Ipecac의 위치인 문화 중 생 Auxin 및 시 토 키 닌의 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 ipecac에서 외래 새싹이 형성되는 동안 내인성 식물 호르몬 수치가 어떻게 변하는지 설명하는 것입니다. 이 방법은 식물 조직 배양 휠에서 조직 재생과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인돌-3-아세트산과 시토키닌의 내인성 수준을 높은 감도로 간단히 분석할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 내인성 식물 호르몬 수준의 변화가 외래 새싹 형성을 유발하기 때문에 식물 조직 퇴화의 확립 전반에 걸쳐 확장됩니다. 시작하려면 식물 호르몬이 없는 B5 배지를 준비하고 0.2% 젤란 검을 추가합니다. 그런 다음 배지를 오토클레이브하여 살균합니다.

멸균 아크릴 판에 수술용 메스를 사용하여 ipecac plantlets의 8mm internodal segments를 잘라 배지에 놓습니다. 그런 다음 섭씨 24도에서 14시간 빛, 10시간 암흑 주기로 5주 동안 ipecac 세그먼트를 제곱미터당 15마이크로몰 미만으로 배양합니다. ipecac 세그먼트를 배양한 후 각 세그먼트에서 1에서 4까지의 영역을 식별합니다.

일주일에 한 번 현미경을 사용하여 각 지역에서 우연히 싹을 싹을 세십시오. 먼저, 5mm 지르코니아 비드를 2mm 샘플 튜브 4개에 넣습니다. 그런 다음, 멸균 아크릴 판에 수술용 메스를 사용하여 ipecac 세그먼트를 IV를 통해 I.Then 각 영역에서 8개의 세그먼트를 하나의 샘플 튜브로 수집합니다.

각 샘플의 무게를 측정하고 액체 질소에 얼립니다. 다음으로, 비드 기반 균질기를 사용하여 동결된 샘플을 분쇄합니다. 와류 믹서를 사용하여 황소 및 CK의 각 내부 표준물질에 대한 500 피코그램과 함께 1 밀리리터의 아세토니트릴에 샘플을 현탁시킵니다.

샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 보관합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 3500G에서 샘플을 원심분리합니다. 펠릿을 80% 아세탈 니트릴과 1% 아세트산으로 세척합니다.

그런 다음 원심분리를 반복하고 일회용 클래스 튜브를 사용하여 상층액을 결합합니다. 결합된 상등액에 1%의 아세트산이 함유된 물 600마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 진공 농축기를 사용하여 아세탈 니트릴을 증발시킵니다.

샘플 용액을 개별 평형 HLB 카트리지에 로드합니다. 그리고 1%의 아세트산이 함유된 물 1ml로 카트리지를 세척하십시오. 그런 다음 유리관에 80% 아세틸 니트릴과 1% 아세트산이 함유된 2밀리리터의 모든 호르몬을 암시합니다.

진공 농축기를 사용하여 아세탈 니트릴을 증발시켜 1% 아세트산이 함유된 물에서 추출물을 얻습니다. 샘플 용액을 개별 평형 MCX 카트리지에 넣고 1%의 아세트산이 함유된 물 1ml로 카트리지를 세척합니다. 그런 다음 유리관 속의 IAA를 암시하는데, 2밀리리터의 30% 아세탈 니트릴과 1%의 아세트산이 들어 있습니다.

그런 다음 2밀리리터의 80% 아세탈 니트릴과 1% 아세트산으로 카트리지를 세척합니다. 다음으로, 드래프트 챔버에서 물 2ml와 물 1ml와 5% 암모니아 수용액으로 카트리지를 세척합니다. 드래프트 챔버에서 2밀리리터의 60% 아세탈 니트릴과 5% 수성 암모니아가 있는 유리관에 CK를 암시합니다.

그런 다음 진공 농축기를 사용하여 각 호르몬 분획의 용매를 증발시킵니다. LCMSMS 분석이 이루어질 때까지 섭씨 영하 30도에서 시료를 교반합니다. 먼저 각 호르몬 추출물을 600마이크로리터의 메탄올이 담긴 튜브에 녹입니다.

그런 다음 용액을 screw-neck total recovery 바이알로 옮기고 진공 농축기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. IAA 분획을 30% 아세탈 니트릴 20마이크로리터에 용해시키고 CK 분획을 1% 아세트산이 함유된 물 20마이크로리터에 용해시킵니다. 그런 다음 HPLC 시스템이 장착된 삼중 사중극자 MS 시스템을 사용하여 양이온 모드에서 시료를 분석합니다.

마지막으로, 비표지 및 중수소 라벨 표준의 비율에 대한 표준 곡선에 대해 CK 수준의 내인성 IAA를 정량화합니다. 이 프로토콜에서 외래 슈트의 내인성 산화제 사이토키닌을 5주 동안 LCMSMS를 통해 측정했습니다. 첫 번째 주에는 우연한 낙하산이 형성되지 않았고 두 번째 주에 첫 번째 작은 낙하산이 나타났습니다.

세 번째와 네 번째 주 동안, 낙하산의 수는 대부분 리전트 1과 2에서 증가했습니다. 다섯 번째 주 동안 낙하산의 수는 지역 1에서 약 7개, 지역 2에서 5개였습니다. 배양 전에는 지역 2, 3, 4보다 지역 1에서 IAA 수준이 약간 더 높았습니다.

첫 주 동안 IAA 수치는 지역 4에서 크게 증가했고, 지역 1, 2, 3에서 약간 감소했습니다. 배양 5주가 지났을 때 IAA 농도 구배가 나타났습니다. 지역 1에서 지역 4로 수준이 증가합니다.

배양 전에는 대부분의 CK가 미량 수준만 있었습니다. 첫 주에 tZR 수준은 지역 2에서 밀리그램당 13.8피코그램으로 증가했습니다. 그리고 영역 3에서 밀리그램당 18.1 피코그램.

대조적으로, tZ, iP 및 iPR의 수준은 배양 중에 약간만 변했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 내인성 부분 호르몬이 안정적이라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 인간이 개발된 후, 이 기술은 식물 조직 배양 분야의 연구자들을 위한 길을 열어줍니다.

다른 유기체의 우연한 형성을 탐구합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 내인성 인돌-3-아세트산과 사이토키닌을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.