Name: Ipecac의 위치인 문화 중 생 Auxin 및 시 토 키 닌의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 배우세요 ipecac 조직 배양 중 내인성 옥신과 사이토키닌의 LC-MS/MS 정량 분석 방법을. 이 기술은 식물 재생 메커니즘 연구와 조직 배양 기술 개선에 필수적인 고감도 식물 호르몬 동태 분석을 가능하게 합니다.

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우리는 그들의 기술 지원에 대 한 응용된 생물 과학 부, 도요 대학, 군마 농업 기술 센터의 씨 Koudai 타 니 구치의 씨 아키라 무라카미에 감사. 우리는 또한 그들의 제안에 대 한 교수 Shosaku Kashiwada 박사 우 Maheswari Rajagopalan, 도요 대학에 감사입니다. 이 연구는 생명 및 환경 과학, 도요 대학에 대 한 연구 센터에 의해 부분에서 지원 되었다.

참고: Ipecac (C. ipecacuanha)에 사용 되었다이 연구 생 phytohormones의 분석을 용이 하 게 하기 때문에.
1. 성장 조건 Ipecac의 우발적인 촬영 유도
<ol><li>PH 5.710, 조정 phytohormone 무료 B5 매체를 준비 하 고 0.2 %gellan 껌을 추가. 압력가 마로 소독 하 여 소독.</li>
	<li>멸 균 페 트리 접시 (90 m m × 20 m m)에 압력가 하는 매체의 25 mL를 붓으십시오.</li>
	<li>Ipecac plantlets 수술 메스를 사용 하 여 살 균 아크릴 플레이트에 블레이드 번호 22의 8 밀리미터 internodal 세그먼트를 잘라내어 매체 (그림 1)에 배치.</li>
	<li>24 ° C 15 µmol m−2의 − 1 5 주 동안 14 h 빛/10-h 어두운 주기에서 빛의 아래에 B5 매체 phytohormone 무료에 문화.</li>
	<li>지역 식별 난 (꼭대기) 4 (기저) 각 세그먼트 (그림 1B). 일주일에 한 번 우발적인 촬영 > 0.3 m m 길이 현미경으로 각 지역에서의 수를 계산 합니다.</li>
</ol>2. 추출 및 Phytohormones의 정화
<ol><li>각 4 개의 2 mL 샘플 튜브 5 m m 지 르 코니 아 비드를 넣어.</li>
	<li>지역으로 세그먼트를 잘라 iv (각 2 m m에 길이) 수술 메스를 사용 하 여 살 균 아크릴 판에 나.</li>
	<li>별도 샘플 튜브 (10-30 mg 신선한 무게)에 각 지역의 8 개 세그먼트를 수집 합니다.</li>
	<li>무게, 그리고 그 후 액체 질소에 샘플을 동결.</li>
	<li>비드 기반 균질 화기를 사용 하 여 얼음된 샘플을 짝사랑.</li>
	<li>Auxin의 각 내부 표준의 500 pg와 紀 (d5-IAA, d5tZ, d5tZR, d6-iP, d6-지적재산권)를 포함 하는 1 mL 이기에 짓 눌린된 샘플 일시 중지와 동 믹서를 사용 하 여.</li>
	<li>1 시간에 4 ° C에서 누른 다음 실 온에서 5 분 동안 3500 × g 에서 원심.</li>
	<li>1% (v/v) 초 산을 포함 하는 80% (v/v) 이기에 펠 릿을 세척. 원심 분리기 다시 3500 × g 에서 실 온에서 5 분. 일회용 유리 튜브에서 (2.7, 2.8 단계)에서 supernatants 결합.</li>
	<li>추가 600 µ L 각 결합된 상쾌한을 포함 1% (v/v) 초 산 물이 고 이기는 진공 집중 장치를 사용 하 여 증발.</li>
	<li>이기, 메탄올, 및 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 물의 1 mL를 각각 적용 하 여 친수성 닥터지-평형 (HLB) 열 카트리지를 equilibrate.</li>
	<li>Equilibrated HLB 카트리지 당 하나의 샘플 솔루션을 적용 합니다.</li>
	<li>1 mL 물 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 카트리지를 씻어.</li>
	<li>포함 하는 유리 튜브에 1% (v/v) 초 산 2 mL 80% (v/v) 이기와 모든 호르몬을 elute.</li>
	<li>포함 하는 1% (v/v) 초 산 진공 집중 장치를 사용 하 여 물에 추출 eluate에 이기를 증발. 참고:이 완전히 건조 하지 않습니다.</li>
	<li>1 mL 이기, 1 mL 메탄올, 0.5 mL를 적용 하 여 혼합 모드, 강한 양이온 교환 (MCX) 열 카트리지 equilibrate 0.1 M HCl, 그리고 포함 하는 1% (v/v) 초 산 1 mL 물.</li>
	<li>Equilibrated MCX 카트리지 당 하나의 샘플 솔루션을 적용 합니다.</li>
	<li>1 mL 물 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 카트리지를 씻어.</li>
	<li>포함 하는 유리 튜브에 1% (v/v) 초 산 2 mL 30% (v/v) 이기와 IAA elute.</li>
	<li>씻어 카트리지 포함 하는 1% (v/v) 아세트산 2 mL 80% (v/v) 이기.</li>
	<li>씻으십시오 2 mL 물, 1 mL 물 5% 수성 암모니아를 포함 하는 카트리지.</li>
	<li>유리 튜브에 5% 수성 암모니아를 포함 하는 2 mL 60% (v/v) 이기와는 CKs을 elute.</li>
	<li>진공 농축 기를 사용 하 여 각 호르몬 분수의 용 매를 증발 하 고 LC-MS/MS 분석까지 −30 ° C에 저장 합니다.</li>
</ol>3. LC-MS/MS 분석 IAA 및 CKs
<ol><li>각 호르몬 추출 메탄올의 600 µ L 튜브에 녹이 고 나사 목 총 복구 유리병에 솔루션을 전송. 진공 집중 장치를 사용 하 여 용 매를 증발.</li>
	<li>20 µ L 30% (v/v) 이기, IAA 분수와 CK 분수 나사 목 총 복구 튜브에 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 20 µ L 물에 용 해.</li>
	<li>HPLC 시스템 트리플 4 극 자 MS 시스템에서 긍정적인 이온 모드에서 샘플을 분석 합니다. 표 1에 나열 된 참고: 우리 HPLC 조건을 설정 합니다.<ol>
<li>IAA 차입에 대 한 5%-50% 용 매 B 7 분 이상의 이진 그라디언트를 사용 하 여 다음 98% 용 매 B에 의해 증가 1 분 동안 누른 다음 둥지를 주입 하 여 5% 용 매 B에 2 분 동안 equilibrate.</li>
		<li>CK 차입에 대 한 2%-40% 용 매 B 5 분 이상 40%-70% 용 매 B 7 분에서의 이진 그라디언트를 사용 하 여 다음 95% 용 매 B 늘려 1 분 동안 누른 다음으로 2% 용 매 B에 2 분 동안 equilibrate 주입을 중첩.</li>
		<li>분무 이온화 (ESI) 설정-MS 이온 소스 표 2에 나열 된 매개 변수.</li>
	</ol>
</li>
	<li>여러 반응 (MRM) 전환 표 3에 나열 된 각 분석의 정량화에 대 한 모니터링을 사용 합니다.</li>
	<li>계량 중수소 라는 표준 레이블 없는 비율의 표준 곡선에 대 한 내 생 IAA 및 CK 수준.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
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<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
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<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

저자 들은 관심 없음 충돌 선언 합니다.

Phytohormones의 분포를 식별 하기 위해 organogenesis에 관련 된 그것은 적용 될 때 phytohormones는 것 유도 위한 explants 때문에 있는 organogenesis phytohormone 무료 매체에 관찰 될 수 있다 식물 재료를 사용 하는 것이 중요 촬영 또는 뿌리, 그들은 전체 explant을, 세포 분화 및 organogenesis에 있는 식물의 고유한가 소성을 평가 하 고 어려운 영향을 미칩니다. 우발적인 촬영 phytohormone 무료 문화 미디어 Dianthus caryophyllus L.11, Aegle marmelos (L.) 코레아12, Bacopa monnieri (L.) Pennell13, 다른 식물 종에서에 유도 될 수 있다 노박 paniculatus Willd. <sup clas...

고트 Haberlandt (1854-1945 년) "totipotency", 어떤 식물에 의해 세포 수, 차별화, 분열과 성숙한 식물1에서 특정 세포 유형으로 차별화 그들의 이전 후에 전체 식물을 재생성의 개념을 제안 했다. 조직 문화에서 조합 및 성장 매체에 적용 된 것 phytohormones의 농도 의해 결정 됩니다 여부 식물 재생 여부 유도 될 수 있다. Skoog와 밀러 우발적인 뿌리 매체 포함 된 낮은 비율2에 유도 될 수 있는 반면 우발적인 촬영에 auxins, CKs의 높은 비율을 포함 하는 문화 매체에 굳은 살 담배에서에서 유도 될 수 있는 발견. 그 발견 이후 조직 문화는 널리 이용 된다 경제적으로 중요 한 작물의 전파 및 유전자 변형 식물3의 재생. 우발적인 촬영 촬영 정점 분열 조직, 잎, 뿌리, internodes 등 다른 조직에서 유도 될 수 있다. Phytohormone 치료는 대부분의 식물 종에서 우발적인 촬영의 유도 필요 합니다. 그러나, 최적 농도 조합 다 종에 의해 및 explants로 사용 하는 조직 중. 따라서, 많은 노력 결정 최적 농도 실험에 대 한 phytohormones의 조합으로 간다.
Carapichea ipecacuanha (Brot) L. 앤더슨 (ipecac)는 emetine 등 뿌리4에 주로 cephaeline, 알 카 로이드를 포함 하는 약용 식물 이다. 루트 추출 물 expectorant, 토 제, 그리고 amoebicide5로 사용 됩니다. 비록 ipecac 브라질의 열 대 우림에 자연적으로 성장, 문화, 씨앗을 설정 하기를 꺼 려 이며 발 아 율 감소는 추운 기후6일본, 씨앗 보관. 대신, 조직 문화에 의해 전파, 어떤 우발적인 촬영 internodes에 가장 효율적인 방법7,8. 흥미롭게도, 우발적인 촬영 phytohormone 치료8없이이 종에서 유도 될 수 있다.
우발적인 촬영 표 피 기저 지역9에 callusing, 없이 internodal 세그먼트의 꼭대기 지역에 형성 된다. 이 차이 아마도 phytohormonal 규정 internodal 세그먼트에서 조직 극성을 나타냅니다. Ipecac 문화 시스템 우발적인 촬영 형성 동안 내 생 phytohormone 레벨에 변화를 분석 하는 독특한 기회를 허용 합니다. 한 auxin (indole-3-아세트산 (IAA)) 및 4 개의 CKs 생 레벨의 분석에 대 한 우리의 방법을 소개 (isopentenyl 아데닌 (iP), isopentenyl 아데닌 아 (iPR), 트랜스-제 (tZ), 및 트랜스-제 아 (tZR)) 액정-MS/MS 사용 internodal 세그먼트.

<table><tbody><tr><td>[2H5]인돌-3-아세트산</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>LC-MS/MS에 대한 내부 표준</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatin</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>LC-MS/MS에 대한 내부 표준</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatin riboside</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>LC-MS/MS에 대한 내부 표준</td></tr><tr><td>[2H6]N6-isopentenyl adenine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>내부 표준 LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-이소펜테닐 아데노신</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>LC-MS/</td></tr><tr><td>MS 인돌-3-아세트산</td>에 대한 내부 표준 <td>Wako</td><td>098 00181</td><td>LC-MS/</td></tr><tr><td>MS 트랜스-제틴</td>에 대한 <td>표준 SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 5MG</td><td>표준 LC-MS/</td></tr><tr><td>MS 트랜스-제틴 리보사이드</td>에 대한 <td>Wako</td><td>262 01081</td><td>표준 LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-이소펜테닐 아데닌</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 1G</td><td>표준, LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-이소펜테닐 아데노신</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td>, <td>LC-MS/MS</td></tr><tr><td>용 표준, LC-MS용 아세토니트릴 하이퍼그레이드, LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td>, <td>LC-MS/MS용 용매</td></tr>, <tr><td>크로마토그래피용 물, LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>LC-MS/MS HPLC</td></tr><tr><td></td><td>용 용매SHIMADZU</td><td>Prominence</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 30 mg/1 cc</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>카트리지 컬럼</td></tr><tr><td>Oasis MCX 30 mg/1 cc</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>카트리지 컬럼</td></tr><tr><td>스크류 넥 총 회수 바이알</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>블루, 12 x 32mm 스크류 넥 캡 및 PTFE/실리콘 격막</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186000274</tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100mm</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>UPLC 컬럼</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18, 2.1x50mm</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>UPLC 컬럼</td></tr><tr><td>디지털 현미경</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>수술용 블레이드</td><td>Feather</td><td>No. 22</td><td></td></tr><tr><td>메스 손잡이</td><td>Feather</td><td>No. 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111/RVT4104</td><td>진공 농축</td></tr>기 <tr><td>일회용 유리 tobe (13x100 mm)</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ipecac의 위치인 문화 중 생 auxin 및 시 토 키 닌의 정량화

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

우발적인 촬영 형성 유전자 변형 식물의 재생 및 경제적으로 중요 한 작물의 전파에 대 한 중요 한 기술입니다. Phytohormone 치료는 대부분의 종에서 우발적인 촬영의 유도 필요 합니다. Auxin과 시 토 키 닌 (CK) 사이의 균형에 의해 결정 됩니다 여부 우발적인 촬영 유도 될 수 있는 수준. 많은 노력 결정 최적 농도 및 explants로 사용 하는 각 조직에 각 식물 종에 phytohormones의 조합으로 간다. 그러나 Ipecac에서, 우발적인 촬영 수 유도 될 phytohormone 치료 없이 문화 매체에서 internodal 세그먼트에. 평가할 셀 차별화 ipecac의 고유한 소성 수 있습니다. Ipecac 우발적인 촬영 유도, 우리 phytohormone 무료 B5 중간 5 주 동안 0.2 %gellan 껌으로 고형화에 14 h 빛/10-h 어두운 주기에 internodal 세그먼트 15 µmol m−2의 − 1 의 빛에서 24 ° C에서 경작. 우발적인 촬영 형성 동안 phytohormone 역학 조사, 우리 생 indole-3-아세트산 및 CKs 세그먼트에 의해 측정 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 LC-MS/MS. 이 메서드는 간단한 방식으로 생 indole-3-아세트산 및 CKs 레벨의 분석을 수 있습니다. 그것은 다른 식물 종에 organogenesis 동안 내 생 auxin과 CK의 역학 조사에 적용할 수 있습니다.

1세인트 주에서 아니 우발적인 촬영 형성 했다. 2노스다코타 주에 작은 쏘고 나타났다. 3rd , 4번째 주에 수 꼭대기 지역 (I 및 II)에서 주로 증가 쏘고 (그림 2A). 5일 주에 수 촬영의 되었고 약 7 시내 지역 나 지역 II (그림 2B) 5. 대조적으로, 단지 몇 가지 촬영 영역 III 및 IV에에서 형성 되었다.
문화, 전에 IAA 수준 높았다 약간 지역에서 난 (4.1 pg/mg, 신선한 무게 (FW)) 보다 지역 II-4 (~ 2.5 pg/mg FW; <strong class="x...

우발적인 촬영 phytohormone 치료 없이 ipecac의 internodal 세그먼트에 유도 될 수 있다. 우발적인 촬영 형성 동안 phytohormone 역학을 평가 하기 위해 내 생 auxin 및 LC-MS/MS에 의해 internodal 세그먼트에서 시 토 키 닌을 측정 했습니다.

Ipecac의 위치인 문화 중 생 Auxin 및 시 토 키 닌의 정량화

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

이 절차의 전반적인 목표는 ipecac에서 외래 새싹이 형성되는 동안 내인성 식물 호르몬 수치가 어떻게 변하는지 설명하는 것입니다. 이 방법은 식물 조직 배양 휠에서 조직 재생과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인돌-3-아세트산과 시토키닌의 내인성 수준을 높은 감도로 간단히 분석할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 내인성 식물 호르몬 수준의 변화가 외래 새싹 형성을 유발하기 때문에 식물 조직 퇴화의 확립 전반에 걸쳐 확장됩니다. 시작하려면 식물 호르몬이 없는 B5 배지를 준비하고 0.2% 젤란 검을 추가합니다. 그런 다음 배지를 오토클레이브하여 살균합니다.멸균 아크릴 판에 수술용 메스를 사용하여 ipecac plantlets의 8mm internodal segments를 잘라 배지에 놓습니다. 그런 다음 섭씨 24도에서 14시간 빛, 10시간 암흑 주기로 5주 동안 ipecac 세그먼트를 제곱미터당 15마이크로몰 미만으로 배양합니다. ipecac 세그먼트를 배양한 후 각 세그먼트에서 1에서 4까지의 영역을 식별합니다.일주일에 한 번 현미경을 사용하여 각 지역에서 우연히 싹을 싹을 세십시오. 먼저, 5mm 지르코니아 비드를 2mm 샘플 튜브 4개에 넣습니다. 그런 다음, 멸균 아크릴 판에 수술용 메스를 사용하여 ipecac 세그먼트를 IV를 통해 I.Then 각 영역에서 8개의 세그먼트를 하나의 샘플 튜브로 수집합니다.각 샘플의 무게를 측정하고 액체 질소에 얼립니다. 다음으로, 비드 기반 균질기를 사용하여 동결된 샘플을 분쇄합니다. 와류 믹서를 사용하여 황소 및 CK의 각 내부 표준물질에 대한 500 피코그램과 함께 1 밀리리터의 아세토니트릴에 샘플을 현탁시킵니다.샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 보관합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 3500G에서 샘플을 원심분리합니다. 펠릿을 80% 아세탈 니트릴과 1% 아세트산으로 세척합니다.그런 다음 원심분리를 반복하고 일회용 클래스 튜브를 사용하여 상층액을 결합합니다. 결합된 상등액에 1%의 아세트산이 함유된 물 600마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 진공 농축기를 사용하여 아세탈 니트릴을 증발시킵니다.샘플 용액을 개별 평형 HLB 카트리지에 로드합니다. 그리고 1%의 아세트산이 함유된 물 1ml로 카트리지를 세척하십시오. 그런 다음 유리관에 80% 아세틸 니트릴과 1% 아세트산이 함유된 2밀리리터의 모든 호르몬을 암시합니다.진공 농축기를 사용하여 아세탈 니트릴을 증발시켜 1% 아세트산이 함유된 물에서 추출물을 얻습니다. 샘플 용액을 개별 평형 MCX 카트리지에 넣고 1%의 아세트산이 함유된 물 1ml로 카트리지를 세척합니다. 그런 다음 유리관 속의 IAA를 암시하는데, 2밀리리터의 30% 아세탈 니트릴과 1%의 아세트산이 들어 있습니다.그런 다음 2밀리리터의 80% 아세탈 니트릴과 1% 아세트산으로 카트리지를 세척합니다. 다음으로, 드래프트 챔버에서 물 2ml와 물 1ml와 5% 암모니아 수용액으로 카트리지를 세척합니다. 드래프트 챔버에서 2밀리리터의 60% 아세탈 니트릴과 5% 수성 암모니아가 있는 유리관에 CK를 암시합니다.그런 다음 진공 농축기를 사용하여 각 호르몬 분획의 용매를 증발시킵니다. LCMSMS 분석이 이루어질 때까지 섭씨 영하 30도에서 시료를 교반합니다. 먼저 각 호르몬 추출물을 600마이크로리터의 메탄올이 담긴 튜브에 녹입니다.그런 다음 용액을 screw-neck total recovery 바이알로 옮기고 진공 농축기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. IAA 분획을 30% 아세탈 니트릴 20마이크로리터에 용해시키고 CK 분획을 1% 아세트산이 함유된 물 20마이크로리터에 용해시킵니다. 그런 다음 HPLC 시스템이 장착된 삼중 사중극자 MS 시스템을 사용하여 양이온 모드에서 시료를 분석합니다.마지막으로, 비표지 및 중수소 라벨 표준의 비율에 대한 표준 곡선에 대해 CK 수준의 내인성 IAA를 정량화합니다. 이 프로토콜에서 외래 슈트의 내인성 산화제 사이토키닌을 5주 동안 LCMSMS를 통해 측정했습니다. 첫 번째 주에는 우연한 낙하산이 형성되지 않았고 두 번째 주에 첫 번째 작은 낙하산이 나타났습니다.세 번째와 네 번째 주 동안, 낙하산의 수는 대부분 리전트 1과 2에서 증가했습니다. 다섯 번째 주 동안 낙하산의 수는 지역 1에서 약 7개, 지역 2에서 5개였습니다. 배양 전에는 지역 2, 3, 4보다 지역 1에서 IAA 수준이 약간 더 높았습니다.첫 주 동안 IAA 수치는 지역 4에서 크게 증가했고, 지역 1, 2, 3에서 약간 감소했습니다. 배양 5주가 지났을 때 IAA 농도 구배가 나타났습니다. 지역 1에서 지역 4로 수준이 증가합니다.배양 전에는 대부분의 CK가 미량 수준만 있었습니다. 첫 주에 tZR 수준은 지역 2에서 밀리그램당 13.8피코그램으로 증가했습니다. 그리고 영역 3에서 밀리그램당 18.1 피코그램.대조적으로, tZ, iP 및 iPR의 수준은 배양 중에 약간만 변했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 내인성 부분 호르몬이 안정적이라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 인간이 개발된 후, 이 기술은 식물 조직 배양 분야의 연구자들을 위한 길을 열어줍니다.다른 유기체의 우연한 형성을 탐구합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 내인성 인돌-3-아세트산과 사이토키닌을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

quantification-endogenous-auxin-cytokinin-during-internode-culture

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연구

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