터미널 CCA 제외)의 3' 끝에 보완 수동으로 인쇄 됩니다. DNA oligonucleotide 조사 잘 판에 배열 프로브 레이아웃의 시퀀스 제공 됩니다 (추가 파일 1-시트 1 ~ 3 각각).
<ol><li>디자인 DNA 프로브 검색 첫 번째 tRNA 시퀀스 또는 tRNA 인코딩 유전자 게놈 tRNA 등 tRNA 데이터베이스에서 데이터베이스13제공 합니다. 트림 보존 3' 끝 CCA 인코딩된 경우입니다. 보완 결과 시퀀스를 역방향. 주문 조사 처음 70 뉴클레오티드에 따라입니다.</li>
	<li>Resuspend는 DNA 프로브 물에 건조. 100 µ m 프로브 농도 조정 합니다. 96 잘 접시에서 3 X SSC, 0.01% (w/v) SDS 최종 (희석 60 µ L에 개별 잘 재고 프로브와 6 X SSC, 0.01% (w/v) SDS의 60 µ L에서에서 50 µ M oligos의 120 µ L를 준비.</li>
	<li>증발 또는 오염 방지 즉시 동결 하 고, 필요할 때까지-20 ° C에서 유지 하도록 깡통 호 일 접시 커버.</li>
</ol>4. 배열 인쇄
<ol><li>상 온 (약 20 분 소요)에서 96 잘 접시 녹여</li>
	<li>다이아몬드 펜 아민 코팅 유리 슬라이드 레이블. 슬라이드 인덱싱 장치에 놓습니다. 그리드 배치를 수행 하 고 다음과 같이 할.<ol>
<li>신중 하 게 우물에 복제기 핀 수영.</li>
		<li>부드럽게 인쇄 (작은 저항을 느낄 것 이다) 최소한의 압력을 사용 하 여 유리 슬라이드에 배열. Arrayer 블록 a 완료 될 때까지 청소 하지 않고 인쇄를 계속</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 블록을 이동할 준비를 하는 경우 아래 설명 된 세척 절차를 따릅니다.<ol>
<li>5% 표 백제에 복제기와 부드럽게 악수.</li>
		<li>흡수 성 종이에 복제기를 누릅니다.</li>
		<li>복제기는 증류수에 찍어 부드럽게 흔들, 하 고 종이에 누릅니다. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>소 프로 파 놀에 복제기, 부드럽게 흔들어와 종이에 눌러.</li>
		<li>건조 한 약 20 팬에 복제기 96 잘 접시의 다음 블록을 이동 하기 전에 s. 인쇄의 원하는 번호를 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>건조 후 crosslink 254 nm UV crosslinker를 사용 하 여 슬라이드에 oligos 슬라이드 수 있습니다.<ol>
<li>999,990 µ / c m2에 에너지 레벨을 설정 합니다.</li>
		<li>crosslinker에 깨끗 한 표면에 슬라이드 얼굴을 올려. "시작"을 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차단 차단 솔루션 자력, 실내 온도에 그리고 느린 동요의 밑에 450 mL에서 하룻밤 배열. 수집 및 재사용 차단 솔루션 최대 4 배. 참고: 차단 솔루션에 대 한 제조 법은: 125 m m 인산 버퍼 (NaH2포4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25 %SDS (w/v), 0.5 m m EDTA, 0.5 X SSC, 1 %BSA (w/v).</li>
	<li>500 mL의 증류수에 실 온에서 2 시간 5 분 대 한 슬라이드를 씻어. 슬라이드 10 centrifuging 여 건조 실내 온도 microarray 원심 분리기 s. 최대 6 개월까지 건조 하 고 어두운 장소에서 저장소 배열입니다.</li>
</ol>5. 배열 교 잡
<ol><li>교 잡 하기 전에 끓는 물에 슬라이드를 헹 구 고 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.</li>
	<li>교 잡 카세트 안에 배열을 놓고 방사선된 RNA 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>최대 재현성에 대 한 자동화 된 세척 교 잡 역을 실행 합니다.<ol>
<li>다음으로 프로그램 단계입니다. 75 ° c.에서 2 분에 대 한 조건 가스 켓 60 ° c.에 프로브를 소개 프로브 및 샘플 90 ° c.에서 5 분 변성 60 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 교배<ol>
<li>20 두 번 0.1 X SSC, 0.1 %SDS, 흐름 10 s와 42 ° C에 세척 슬라이드 s. 누르고 0.1로 두 번 42 ° C에서 20 미 세척 슬라이드 슬라이드 2 X SSC, 0.1% (w/v) SDS 흐름 10 s로 두 번 50 ° C에 세척 누르고 X SSC 흐름 10 s와 홀드 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.</li>
</ol>6. 배열 정량화
<ol><li>얇은 플라스틱 필름을 사용 하 여 슬라이드를 감싸 줍니다. 그것의 가장 중요 한 설정에가 거 카운터를 사용 하 여 방사성 신호에 대 한 슬라이드를 확인 합니다. 신호 강도 따라 10 ~ 90 h에 대 한 실내 온도에 노출 카세트에 저장 인광 체 스크린에 슬라이드를 표시 합니다. 참고:가 거 카운터의 감도 다른 하나의 장비에서 다, 노출 시간 낙관 되어야 한다 실험적으로.</li>
	<li>50 µ m 해상도 phosphorimager를 사용 하 여 슬라이드를 검사 합니다. 계량 하 고 배경 빼기 microarray 프로파일러와 함께 업그레이드 무료 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 각 조사 현장에서 방사능 농도.</li>
	<li>구성 하 고 전자 스프레드 시트를 사용 하 여 데이터를 처리 합니다. 조건부 서식 도구를 사용 하 여 열 맵을 생성 합니다. 대표 예 각 프로브 신호 (‰로 표현) 부분으로 총 프로브 신호.</li>
</ol>

<ol><li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221(2006).</li>
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<li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOt%3A+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939(2017).</li>
<li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%2C+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042(2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-%CE%B2-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li>
<li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li>
<li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GtRNAdb%3A+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li>
<li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언.

그러나 베타 입자 배출 시험된 범위에 방사선 셀 체력에 큰 영향을 주지 않습니다 bacteriostatic 및 살 균 에이전트14,으로 알려져 있습니다. 섬광 계산 보여주었다 방사능의 총 세포 추출 물 25% 및 그 후, 정제 총 RNAs의 1%에 통합 됩니다.
프로브 동일한 크기, 비교 용융 온도 및 GC 콘텐츠, macroarray 안보에 대 한 균일 한 프로토콜 함께 교 잡 및 정량화 자리 신호에서 직접 tRNA 레벨의 편견된 측정에 대 한 수 있습니다.
재현할 수 및 특정입니다. 그것의 넓은 동적 범위와 쉽게 조정 가능한 임계값 낮은 풍부한 종, tRNAs 배열 노출 시간9연장 하면 polysomes, 연관 프로 파일링 수 있습니다. 필요한 장비에 대 한 초기 투자 후 샘플, 소모품를 포함 하 여 당 비용 실행 샘플 당 $15를 평균 한다.
자리는 누구의 게놈은 프로브 디자인에 사용할 수 있는 모든 유기 체에 적용 됩니다. 생체 외에서 재배 되는 모델 생물 대사 라벨에 대 한 이상적인 후보자 이다. 포유류 게놈 종종 많은 isodecoders (동일한 anticodons를 공유 하지만 그들의 몸 시퀀스에서 작은 차이 표시 tRNAs) 인코딩으로 프로브 가까운 tRNA의 동종 하이브리드를 보존 하기 위해 부분적으로 퇴 화 될 필요가 있다. 마지막으로, 부착 포유류 세포에 M. smegmatis, 같은 문화 실질적으로 확장 될 필요가 성장 하는 유기 체에 비해 총 RNA의 일반적으로 낮은 금액을 산출 한다.

세포질 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스1,2,3등 조건에 따라 변동. 자리, tRNA, 관찰을 위한 효율적인 플랫폼 이며 원본, 신뢰할 수 있는, 실험실 성장 유기 체에서 전송 RNA 레벨의 신속 하 고 정확한 정량화를 허용 하는 간단 기술.
tRNAs 있다 현저 하 게 안정 된 2 차 및 3 차 구조4. 그들은 또한 수많은 post-transcriptional 수정5를 표시합니다. 이러한 기능은 중요 한 구조 및 시퀀스 검문소 바이어 싱 또는 때로는 직접적이 고 재현 tRNA 표준 벤치 마크 RNA 정량화 기법6을 사용 하 여 프로 파일링 방지를 나타냅니다. 전 세계 연구 단체 세포질 tRNA 수준을 평가 하 창조적인 하지만 종종 복잡 한 기술을 개발 하도록 강요 했다. 이러한 방법 중 일부를 포함: (1) 2 차원 전기 이동 별거 metabolically 레이블이 tRNAs의 조직적 자리 배정 북부 오 점1;에 의해 결합 (북부 여 2) 개별 정량화 되 신중 하 게 표준화 된 방사성 DNA 프로브7;를 사용 하 여 리 (microarray 분석3, 그리고 (4) 생체 외에서 의 tRNA 수정 반전 녹음 방송 결합 및 후속 재조합 demodification 효소를 사용 하 여 스트립 다음 cyanine 형광와 라벨 3) 게시물 추출 높 처리량 연속8.
자리는 2 개의 표준 및 간단 접근의 간단 하 고 원래의 조합: (1) RNA 몸, 성장 하는 유기 체, 방사성 총 RNAs tRNA (2) macroarrays, 체계적이 고 소형 게놈 도구의 합성에서으로 구성 된 tRNA 분리에 대 한 최적화.
샘플은 정량화 플랫폼에 살아있는 유기 체에서 간소화 됩니다. 그들은 직접 추출 후 분석 하 고 어떤 더 크게 증폭 후 추출 또는 효소 치료 기법에 비해 편견 제한 처리 되지 않습니다. 자리는 다양 하 고 식별 하 고 물리적으로 연결 된 리보솜 번역 tRNA 모집단 계량 polysome 분별에 쉽게 결합 될 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜은 진 균 smegmatis, 최적화 되어 있으며 그것은 또한 성공적으로 대장균9, Saccharomyces cerevisiae10, 마우스, 그리고 인간의 세포 배양11 프로필 tRNAs에 사용 되었다 .

<table><tbody><tr><td>유리 슬라이드 인덱싱 시스템</td><td>V& P 사이언티픽, Inc.</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드 어레이 리플리케이터</td><td>V& P 사이언티픽, Inc.</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96웰 마이크로플레이트 인덱싱 시스템</td><td>V& P 사이언티픽, Inc.</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>세척 및 블롯 스테이션</td><td>V& P 사이언티픽, Inc.</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>리플리케이터 핀 드라이어</td><td>V& P 사이언티픽, Inc.</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>아민 코팅 슬라이드</td><td>Molecular Devices</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드라이저 / 자동 하이브리드화 및 세척 스테이션</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>셰이커 인큐베이터</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>나사 캡 2 ml 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr><tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEX011001MC</tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 유리 구슬</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>미니 비즈 밀</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>스토리지 인광 스크린</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>인광광,</td><td>GE 헬스케어</td><td>태풍 FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>DNA 올리고뉴클레오티드</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>Select series 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>Microarray centrifuge</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>일회용 바늘</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>2ml 원심분리기 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>침전제(GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 육수</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔 화학 물질</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>피셔 화학 물질</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 카세트</td><td>GE 헬스케어</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>트윈 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>알부민</td><td>스펙트럼 화학 물질</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)</td> <td>Fisher 생물 시약</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M 인산염 완충액 pH 7.2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

신진 대사 라벨 및 macroarrays를 사용 하 여 전송 rnas의 프로 파일링

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

전송 RNAs (tRNA)는 풍부한 짧은 비 코딩 RNA 종 일반적으로 76 ~ 90 뉴클레오티드 길이에서. tRNAs는 codons mRNA에 아미노산으로 변환 하 여 직접 단백질 합성에 대 한 책임이 있습니다. tRNAs 했다 긴 집 유지 분자 규제 기능 부족으로 간주 됩니다. 그러나, 증거의 성장 몸은 셀룰러 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스 등 다양 한 조건에 대응에 변동 나타냅니다. TRNA 식의 변동 진 번역을, 선호 또는 특정 단백질의 식을 억압에 직접 영향을 줍니다. 궁극적으로 단백질 합성의 동적 이해 높은-품질 tRNA 프로필을 제공할 수 있는 방법의 개발을 필요 합니다. 우리가 여기에 제시 하는 방법 자리 관찰 tRNA를 위한 간소화 된 플랫폼에 대 한 의미 하는 이름입니다. 자리 방사성 orthophosphate, guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 방사성 총 RNAs의 뒤와 세포 배양의 대사 라벨로 시작 하는 3 단계 구성 하 고 마지막으로 사내에 교 잡 인쇄 macroarrays입니다. tRNA 레벨은 각 조사 현장에서 방사능 농도 측정 하 여 견적 된다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리는 진 균 smegmatis mc2155, 결핵 연구에 모델 생물으로 자주 사용 nonpathogenic 박테리아에에서 tRNAs 프로필입니다.

3 개의 독립적인 생물 복제 쇼, 테스트 성장 조건, 모든 M. smegmatis tRNAs 배경 수준 (그림 1) 위에 표시 됩니다. 이 특정 실험에서 관찰 된 표준 편차 각 프로브에 대 한 2% (Arg (TCT)) 및 5% (그림 1)에서 평균 22% (Cys (GCA)) 사이 구성 됩니다. 복제 사이의 허위 변경 배열 준비 및 교 잡 같은 요인에 의해 크게 좌우 된다. 높은 재현성은 샘플 교 잡 자동화 뿐만 아니라 신중 하 고 일관성 있는 배열 인쇄를 통해 이루어집니다. TRNA 사이의 5 차이 Ile (GAT) 및 tRNA (발 (전술), 높고 낮은 풍부한 종 각각. 자리는 tRNA isoacceptors의 표현 유니폼을 보여줍니다. Isoacceptors는 동일한 아미노산을 개최 하지만 다른 anticodon 시퀀스를 표시 하 고 따라서 mRNAs에 다른 codons를 디코딩 종입니다. 반면 모든 알라닌 isoacceptors 비슷한 수준에서 표시 됩니다 예를 들어 수락 tRNAs 3-fold 다른 최고 및 최저 아르기닌.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> 그림 1: 대표적인 tRNA macroarray 결과. (A) Scanned 박테리아, 마우스 및 인간의 macroarrays M. smegmatis 배열 마우스 및 인간의 48 대신만 43 프로브를 사용합니다. 결과적으로, 세균성 배열 40 빈 관광 명소 (프로브는 각 배열에 8 번 복제 됩니다) 그 배경과 조화를 표시 합니다. 그들의 대부분 왼쪽된 상단 클러스터링 됩니다. 최적의 성장 조건 하에서 M. smegmatis 에 tRNA 프로필의 (B) 히스토그램 및 heatmap 표현. 프로브 신호 (를 포함 하 여 세균 성장, 신진 대사 라벨, 추출 및 배열 교 잡) 3 개의 독립적인 실험의 평균 이며, 총 tRNAs의 천 값에 의하여 표현 됩니다. 3 복제에 대 한 표준 편차는 각각 오차 막대와 막대 그래프와 heatmap에 오렌지의 음영으로 표시 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

이 절차의 전반적인 목표는 in vivo 대사 라벨링과 매크로어레이 분석을 결합하여 생물학적 샘플에서 모든 전달 RNA의 세포 수준을 동시에 측정하는 것입니다. 운반 RNA는 오랫동안 조절 기능이 부족한 하우스키핑 분자로 간주되었습니다. 그러나 점점 더 많은 증거가 세포 tRNA 수준이 세포 유형, 환경 및 스트레스와 같은 다양한 조건에 반응하여 변동한다는 것을 나타냅니다.tRNA 발현의 변동은 유전자 번역에 직접적인 영향을 미치며, 특정 단백질의 발현을 선호하거나 억제합니다. 단백질 합성의 역학을 이해하려면 고품질 tRNA 프로파일을 제공할 수 있는 방법이 필요합니다. 여기에서는 실험실에서 배양한 유기체에서 전달 RNA 수준을 빠르고 정확하게 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있고 간단한 기술을 제시합니다.시작하려면 18게이지 바늘로 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 캡 중앙에 단일 구멍을 뚫어 적절한 통기를 허용합니다. 그런 다음 하룻밤 종균 배양에서 추출한 5마이크로리터의 Mycobacterium smegmatis를 사용하여 500마이크로리터의 멸균 7H9 육수를 접종합니다. 표준 방사선 보호 관행에 따라 phosphorus-32-labeled orthophosphate 1ml당 20마이크로큐리로 배양 배지를 스파이크합니다.섭씨 37도에서 1, 200rpm으로 9mm 두께의 아크릴 보호막 뒤에 놓인 셰이커 인큐베이터에서 박테리아를 성장시킵니다. midlog 단계에, 전체 배양물을 2 밀리리터 나사 모자 관으로 옮기고, 10, 000 시간 중력에 2 분 동안 원심 분리해서 실내 온도에 방사성 박테리아를 펠릿으로 만든다. 비혼입 방사성 오르토인산염을 함유한 상층액을 적절한 폐기물 용기에 모으십시오.총 RNA를 준비하려면 1ml의 상용 RNA 추출 시약과 약 200마이크로리터의 유리 구슬을 펠릿에 추가합니다. 튜브를 단단히 덮고 2분 동안 최대한의 교반으로 균질기의 박테리아를 파괴합니다. 12의, 000배 중력 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 표본을 분리기로 만드십시오.그런 다음 상층액을 새 2mm 튜브로 옮기고 비드를 적절하게 폐기합니다. 클로로포름 0.2ml를 넣고 15초 동안 손으로 튜브를 세게 흔듭니다. 다음, 15 분 동안 12의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기.튜브를 45도로 비스듬히 기울여 샘플의 수성상을 새 튜브에 수집합니다. 계면 또는 유기 레이어를 그리지 마십시오. 2 마이크로 리터의 유색 침전제와 0.5 밀리리터의 100 % 이소프로판올을 수성상에 첨가합니다.튜브를 손으로 5초 동안 세게 흔든 다음 다시 원심분리합니다. 튜브에서 상등액을 제거하고 액체 분획에 미량의 방사능이 포함될 수 있으므로 적절하게 폐기하십시오. 그런 다음 펠릿을 5 분 동안 공기 건조 한 후 부피 SDS 당 0.1 % 중량으로 2X SSC의 200 마이크로 리터에 재현탁시킵니다.게놈 tRNA 데이터베이스를 사용하여 먼저 tRNA 염기서열 또는 tRNA 인코딩 유전자를 검색하여 DNA 프로브를 설계합니다. 인코딩된 경우 보존된 3-프라임 말단 CCA를 트리밍하고 역보체를 생성한 후 처음 70개의 뉴클레오티드를 기반으로 프로브를 주문합니다. 어레이 인쇄를 수행하려면 96웰 플레이트를 실온에서 해동합니다.다이아몬드 펜으로 아민 코팅된 유리 슬라이드에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 슬라이드를 인덱싱 단위에 배치합니다. 그리드 배치를 따라 복제기 핀을 우물에 조심스럽게 담그십시오.최소한의 압력을 사용하여 유리 슬라이드에 어레이를 부드럽게 인쇄합니다. 블록 A.It 작업이 완료될 때까지 어레이어를 청소하지 않고 인쇄를 계속하려면 일관되게 인쇄하려면 약간의 연습이 필요합니다. 세션당 8개에서 10개 이하의 배열을 인쇄하는 것이 좋습니다.배열당 10분에서 15분까지 계산합니다. 인쇄 패턴 순서를 놓치기 쉽기 때문에 작업에 모든 주의를 기울이고 모든 방해 요소를 끄십시오. 다음 블록으로 이동할 준비가 되면 리플리케이터를 5% 표백제에 담그고 부드럽게 흔듭니다.리플리케이터를 흡수성 종이에 밀어 넣습니다. 그런 다음 복제기를 증류수에 담그고 부드럽게 흔든 다음 종이에 누릅니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.다음으로, 복제기를 이소프로판올에 담그고 부드럽게 흔든 다음 종이에 밀어 넣습니다. 96웰 플레이트의 다음 블록으로 이동하기 전에 팬에서 복제기를 약 20초 동안 건조시킵니다. 원하는 인쇄 횟수까지 계속합니다.그런 다음 슬라이드를 건조시킵니다. 건조된 슬라이드를 254나노미터 UV 가교제의 깨끗한 표면에 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 에너지 수준을 999, 제곱센티미터당 990마이크로줄로 설정한 다음 시작을 누릅니다.어레이를 450ml의 차단 용액으로 옮기고 밤새 천천히 교반하면서 자석 교반기로 실온에서 배양합니다. 실온에서 500ml의 증류수로 슬라이드를 각각 5분씩 두 번씩 세척합니다. 마이크로어레이 원심분리기에서 10초 동안 실온에서 원심분리하여 슬라이드를 건조시킵니다.어레이를 건조하고 어두운 곳에 최대 6개월 동안 보관하십시오. 혼성화하기 전에 슬라이드를 끓는 물에 헹구고 원심분리로 건조시킵니다. 어레이를 혼성화 카세트 내부에 배치하고 방사성 표지된 RNA 샘플을 로드합니다.텍스트 프로토콜에 따라 최대 재현성을 위해 자동화된 hybridization-washing station에서 샘플을 실행합니다. 실행이 끝나면 원심 분리로 슬라이드를 건조시킵니다. 슬라이드를 얇은 플라스틱으로 감쌉니다.그런 다음 가장 민감한 설정에서 가이거 계수기를 사용하여 슬라이드에 방사성 신호가 있는지 확인합니다. 신호 강도에 따라 10-90시간 동안 실온에서 노출 카세트의 저장 형광체 스크린에 슬라이드를 노출합니다. 몇 시간에서 며칠까지 지속될 수 있는 노출 시간은 어레이 신호에 직접적으로 의존합니다.가이거 계수기의 카운트를 노출 시간으로 변환하려면 약간의 연습이 필요합니다. 인광광을 사용하여 50마이크로미터 해상도로 슬라이드를 스캔합니다. 마이크로어레이 프로파일러로 업그레이드된 무료 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 프로브 스폿에서 방사능 강도를 정량화하고 배경 빼기를 할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 히트 맵을 생성합니다. 여기에 표시된 것은 스캔된 박테리아, 마우스 및 인간 매크로어레이입니다. M.smegmatis 어레이는 마우스와 인간에 사용되는 48개 프로브 대신 43개의 프로브만 사용합니다.그 결과, 박테리아 배열은 배경과 혼합된 40개의 빈 반점을 표시합니다. 세 가지 독립적인 생물학적 복제는 테스트된 성장 조건에서 모든 M.smegmatis tRNA가 백그라운드 수준 이상으로 발현됨을 보여줍니다. 이 특정 실험에서 각 프로브에 대해 관찰된 표준 편차는 2%아르기닌 TCT와 22% 시스테인 GCA 사이이며 중앙값은 5%입니다. 또한 이 실험은 tRNA 동소수용체의 발현이 균일하지 않음을 보여줍니다.예를 들어, 모든 알라닌 동수용체는 비슷한 수준으로 발현되는 반면, 가장 높은 아르기닌 수용 tRNA와 가장 낮은 아르기닌 수용 tRNA는 3배 차이가 있습니다. 이 기술을 마스터하면 적절하게 수행되고 스폿 신호가 적절하다면 약 24시간 내에 완료할 수 있습니다. 당사의 방법은 프로브 설계에 게놈을 사용할 수 있는 모든 유기체에 적용할 수 있습니다.in vitro에서 성장한 모델 유기체는 대사 라벨링에 이상적인 후보입니다. 여기에 제시된 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis에 최적화되어 있지만 E.coli, 효모, 마우스 및 인간 배양 세포에서 tRNA를 프로파일링하는 데에도 성공적으로 사용되었습니다. 우리의 기술은 재현 가능하고 구체적입니다.넓은 동적 범위와 쉽게 조정할 수 있는 임계값을 통해 어레이 노출 시간을 연장하여 폴리솜과 관련된 tRNA와 같은 소량의 풍부한 종을 프로파일링할 수 있습니다.

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