Name: 초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster를 이용한 프리온 유사 단백질 응집체의 세포 간 전파 모니터링 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환의 병리 기전 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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우리는 이러한 방법을 개발 하는 동안 많은 도움이 토론을 위한 Kopito, 루 오, 그리고 피어스 연구소의 회원을 감사합니다. 우리는 또한이 원고에의 중요 한 독서에 대 한 브라이언 Temsamrit을 감사합니다. 이 작품은 대학 과학 및 트 면 스미스 자선 신탁에서에서 자금에 의해 지원 되었다.

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신경 퇴행 성 질환으로 고통 받는 환자 수가 증가 하 고, 더 나은 치료법을 개발 될 수 있도록 이러한 질병의 분자 pathogenesis의 이해를 증가 하는 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 다른 세포 유형 사이 병원 성 단백질의 프리온 같은 전송 모니터링을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 최근 돌연변이 체 Htt 집계에서 vivo에서 의 프리온 같은 전송 설명 하 고 명과27뉴런에서 이러한 집계의 확산을 중재 phagocytic 수용 체를 식별 하이 방법을 사용 했습니다. 우리의 접근 방식을 악용 초파리 를 사용 하 여 유전자 인간 질병 연구의 몇 가지 장점: 그것의 짧은 라이프 사이클 및 치료와 관련 된 기본적인 생물 학적 정보의 발견을 가속화할 수 있는 광대 한 유전 도구.
우리는 여기에 설명 하는 방법을 기존의 다른 동물에 비해 두 ...

프리온 가설 상태에 전염성이 에이전트 전송 가능 해 encephalopathies (예를 들면, 인간에서 크로이츠펠트-야콥 병, 양, 사슴, 엘크, 만성 낭비 질병 및 "광우병" 가축에서 scrapie에 대 한 책임 )의 단백질 및 핵 산1없는 전적으로 구성 되어 있습니다. 프리온 질병, 세포 프리온 단백질 (PrPC) 가정 아닌, 안정적인 접이식 PrP (Sc) 높은 베타 시트-부자 이며 자체 변환 및 안정 된 아 밀 로이드로 단위체 PrPC 분자에 의해 전파 수 있습니다. 집계합니다. PrPSc 집계는 유기 체에 다른 세포 사이 및 개별 유기 체2사이 확산이 자기 복제 메커니즘을 사용 합니다.
단백질 misfolding 및 집계 또한 대부분 신경 퇴행 성 질환 (Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS))의 중앙 특징 이다3. 이러한 질병에 내부 또는 여분 cellular 집계 단백질 어셈블리의 형성은 시간5, 에 밀접 하 게 관련 된 세포 독성4 와 두뇌를 통해 높은 재현성 및 질병 특정 경로 따라 진행 6. 이러한 패턴의 확산이이 질환과 관련 된 병원 성 집계 프리온 같은 속성을가지고 제안. 강력한 지원, 광고와 관련 된 집계의 프리온 같은 전송에 대 한 존재 PD, HD, 및 ALS-그들은 셀 템플릿 이전 영향을 받지 않는 셀7, 동일한 단백질의 단위체 형태의 구조적 변화에서 확산 8.
날짜의 단백질 프리온 처럼 확산 조사 연구의 대다수 포유류 세포 문화 모델, 어디 집계 전송을 사용 순진한 세포의 세포질에 다른 세포 또는 세포 외 공간에서 수행 되었습니다. 세포질9,10,11,12,13,,1415, 또는 마우스 두뇌에 집계 포함 된 재료를 주입 하 고 모니터링 하 여 집계는 사출 사이트16,17,18,19,20,,2122, 이외의 모양 23. 최근 유전자 변형 동물 세포내 집계 그대로 두뇌24,25,,2627, 내의 다른 셀에 확산을 보여 주기 위해 사용 되었습니다 28,,2930. 여기, 우리는 초파리 melanogaster의 그대로 뇌에 있는 개별 셀 사이의 집계 전송의 직접 시각화 하는 방법을 설명합니다. 초파리 모델 HD/polyglutamine (polyQ) 질병의 거의 2 년 전 처음 개발31,32 이 무질서의 기반이 되는 병원 성 메커니즘에 대 한 많은 귀중 한 통찰력 제공 33. HD는 단백질 huntingtin (Htt)34코드 하는 유전자는 상 염색체 지배적인 돌연변이 의해 발생 하는 상속 된 신경 장애. 이 돌연변이의 병원 문 턱을 넘어 Htt의 N-말단 근처 polyQ 스트레치의 확장 결과 ~ 37 glutamines, misfold 및 집계35,36단백질을 일으키는. 야생-타입 Htt 단백질 포함 된 <이 뻗 기에 37 glutamines 그들의 네이티브 배를 달성 하지만에 유도 될 수 있다는 Htt 집계 "씨앗"12,,2737와 직접적인 물리적 접촉 시 집계. 우리는이 homotypic, 프리온 같은 전송에 대 한 판독으로 야생-타입 Htt의 nucleated 집계 및 다른 세포에서 발생 하는 돌연변이 체 Htt 집계의 세포질 항목을 악용 합니다.
프리온 같은 집계 하 여 결정 하는 메커니즘 셀 사이의 여행 불 치 신경 퇴행 성 질환에 대 한 새로운 치료 대상의 식별 될 수 있습니다. 우리는 빠른 라이프 사이클을 이용, 사용의 용이성, 그리고 초파리 melanogaster 돌연변이 체 Htt의 셀을 확산에 대 한 분자 메커니즘 정의를 유전적 추적성을 걸릴. 우리의 실험 전략 초파리, 잘 설립 Gal4 특정 상류 활성화 순서 (Gal4 UAS) 시스템38 및 QF QUAS 최근 개발 시스템39에서 사용할 수 있는 두 개의 이진 식 시스템을 사용합니다. 이 두 개의 독립적인 시스템을 커플링 같은 비행40내 뚜렷한 세포 인구를 제한 하는 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 표현 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 프리온 같은 집계 된 상태로, 미리 형성 된 돌연변이 체 Htt와 육체적 인 접촉의 직접적인 결과 일반적으로 확산, 수용 성 상태에서 세포질 야생-타입 Htt의 재분배를 모니터링 하 여 돌연변이 Htt의 확산 검토 집계 "씨입니다." Htt의 돌연변이 의해 야생-타입 Htt의 변환 생물을 사용 하 여 확인 될 수 있다 또는 단백질 단백질 상호 작용, 형광 공명 에너지 등을 보고 생물 기술 전송 (무서 워)9,,2741 .
중요 한 것은, 우리 또한 많은 유전자 초파리 유전자 및 단백질의 프리온 같은 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 도구를 액세스할 수 있습니다. 우리는 최근 세포 표면 폐품 수용 체, 드레이퍼42,43, 신경 축 삭에서 초파리 중앙에 가까운 phagocytic 명과 돌연변이 체 Htt 집계를 전송에 대 한 중요 한 역할을 공개 하기 위해이 접근을 사용 신경 시스템 (CNS)27 따라서, 우리가 여기에 설명 하는 유전 및 이미징 기반 접근 강력한 모델 생물, 초파리하지만 사용 하기 간단한에서에서 질병 관련 현상에 대 한 중요 한 기본적인 생물 학적 정보를 밝힐 수 있다.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10X, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td>으로 희석 <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas</td><td>Scientific 2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS), filtered</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>수령 시 분취 및 동결</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>1:500 희석에서 사용</td></tr><tr><td>Rabbit anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>1:2000 희석에서 사용; DsRed 기반 형광 단백질(예: mCherry, mStrawberry, tdTomato 등)을 인식할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마우스 안티-브루흐파일럿</td><td>발달 연구 하이브리도마 뱅크</td><td>nc82</td><td>1:100 희석에서 사용; 플라이 뇌</td></tr><tr><td>FITC 안티-치킨</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>1:250 희석시</td></tr><tr><td>사용 Alexa Fluor 568 안티-토끼</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>1:250 희석시</td></tr><tr><td>사용 Alexa Fluor 647 안티-마우스 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td>1:250 희석에서 사용</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade 시약</td><td>Life</td> Technologies <td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드(25 x 75 x 1.0mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리(22 x 22mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 생물학 등급 겸자, 스타일 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>비주로 사용하는 손에 사용</td></tr><tr><td>Dumont 생물학 학년 겸자, 스타일 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>지배적 인 손에 사용</td></tr><tr><td>LAS X 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 이미지 분석 소프트웨어</td><td>비트 플레인</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

초파리 melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

단백질 집계 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS)를 포함 하 여 대부분의 신경 퇴행 성 질병의 중앙 특징 이다. 정도 벗어난 단백질 집계 방해 정상적인 세포 항상성 정확한 메커니즘은 알려져 있지 있지만 단백질 집계는이 질병에 neuropathology와 밀접 하 게 관련. 데이터를 신흥 AD, PD, hd, 그 병원 성 집계 가설에 대 한 강력한 지원을 제공 하 고 ALS prions, 단백질만 전염 성 요원 전달할 수 면 encephalopathies에 대 한 책임에 많은 유사점을가지고. 자기 prions 집계 형의 확산을 일으키는 동일한 단백질의 기본적으로 접혀 버전의 변환 템플릿으로 복제. 어떻게 prions 그리고 광고, 프리온 같은 단백질 한 셀에서 다른 PD, HD, 및 ALS 이동 현재 강렬한 수 사의 영역입니다. 여기, HD와 관련 된 돌연변이 huntingtin (Htt)의 프리온 처럼, 셀 전송의 모니터링을 허용 하는 초파리 melanogaster 모델을 설명 합니다. 이 모델 transgene 식 많은 다른 초파리 조직에 조작 하기 위한 강력한 도구를 활용 하 고 돌연변이 체 Htt의 직접 보고서 프리온 같은 전송에 놓여있는지 태그 세포질 단백질을 이용 한다. 중요 한 것은, 우리가 여기에 대해 설명 하는 접근 소설 유전자와 단백질의 다양 한 셀 형식 비보사이의 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 신경 퇴행 성 질병 기초 및 치료 적 개입을 위한 새로운 기회를 공개 하는 병원 성 메커니즘의 제한 된 이해를 확장 됩니다.

여기에 설명 된 방법을 그대로 비행 CNS에서에서 다른 한 세포 인구에서 Htt의 단백질 프리온 같은 전송 시연 하는 강력한 데이터 생성. 야생-타입 Htt의에서 변환 확산 punctate 기증자 ORNs (그림 2A C 및 그림 4A, B)에서 HttQ91 mCherry 식의 결과로 받는 사람 명과에서이 YFP 융해 단백질의 직접 형광에 의해 관찰 됩니다. 이 두 세포 인구 사이 프리온 같은 전송 이벤트의 정확한 보고 유전자 변형 파리와 중 어떤 오버랩 없이 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 강한 식 수준의 생산 Gal4/QF 드라이버의 신중한 선택 필요 개발 또는 성인에서. 또한, 형광 단백질-Htt 퓨전 transgenes의 사려깊은 디자인 강력한 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다....

병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 단백질 응집체의 프리온과 같은 확산을 모니터링하는 것입니다. 고립된 세포 집단에서 동일한 단백질의 용해성 버전에서 응집되기 쉬운 단백질을 발현하는 형질전환 파리를 사용합니다. 이 방법은 단백질 응집체 신화 또는 기타 물질이 뇌의 세포에서 세포로 이동하는 방법과 같은 신경 퇴행 분야의 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 손상되지 않은 중추 신경계에서 한 세포 부위에서 다른 주머니쥐로 퍼지는 단백질 응집체를 이미징할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 헌팅턴병 및 기타 프리온 유사 신경 퇴행성 질환의 치료로 확장됩니다. 응집체가 퍼지는 것이 이러한 치명적인 질환의 진행의 기저에 있는 일반적인 메커니즘인 것으로 보이기 때문입니다.표준 배양 조건을 사용하여 조직 특이적 Gal4 또는 QF 드라이버를 포함하는 형질전환 초파리 멜라노가스터 라인을 생성합니다. 뿐만 아니라 Gal4-UAS 또는 QF-QUAS의 하류에 야생형 또는 돌연변이 huntingtin, 트랜스 유전자를 포함하는 라인. 욕망 유전자형의 자손을 수집하고 해부 할 준비가 될 때까지 숙성시킵니다.뇌 박리를 준비하기 위해 필요한 용액을 모아 유리 멀티 웰 접시, 피펫 팁 및 집게 한 쌍과 함께 얼음으로 식힙니다. 다음으로, 이산화탄소를 사용하여 성충 파리를 마취하고 유리 접시의 우물로 옮겼습니다. 그런 다음 약 반 밀리리터의 PBST를 파리가 있는 우물과 인접한 우물에 추가합니다.다음으로, 해부 현미경으로 파리 한 마리에 초점을 맞추고 구즈넥 조명으로 양쪽에서 비춥니다. 그런 다음 해부 도구를 청소하기 위해 접힌 티슈를 접시 아래에 놓습니다. 이제 주로 사용하지 않는 손에 있는 3번 집게를 사용하여 PBST가 들어 있는 웰로 플라이 하나를 옮깁니다.복부 쪽이 위를 향하도록 파리의 복부를 잡고 파리를 움직이지 못하게 하고 파리를 완전히 잠기게 합니다. 이제 주둥이에 인접한 작은 공간의 큐티클 아래에 5개의 집게 중 하나를 삽입합니다. 그런 다음 양쪽에서 눈을 꼬집어 머리의 그립을 고정하고 집게를 당겨 머리를 분리합니다.머리가 PBST에 잠긴 상태를 유지하면서 접힌 조직에 플라이 바디를 폐기합니다. 다음으로, 반대쪽의 같은 공간에 숫자 3 겸자의 주석을 삽입하고 머리 표피를 부드럽게 당겨 뇌를 드러냅니다. 계속하기 전에 큐티클 잔여물을 실험실 조직에 버리십시오.큐티클을 제거하는 동안에는 집게로 뇌를 손상시키지 않도록 뇌에 직접 접촉하지 않도록 합니다. 이제 부착된 기관을 잡거나 모세혈관 작용을 사용하여 겸자 끝 사이의 공간으로 흡인하여 PBST에서 절개된 뇌를 제거합니다. 그런 다음 파리 뇌를 얼음 위의 고정 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.뇌가 겸자에서 나오는지 주의 깊게 관찰하십시오. 모든 뇌를 해부한 후 채취 튜브를 실온의 너트레이터로 옮기고 약 5분 동안 감쌉니다. 고정 기간이 지나면 p1000 피펫을 사용하여 대부분의 고정액을 제거하고 폐기하되 뇌가 튜브에 남아 있도록 매우 주의하십시오.이를 위해서는 부드러운 흡입과 세심한 관찰이 필요합니다. 다음으로, 1ml의 새로운 PBST를 뇌에 첨가합니다. 튜브를 덮고 약 1분 동안 너트기에 흔들어 남은 정착제를 씻어냅니다.그런 다음 용액을 제거하고 이 짧은 세척 단계를 반복합니다. 두 번의 짧은 세탁에 이어 한 번의 5분 세탁, 두 번의 20분 세탁, 마지막으로 한 번의 1시간 세탁으로 합니다. 마지막 세척 후 대부분의 PBST를 조심스럽게 제거하고 30마이크로리터의 글리세롤 기반 퇴색 방지 시약에 뇌를 담그십시오.그런 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 1시간에서 24시간 동안 움직이지 않고 뇌를 배양합니다. 나중에 무딘 피펫 팁을 사용하여 채취 튜브에서 뇌를 제거하고 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 이미징하는 데 필요한 대로 뇌의 방향을 부드럽게 잡습니다.여러 샘플을 동일한 슬라이드에 별도의 행으로 장착할 수 있습니다. 다음으로, 접힌 실험실 조직의 모서리를 사용하여 슬라이드에서 과도한 퇴색 방지 시약을 제거합니다. 조직이 뇌와 접촉하지 않도록 한다.그런 다음 뇌가 슬라이드에 부착되도록 샘플을 5분에서 10분 동안 어두운 곳에 두십시오. 다음으로, 깨진 커버 유리의 작은 조각을 가져다가 약 19제곱밀리미터 영역을 덮고 있는 뇌 주위에 배치한 다음 22제곱밀리미터 커버 유리를 뇌와 유리의 모자이크 위로 부드럽게 내려 다리 마운트를 만듭니다. 다음으로, 커버 슬립 아래에 새 퇴색 방지 시약을 천천히 주입하여 빈 공간을 채웁니다.뇌와 유리가 제자리에 머물도록 매우 조심스럽게 하십시오. 그런 다음 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다. 먼저 모서리에 바르기만 하면 됩니다.가장자리를 따라 밀봉을 완료하기 전에 모서리 두드림을 5-10분 동안 건조시킵니다. 뇌는 가능한 한 빨리 이미지화되어야 합니다. 40X 또는 63X 오일 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 장착된 뇌를 이미지화하여 트랜스 유전자가 발현되는 뇌 영역에서 Z 슬라이스를 수집합니다.그런 다음 개별 Z 슬라이스의 반점을 정량화하거나 슬라이스를 3차원으로 렌더링한 후 데이터를 분석합니다. 잘 분리되어 있고 배경 신호가 거의 없는 돌연변이 huntingtin 응집체를 정량화하려면 3D 보기 모드에서 컨포칼 Z 시리즈를 엽니다. 그런 다음 분석 마법사를 사용하여 선택적 채널에서 개별 스폿을 식별합니다.설정에서 임계값 및 필터를 조정하여 이질적인 크기의 모든 집계를 이미지의 개별 개체로 정확하게 나타냅니다. 그런 다음 이진 처리 사전 필터에서 개체 분할을 활성화하여 밀접하게 연결된 집계를 분리합니다. 소프트웨어에 의해 식별된 물체에 대한 정량적 정보는 측정 아래에 보고됩니다.puncta를 계수한 후 이미지 분석 소프트웨어에서 추가로 특성화합니다. 예를 들어, 스폿 또는 표면에 대한 관련 측정을 수행하여 골재 직경, 부피 또는 강도 정보를 얻을 수 있습니다. 일부 야생형 huntingtin 응집체는 Z 스택을 수동으로 이동하고 주변 확산 신호와 구별할 수 있는 녹색 반점을 계수하여 정량화할 수 있습니다.단일 애그리게이트가 둘 이상의 슬라이스에 나타날 때 두 번 계산하지 않도록 주의하십시오. 또 다른 관심 분석은 huntingtin Q25-YFP와 huntingtin Q91-mCherry 응집체 간의 공동 국소화 빈도를 결정하는 것입니다. 컨포칼 Z 스택을 통해 슬라이스 단위로 이동하여 수동 카운팅을 사용하여 이 작업을 수행합니다.유전적 동인과 형광 단백질 트랜스 유전자 융합을 신중하게 선택하면 비중첩 세포 집단에서 돌연변이 및 야생형 huntingtin 단백질을 명확하게 검출할 수 있습니다. 야생형 huntingtin의 확산에서 반점으로의 변환은 공여체 후각 수용체 뉴런에서 huntingtin Q91-mCherry 발현의 결과로 수용체 신경교에서 YFP 융합 단백질의 직접 형광에 의해 관찰됩니다. 유전적 동인과 형광 단백질 트랜스 유전자 융합을 신중하게 선택하면 비중첩 세포 집단에서 돌연변이 및 야생형 huntingtin 단백질을 명확하게 검출할 수 있습니다.돌연변이 및 야생형 huntingtin 응집체는 수동으로 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 반점 개체로 정량화할 수 있습니다. 응집체는 개체군과 공동 국소화 빈도에 대해 추가로 측정하고 특성화할 수 있습니다. Co localized puncta는 형광 에너지 공명 전달 또는 FRET에 의해 추가로 분석하여 형광 단백질 융합체의 근접성을 입증할 수 있습니다.일단 숙달되면 뇌 해부 및 영상 촬영은 제대로 수행되면 8시간 이내에 처음부터 끝까지 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 적절한 대조군을 사용하여 동일한 조직의 다른 형광 구조와 반점 응집된 물체를 주의 깊게 구별하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차는 서로 다른 세포 유형 간의 응집 전달을 위한 분자 메커니즘을 결정하기 위해 유전자 녹다운과 같은 다른 방법을 포함하도록 수정할 수 있습니다.실험에 감사드리며 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 우리는 즉시 정화하여 intraperitoneal 접종 다음과 찬란 다음 주사 사이트에서 자신의 이해와 움직임을 모니터링하고 이러한 이벤트를 중재 전지 특성화 감염 두뇌 자료에서 집계 프리온 봉 라벨 면역 세포 프리온 이해와 인신 매매를 감시를위한 소설 분석을 설명합니다.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

이 비디오는 적색 형광 단백질로 표지된 프리온 유사 단백질을 발현하는 예쁜꼬마선충의 생체 내 이미징 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜은 타임 랩스 컨포칼 현미경 검사를 위해 아가로스 패드에 선충을 고정시켜 세포 내부 및 세포 간 단백질 응집 및 이동을 밝히는 것입니다. 이 기술은 neurodegenerative 질병과 관련있는 단백질 응집을 공부하기를 위해 결정적입니다.

형질전환 선충에서 프리온 유사 단백질의 세포 간 확산을 모니터링하기 위한 타임 랩스 이미징

이 비디오는 유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. 뇌는 장착하기 전에 고정, 세척 및 페이딩 방지제로 처리됩니다. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처하고 정량화하여 돌연변이 단백질 응집체의 전달을 관찰합니다.

Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains (유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화)

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

포도당 섭취량은 FRET 기반의 유전자 인코딩 된 포도당 센서에 의해 표시된 바와 같이 TAR DNA 결합 단백질 (TDP-43) 단백질 병증에 의해 영향을받는 Drosophila 운동 뉴런에서 증가합니다.

TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

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전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

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여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

학습하세요 Drosophila melanogaster를 이용한 프리온 유사 단백질 응집체의 세포 간 전파 모니터링 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환의 병리 기전 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

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