Name: 세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 배우세요 세제 없이 막 단백질을 지질 이중층에 초고속 재구성하는 방법을 퓨조제닉 프로테오리포솜을 이용하여 연구하세요. 이 기법은 생화학 및 합성생물학에서 복잡한 다중 구성 요소 막 시스템을 구축하는 데 활용됩니다.

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저자는 감사 로버트 Genn 일리노이 대학에서 크리스토프 폰 Ballmoos 베른 대학에서에서 제공 하는 플라스 미드와 보3를 표현 하는 스트레인-산화 효소. 프로젝트 BBSRC에 의해 지원 되었다 제공 RI와 R.B. BB/L01985X/1을 부여

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저자는 공개 없다.

다음과 같은 몇 가지 문제가이 실험 방법의 성공을 위해 고려해 야 할:
의 지질 bilayers proteoliposomes 및 대상에 대 한 선택: 양이온 지질에에서 없는 자연, 음이온 지질은 풍부한 생물 막 도달, 예를 들어, 25, 35, 대장균, 효 모 S. cerevisiae, 원형질 막 및의 안 미토 콘 드리 아 막의 내부 막에서 20%에 많은 종, 각각27,,2829. 그것은 합리적인 pl+ 막 단백질의 기능 양이온 지질 bilayer는에서 및 외부 이온의 상대적인 내용에 따라 차례로 bilayer의 포지티브 차지의 강도 의해 영향을 받을 수 있습니다 기대 하는 것 강도입니다. 따라서, 그것은 어느 정도 관심의 막 단백질의 기능에 따라 다르죠 양이온 지질 환경의 실험적으로 해결 하는 것이 중요. 여기, 우리는 둘 다 F1Fo ATP synthase와 보3보여줍니다-산화 효소 양이온 지질 환경에 민감 하지만 우리가 조절 하 고 관리 하 첫 pl+ 단백질을 배치 하 고에 그들을 제공 하 여이 효과 역방향 음이온 bilayers, 수락 하 고 다음 퓨전 후 반응 매체의 이온 강도 증가 완료.
특정 양이온 지질의 선택: 대부분 상용 양이온 지질은 비 triacylglyceride 자연; 따라서 잠재적인 후보 지질 막 단백질의 호환성에 대 한 테스트 되어야 한다. 우리가15 는이 연구에 사용 된 ATP synthase PL+ 에서 최상의 성능을 에틸-PC, DOTAP (triacylglyceride에에서 자연 triacylglyceride 지질 하 높은 구조 유사 했다의 형성 이전에 발견 지질) PL+ 이 단백질이 덜 활성화 했다.
소포 융해 분석 실험: 진정한 기 퓨전 (intravesicular 액체 내용을 믹스) 때 소포 그들의 수성 콘텐츠를 혼합 하지 않고 서로 준수 하지만 쉽게 그들의 외부 또는 둘 다 지질의 내용을 혼합 중간 hemi-퓨전 상태에서 분화 될 필요가 전단지30. 차선의 지질 혼합물 또는 특정 조건, 소포는 또한 퓨전31동안 발음된 액체 내용 누설을 보여줍니다. 진정한 퓨전을 사용 하는 fusogenic 혼합물에 충전된 지질의 최소 농도 각 지질 종족에 대 한 실험적으로 발견 될 필요가 있지만 일반적으로, 그것은 10% 미만으로 세포 막 지질은 비 fusogenic 32렌더링 청구 발견.
멀티-발렌타인 이온의 존재에 fusogenic SUV를 형성 하는 동안 그것은 중요 하다 반대로 충전된 구성 요소, 혼합에 아닙니다이 이온에 의해 즉시 응집 및 지질 집계 될 수 있습니다. 예를 들어 코발트-calcein-EDTA 메서드에 대 한 SUV를 준비 하는 동안 이멀전의 구성 요소 폴 리 카보 네이트 필터의 막힘을 방지 하기 위해 EDTA와 양이온 지질 혼합물을 혼합 하지 마십시오 중요 하다.
그것은 또한 그 코발트-calcein-EDTA 방법 매우 민감하고 실시간 퓨전 모니터링, 편리 하면서 수 여전히 과소 평가 1 인 융합의 범위를 언급 하는 것이 중요) 자체 내부 무료 calcein의 형광의 냉각 postfusion 소포, 자체 냉각 임계값은 약 20 µ M33, 고 2 보고 하는 동안 1 m m를 도달할 것으로 예상 되는) 표면 바인딩된 코발트-calcein, 젤 여과 지를 통과 후에 SUV+ 에 바인딩된 남아 있는 고 반면 SUV0 창백한 오렌지 색상 밝은 오렌지 색 소포를 색상. 또한 세제 Triton X-100 EDTA 존재의 추가에 바인딩된 코발트 calcein의 출시 SUV0 (회색 추적) 보다 SUV+ (그림 3C, 빨간 추적)에 대 한 훨씬 더 강력한 신호 생성 note.
관점: 우리는 여기에 설명 된 빠른 접근 수 있습니다 크게 용이 하 게 하 고 속도 신흥 합성 생물학 응용 프로그램의 요구에 대 한 복잡 한 막의 어셈블리를 기대. 우리의 막 단백질 재구성 프로토콜은 깨지기 쉬운 큰 막 단백질의 재구성에 대 한만 30 분이 fusogenic 접근 제공에 5-10 분 동안 긴 투 석 기반 재구성 기술에 민감한 것으로 알려져 큰 지질 bilayers에 같은 단백질. 여기, 대장균 F1Fo ATP synthase, 깨지기 쉬운 단백질의 예로 조작 하 여 이러한 접근 방법의 이점을 설명 합니다. 그것은 23 subunits 고 중/후 가용 화, 차선 조건 (예: 열)에 노출 하는 경우의 무결성을 쉽게 잃게 알려져 있다 하지만이 절차에서 사용 되 고, 단백질 양성자 펌프에 reproducibly 높은 활동을 보여줍니다.

막 단백질을 함께 인공 지질 bilayers의 기능화 막 모델 시스템의 어셈블리에서 핵심적인 단계입니다. 가장 간단한 모델, proteoliposomes (PL), 소형 (30-200 nm 직경)의 구성 단백질 unilamellar 소포 (SUV, 또한 전화 리), 그들의 막에 통합. PL은 전통적으로 형성 된 2 단계1. 첫째, 미리 형성한 SUV는 막 단백질의 관심, 임계 micelle 농도 (CMC)의 위 농도에 세제와 혼합 됩니다. 둘째, 세제는 다양 한 투 석, "바이오-비즈" 또는 젤 여과 기법, 막에 있는 단백질을 떠나 함께 제거 됩니다. 후자의 접근 방식을 훨씬 빠른 (~ 30 분1) 이며 따라서 연 약하고 민감한 막 단백질의 재구성 하는 것이 좋습니다 동안 처음 두 가지 방법 많은 시간을 소요 하 고 발생할 수 있습니다 세제 제거 속도 의해 제한 되는 활동 및 단백질의 구조적 무결성의 손실의 상당한 손실. 더 큰의 기능화 소포 (큰 unilamellar 소포, LUV, 1 µ m 직경까지)이이 접근에 의해 더 도전 소포 크기 세제 제거 후 감소 되 면 이며, 그것은 거 대 한 unilamellar 소포 불가능 (우두머리, > 1 µ m), 그들은 세제 (하지만 참조 존슨 그 외 여러분 에 의해 불안정 2 큰 bilayers에 있는 막 단백질의 느린 2D-결정에 대 한). 우두머리 막 기능화3,,45 에 대 한 대체 방법을 존재 하지만 힘 드는, 시간 소모, 그리고 일부 세제 농도 CMC 아래에서 해야. 더 복잡 한 또는 허약한 지질 모델 (예를 들어 물방울 히드로 Bilayers6 및 3D 인쇄 방울 인터페이스 Bilayer 기반 인공 조직7) 세제를 참을 수 없습니다. 신속 하 게 합성 생물학 응용 프로그램8,신흥9,10 비판적으로 의존 같은 복잡 한 막 구조의 기능화. 따라서, 대상 연약한 bilayers에 막 단백질의 신속 하 고 부드러운 배달 수 있도록 쉽고 강력한 방법 높은 필드에 전과 있다.
대신, 세제 무료 단백질 전달 방법이 이다 소포 융해, 어디 상호 작용 소포 막 단결 그대로 postfusion bilayer에 그들의 intravesicular 수성 내용, 외부에 발표 되 고 없이 혼합 하는 동안 환경입니다. 소포 융해 활성화는 연락에 있는 보완 fusogenic 에이전트 (일부 단백질11,12 , 펩 티 드13 또는 특별히 수정 된 DNA14) 내에서 구조적 재배열에 의해 구동 bilayers, 또는 지질 bilayers 간의 Coulombic 상호 작용 complementarily 충전된 양이온 및 음이온 지질15,16또는 양이온 bilayers 및 부정 청구 단백질17의 형성.
전 접근 필요 퓨전, 이전 상호 작용 세포 막의 fusogenic 요원의 존재 이지만 상대적으로 느린 (~ 30 분 퓨전12,18의 절반 최대에 도달), 모두 자연과 인공에 적용할 수 있습니다. 막입니다.
Fusogenic 지질 (그림 1)를 사용 하 여 접근의 장점은 훨씬 빠른 막 융합 (반-최대, 및 반응 완료 5-10 분 ~ 1 분)는 이다. 또한, 융합의 범위 i) 하기 쉬운 상대 콘텐츠 청구 지질 bilayers fusogenic, 및 ii) 이온의 일반, 삼투성 강도 50 m m 및, 예를 들어, 자당15 위 (소금에서 반응 매체의 공식화에 의해 통제 될 수 있다 같습니다 퓨전 중지), 또는 둘 다의 조합. 퓨전을 시작 하려면 반대로 충전된 fusogenic 소포는 5-10 분에 대 한 낮은 (일반적으로 10-20 밀리미터 소금) 이온 강도 매체에 혼합 됩니다. 한 상대는 방법의 단점은 양이온 지질 양이온 proteoliposomes 퓨전, 특히 낮은 이온 강도에서 이전에 막 단백질의 기능에 부정적인 영향을 발휘할 수 있습니다 하지만이 효과 가역과 자연에 의해 완화 융해 후 막과 정상 이온 강도 매체에 그것의 반환의 지질 구성.

<table><tbody><tr><td>DOPC 중성 지질</td><td>Avanti 지질</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>POPA 음이온 지질</td><td>Avanti 지질</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>E-PC 양이온 성 지질</td><td>Avanti 지질</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td><td>Thermofisher</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50, Super Fine</td><td>Sigma</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400, Type 400-DL</td><td>시그마</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>시그마</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>니게리신</td><td>시그마</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>시그마</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>시그마</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>시그마</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>루시페린</td><td>시그마</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase</td><td>Sigma/Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biotechnology</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>압출 시스템</td><td>Avanti 압출기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 튜브 광도계, 모델 Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 필터, D19mm</td><td>시그마, Whatman NucleporeTrack 에칭 멤브레인</td><td>WHA800309,</td><td>SUV를 형성하기 위해 100 또는 200nm를 WHA800284, LUV</td></tr><tr><td>를 형성하는 데 400 또는 800nm를Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>종이에 사용된 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer B</td><td></td><td></td><td>20mM KCl, 10mM MOPS pH 7.4, 0.1mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer C</td><td></td><td></td><td>100mM KCl, 10mM MOPS pH 7.4</td></tr><tr><td>Buffer D</td><td></td><td></td><td>1mM MOPS pH 7.4 다양한 농도의 KCl</td></tr></tbody></table>

세제 없는 보완 청구 proteoliposomes fusogenic를 사용 하 여 지질 bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

더 복잡 한, 더 큰 모델 지질 bilayers는 세제와 덜 호환 세제 30-100 nm 작은 unilamellar 소포에 막 단백질의 납품을 위한 불가결 하지 않습니다.
여기는 반대로 리 베어링의 막 단백질을 청구 하는 fusogenic를 사용 하 여이 근본적인 한계를 우회에 대 한 전략에 설명 합니다. 이러한 vesicles 사이의 융합 낮은 이온 강도 버퍼에서 5 분 이내에 발생합니다. 긍정적으로 위탁된 한 fusogenic 리 부정 청구 biomimetic 대상 지질 bilayers에 막 단백질의 세제 무료 배달에 대 한 간단한 셔틀 벡터로 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 fusogenic proteoliposomes 빠른 30 분 프로토콜에 막 단백질을 다시 구성 하는 방법을 보여줍니다.
이러한 두 가지 방식을 결합 하 여, 대장균에서 두 막 단백질의 구성 하는 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리 설명, 기본 양성자 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase의 세포 막에서 0.1에서 배열 하는 다양 한 크기의 소포 >이 체인에 의해 ATP 생산 뿐 아니라 10 미크론.

Fusogenic 사용 하 여 무료 충전 3 단계 (그림 1)를 포함 하는 대상 bilayer 막으로 막 단백질의 빠른 세제 무료 배달에 대 한 proteoliposomes: A, fusogenic SUV 높은 지질 혼합물에서의 형성 충전된 지질;의 내용 이 SUV는 intravesicular 부하;을 선택적으로 있습니다. B, 우리의 빠른 막 단백질 재구성;를 사용 하 여 PL로 fusogenic SUV의 변환 C, fusogenic PL 대상 bilayers 낮은 소금 매체에서와 융합 융합 반응을 중지에 높은 소금의 추가 의해 따라. 큰 소포 (D) 일 경우 바람직 전략 음이온 대상 bilayer, 막 단백질의 활동에 대 한 더 나은 지질 환경 제공으로 막 단백질을 제공 하는 (토론 더 텍스트에서).
거꾸로 에멀젼 방법을 우두머리 형성 프로토콜은 그림 2에 자세히는 강조 표시 됩니다. 우리 때문에 상대적으로 높은 지질 오일 혼합물에 hexadecane를 사용 하는 것을 선호 판 우두머리 후 응고 기름 쉽게 제거 가능 (18 ° C) 냉동 온도.
그림 3 에서는 소포 융해를 코발트-calcein-EDTA 메서드를 사용 하 여 보여 줍니다. 퓨전 보완 청구 소포 높은 소금 농도 동안 낮은 소금 버퍼에 사용 됩니다 경우에 볼 수 있다 (&gt; 50 m m14) 또는 비 fusogenic 소포를 사용 하 여 설명 없는 퓨전.
Fusogenic SUV로 막 단백질의 재구성의이 빠른 프로토콜은 그림 4A에 나와 있습니다. 우리 빨리 입증이 프로토콜을 사용 하 여 기본 양성자의 재구성 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase PL, 그리고이 세포 막에 그들의 특정 활동의 평가에. 그것은 중요 한 단백질 재구성의 수익률 지질 사용15 의 책임에 의존 하지 않습니다 및 약 50-7525,12, 그리고 그 후에 PL로 재구성, 단백질 저장 될 수 있다 적어도 3 일 에서도 단백질 활동의 명백한 손실 없이 실내 온도. 이 절차는 또한 ATP synthase, 그것의 95%는 그것의 친수성 moiety F1 중심 바깥쪽15,26의 단방향 방향을 제공 합니다.
그림 5 는 F1Fo (패널 A)의 활동 및 보3를 양수 하는 양성자를 보여줍니다-양이온 지질에 산화 효소 (패널 B)은 감소 하 고 음이온과 중립 지질 환경에 비해 낮은 이온 강도에 민감 하지만 이 효과 음이온 LUV-+ PL 융합 후 postfusion 막에 완화 됩니다.
그림 6 의 큰 소포 막으로 F1Fo ATP synthase의 납품을 보여 줍니다. 이 실험, PL+ 에 800 nm LUV- 20 m m KCl 5 분, 그리고 반응 제품에 융합 했다 수송과 들뜬된 PL+를 제거 하려면, resuspended 이었고 양성자 펌프에 대 한 분석. 제어 실험 아무 양성자 펌핑 LUV0 대신 LUV- 의에서 사용 된 융해 반응 (검은 추적), 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적) 하는 때 보였다.
Fusogenic PL에 의하여 큰 소포 막에 작동 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리는 그림 7에 표시 됩니다. F1Fo SUV+ 를 사용 하는 우리 보3 SUV+ 융해 800 nm LUV-, 코엔자임 Q1 과 정력적으로 DTT 순차적으로 추가 하 여이 체인 postfusion 소포에 의해 ATP 생산을 증명 막, 고 인산 염 ATP 합성 F1Fo트리거 추가.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> 그림 1: 개념의 초고속 세제 무료 배달 막 단백질의 unilamellar vesicles의 융합을 통해 대상 지질 bilayers에 보완 된 지질 형성. 선택적으로 intravesicular 화물 적재 양이온 및 음이온 fusogenic unilamellar 작은 소포 (+의 SUV, SUV-)의 (A) 형성. (B) fusogenic fusogenic proteoliposomes (PL) 막 단백질의 재구성에 의해에 SUV의 변환. (C) 세제 무료 큰 소포, 100 nm PL+ 사이의 융합에 의해 그림의 세포 막에 막 단백질의 배달에 대 한 fusogenic와 줘. (D) 바람직 전략 postfusion 막으로 막 단백질의 배달 그리고 800 nm LUV-입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> 그림 2: 우두머리 형성 프로토콜 거꾸로 에멀젼 방법. (A) 석유 지질 혼합물 및 물 사이 국경에 지질 단층의 형성. (B)는 거꾸로 (물에서 기름) 유제의 형성. 원심 분리에 의하여 기름-물 국경을 통해 유제를 전달 하 여 (C) 우두머리 형성. (D) 냉각 튜브 아래의 &lt; 18 ° C 고형화 하 고 기름을 제거 ~. 그것의 막 (녹색)와 기의 루멘 (레드)에서 북극 fluorophore (1 m m Sulforhodamine 101) 형광 지질 (1% 무게 분수 cholesteryl-Bodipy-FL12)를 포함 하는 우두머리의 (E) A 형광 현미경 이미지. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> 그림 3: 지질 소포 융해 코발트-calcein-EDTA 방법으로 공부 했습니다. 어디 무료 calcein 릴리스입니다 비 형광 코발트-calcein 복합물에서 EDTA에 의해 방법의 (A) 회로도 (B) 융합의 SUV 다양 한 KCl 농도에서. 텍스트에 설명 된 대로 B 에서처럼 postfusion 소포를 EDTA와 트라이 톤 X-100 세제의 추가 의해 intravesicular calcein의 (C) 자료. 붉은 추적에 대 한 융합 정도 (%)은 최대한 배경 수정 퓨전 신호를 나누어 계산 (1-2) 신호에 의해 배경 수정 최대한 캡슐화 된 calcein (3-2)의 출시에 따라 고 100을 곱한. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> 그림 4: 보3의 초고속 재구성-산화 효소 및 fusogenic proteoliposomes와 같은 proteoliposomes에 단백질 활동 측정으로 F1Fo . (A) 도식 재구성 프로토콜의 (B) 코엔자임 Q1 산화 양성자 펌프 보3에 의해 구동-PL 산화 효소 (텍스트 설명)를 냉각 하는 ACMA로 측정. (C) ATP 가수분해 기반 양성자 펌핑 pl에서 F1Fo ACMA 냉각 (텍스트 설명)로 측정. F1Fo pl에서 (D) ATP 가수분해 ATP 회생 시스템 (텍스트 설명), 및 그것의 자극에는 uncoupler에 의해 측정. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> 그림 5: 막 단백질의 활동에 지질 환경 및 이온 강도 영향. 양성자 펌프 F1Fo (A) 및 보3-20, 100 m m KCl. 제어 추적 (음이온 LUV (녹색 추적)와 융합 하는 양이온 PL (빨간 추적), 음이온 PL (블루 추적), 중립 PL (검은 추적), 그리고 양이온 PL에 산화 효소 (B) 회색) Fo PL- 혼합 시 SUV-와 F1에 의해 양수 하는 양성자의 변화를 보여줍니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> 그림 6: 배달 F1Fo ATP synthase의 800의 세포 막에 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): PL+ 와 800 nm LUV- 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 m m MgCl2, 20 m m KCl 5 분, 제거 수송과 융합 했다 PL, 들뜬 및 동일한 버퍼에서 resuspended. (B) 양성자 postfusion LUV (빨간 추적)에 의해 펌핑. 제어 실험 때 PL0 luv- (검은 추적), 혼합 했다 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적)에 냉각 하는 아무 ACMA 보였다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> 그림 7: 5-분 세제 무료 조립 800의 세포 막에서 전자 전송 체인의 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): 100 nm F1Fo PL+ 와 100 nm 보3- 그림 6에서 설명한 대로 산화 효소 PL+ -, LUV로 융합 했다. 퓨전은 KCl MOPS 100, 50 mM에 각각 추가 하 여 중지 되었습니다. 세포 막 ADP-소-luciferase 칵테일 혼합 되었고 텍스트에 설명 된 대로 DTT와 Q1의 추가 의해 활성화. ATP 생산은 1 m m 인산 염 (Pi) 및 모니터링된 실시간으로 텍스트에 설명 된 대로 luciferase 소 시스템의 추가 의해 시작 되었다. Postfusion 소포 (빨간 추적)에 의해 (B) ATP 종합. 제어 실험 때 PL+ 높은 소금 (회색), LUV- 와 함께 혼합 했다 또는 PL0 LUV- (블랙)와 함께 혼합 했다 아니 ATP 생산을 보였다. ATP 합성 속도 텍스트 (단계 8.8 8.9)에 설명 된 대로 계산 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

구현하기 쉬운 절차의 전반적인 목표는 반대 전하를 띤 지질로 형성된 지질 이중층 간의 융합을 사용하여 다양한 크기의 지질 이중층으로 멤브레인 단백질을 세제 없이 빠르게 전달하는 것을 입증하는 것입니다. 당사의 방법론은 생화학 및 생물물리학에서 레이어 개별 구성 요소에서 biomer metric 다중 구성 요소 지질 이중층 시스템의 1단계 조립에 사용할 수 있습니다. 우리 접근법의 장점은 단백질, 지질 및 기타 관심 분자를 가진 이 빠른 기능, 즉 복잡한 모델 지질 바이라제에 있다는 점을 언급하는 것이 중요합니다.이 방법론은 지질막의 에너지화가 필요한 막 수송 과정을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 1차 펌프는 다른 막 단백질에 의해 가능해진 2차 수송을 구동하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 방법은 합성 생물학의 요구에도 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 다양한 프로그램 기능을 가진 멤브레인 소포를 만들 수 있습니다. 미래에는 이와 같은 작은 소포를 비슷한 큰 소포 안에 가두는 것은 인공 세포를 만드는 데 한 걸음 더 나아갈 수 있습니다. 지질 및 오일 용액을 형성하려면 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 클로로포름 스톡과 1ml의 헥사데칸을 혼합합니다.다음으로, 클로로포름을 증발시키기 위해 튜브를 열어 두어 섭씨 80도의 수평 셰이커에서 30분 동안 혼합물을 지속적으로 혼합하고 가열합니다. 증발 후에는 튜브를 닫고 실온으로 식히십시오. 다음으로, 기름 수성 완충기 공용영역에 있는 지질에, 지질 단층을 형성하기 위하여는, 1.5 밀리리터 분리기 관을 가지고 가고, 완충기 B.Then 단계 별거 경계가 평평하게 할 것을 위한 실온에 30-60 분 동안 기다리기의 위에 기름 해결책에 있는 지질의 200 마이크로리터를 옮기, 지질 단층의 대형을 나타내.상 분리 경계의 볼록한 모양은 오일과 수성 버퍼 사이의 표면 장력 불일치 때문입니다. 다음으로, 물과 오일 에멀젼을 준비하기 위해 Buffer B에 비이온 폴리당류 용액을 물보다 높은 밀도로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물 0.5마이크로리터를 오일 용액에 100마이크로리터의 지질을 함유한 새로운 1.5ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 혼합물을 44 킬로 헤르츠 및 14 와트에서 울트라 소닉 수조에서 30 초 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 45 분 동안 격렬하게 와류를 일으켜 오일 에멀젼에 물을 형성합니다. 그런 다음 오일 에멀젼의 물을 음이온성 GUV로 전환하려면 에멀젼을 지질 및 오일 수성 계면 위에 조심스럽게 옮깁니다.에멀젼에서 각 액적은 지질 단층으로 코팅됩니다. 오일 에멀젼에서 물의 적절한 신디케이션 볼텍싱이 GUV 형성의 성공 여부를 결정합니다. 올바르게 형성되지 않으면 에멀젼 방울이 차례로 합쳐져 GUV 형성의 수율을 감소시킵니다.GUV 펠릿을 얻기 위해 1000배 G에서 2분 동안 샘플을 빠르게 원심분리합니다. 구부러진 금속 와이어를 튜브에 넣어 오일 안에 안착시킵니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 두어 지질과 오일 혼합물을 응고시킵니다.얼어붙은 기름을 조심스럽게 제거하고 수성상을 수집합니다. 다음으로, GUV 펠릿을 50마이크로리터의 새 버퍼 B에 다시 현탁시키고 새 튜브로 옮깁니다. 형광 현미경의 100 X 오일 방출 대물렌즈에서 GUV를 검사합니다.겔 여과 수지를 사용하여 중력 흐름 컬럼을 준비하고 실온에서 유지된 버퍼 A와 동등하게 합니다. 그런 다음 추출 버퍼를 사용하여 정제된 멤브레인 단백질을 최종 농도인 밀리리터당 0.7mg으로 희석합니다. 그런 다음 사전 형성된 양이온성 SUV와 단백질을 1 대 30 비율로 혼합하고 완충액 A를 포함하는 콜레이트를 최종 부피 660마이크로리터까지 혼합합니다.그런 다음 샘플 튜브를 로커에 놓고 혼합물을 15분 동안 부드럽게 흔듭니다. 다음으로, 젤 여과 수지를 통해서 혼합물을 통과하고 4, 15 분 동안 000 시간 G에 혼탁한 proteoliposome 조각 및 분리기를 모으십시오. 그런 다음, 재구성되지 않은 단백질 상등액을 버리고 펠릿을 형광계 큐벳 A.In 1ml의 새 버퍼에 용해시키고, 0.5마이크로몰 ACMA가 있는 상태에서 2밀리리터의 버퍼 A와 함께 B03 산화효소가 포함된 프로테올리포솜 20마이크로리터를 첨가하고 430나노미터 여기 및 515나노미터 방출에서 안정적인 신호를 기다립니다.그런 다음 큐벳에 코엔자임 Q1 40마이크로몰을 추가합니다. 다음으로, 프로테오리포좀에 2밀리몰 DTT를 첨가하여 양성자 펌핑을 시작한 다음 형성된 델타 pH를 소멸시킵니다. 별도의 큐벳에 0.5 마이크로몰 ACMA가 있는 상태에서 F1-F0가 포함된 40마이크로리터의 프로테오리포좀을 2밀리리터의 완충액 A에 첨가하고 프로테오리포좀에 0.2밀리몰 ATP를 첨가하여 양성자 펌핑을 트리거한 다음 형성된 델타 pH를 소멸시킵니다.50 마이크로 리터의 PL +를 1 밀리리터의 버퍼 D에 800 나노 미터 LUV 50 마이크로 리터와 융합하고 1 밀리 몰의 염화 마그네슘과 20 밀리 몰의 염화칼륨을 5 분 동안 보충합니다. 다음 6, 000 시간 G에 포스트 융해 LUV를 펠릿으로 만들기 위하여 5 분 동안 표본을 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 미반응 PL+로 구성된 상등액을 버리고, 1밀리리터의 Buffer D에 형성된 펠렛을 1밀리몰의 염화마그네슘과 100밀리몰의 염화칼륨으로 보충하여 재현탁합니다.다시 ACM 퀜칭 분석을 수행합니다. 먼저 3마이크로리터의 B03 산화효소 PL+과 5마이크로리터의 F1F0 PL+를 함께 혼합한 다음 혼합물을 20밀리몰의 염화칼륨과 1밀리몰의 염화마그네슘을 보충한 버퍼 D의 800마이크로리터의 LUV 또는 GUV-3마이크로리터와 5분 동안 융합합니다. 다음으로, 염화칼륨(Potassium Chloride)과 걸레 완충액(Mops Buffer)을 150밀리몰의 최종 농도로 융합된 멤브레인 혼합물에 첨가합니다.200마이크로리터의 버퍼 A에 400마이크로몰 ADP, 50마이크로몰 루시페린 및 루시페라제 2.5를 혼합하여 루시페린 루시페라제 ADP 칵테일을 준비합니다. 그런 다음 융합된 멤브레인 혼합물에 칵테일을 추가합니다. 올바른 ADP 합성 측정을 위해서는 Q1 및 DTT를 추가하기 전에 거짓 양성을 방지하기 위해 안정적인 루시페라아제 신호를 갖는 것이 중요합니다.그런 다음 40 마이크로몰 산화 코엔자임 Q1을 첨가한 다음 2 밀리몰 DTT를 추가하여 융합 멤브레인의 활성화를 시작합니다. 1분 후, 에너지가 공급된 소포에 5밀리몰의 인산칼륨 용액을 첨가하여 ATP 합성을 시작합니다. 지질과 오일 혼합물에서 얼어붙은 헥사데칸을 제거할 때 재현탁된 GUV를 검사하기 위해 형광 현미경을 활용했습니다.얻어진 GUV의 이미지는 막에 형광 콜레스테롤 생물 FL12가 존재하고 내강에 극성 형광단인 자가 에로디민 101이 있음을 보여줍니다. 염화칼륨의 농도 증가에서 SUV의 융합을 정량화하기 위해 그래프가 그려졌습니다. 이 그래프는 염화칼륨 농도가 50밀리몰 이상으로 증가함에 따라 SUV 지질 소포의 융합이 감소하기 시작하는 것을 설명합니다.그러나 1에서 20 밀리몰 사이의 낮은 염화칼륨 농도에서는 상보적인 전하를 띤 소포가 융합됩니다. 다음으로, 코엔자임 Q1 기질의 BO3 산화효소 명상 양성자 펌핑 구동 산화를 측정하기 위해 ACMA 담금질 분석을 기반으로 그래프를 표시했습니다. 결과는 언커플러를 추가하면 플롯의 Y축을 따라 표시되는 ACMA 형광 신호가 증가한다는 것을 보여줍니다.그런 다음 F1F0에 의한 ATP 가수분해 의존성 양성자 펌핑도 ACMA 담금질 분석을 기반으로 측정했습니다. 그래프에서는 언커플러를 추가하면 AMCA 형광 신호가 증가함을 보여줍니다. 또한, 루시페린 루시퍼라아제 시스템을 사용하여 융합된 소포에서 ATP 합성을 모니터링했습니다.코엔자임 Q1 DTT의 순차적 첨가 후 인산염 첨가는 융합된 소포에 의한 성공적인 ATP 생산을 보여줍니다. 일단 숙달되면, 막 단백질과 연합 근 의학으로 상징된 세제에서 fusogentic proteoliposome의 첫 번째 기술 형성은 단 30분 만에 완료할 수 있습니다. 두 번째 기술인 물리적 융합은 단 10분 이내에 훨씬 더 빠르게 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 기능화된 지질 소포에 의해 제시되는 다양한 개별 구성 요소를 결합하여 다중 구성 요소 멤브레인 시스템을 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 막 단백질의 한 단계로 불가능한 주요 특성과 기능을 갖춘 모듈식 시스템을 기대합니다. 일반적으로 우리의 절차는 더 단순한 소위 바이오 브릭(bio-bricks)에서 복잡하고 구획화된 생화학 시스템을 구축하기 위한 간단한 프레임워크를 제공합니다.

detergent-free-ultrafast-reconstitution-membrane-proteins-into-lipid

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 단일 체인 amphiphiles의 독특한 화학적 특성으로 인해 그 포함 diacylphospholipids에 비해 뚜렷한 속성을 전시 한다. 여기 우리는 준비, 정화, 그리고 이러한 amphiphiles의 전체 또는 일부 구성 리의 사용에 대 한 기술을 설명 합니다.

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

생물학적 막 융합은 특수 융합 단백질에 의해 촉매됩니다. 단백질의 fusogenic 특성을 측정하는 것은 지질 혼합 분석을 통해 달성될 수 있다. 우리는 재조합 Drosophila 아틀라를 정화하는 방법을 제시, ER의 상모 융합을 중재하는 단백질, 미리 형성 된 리포솜에 그것을 재구성, 융합 용량에 대한 테스트.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

이 프로토콜은 항리고적으로 중요한 G 단백질 결합 수용체의 종류 중 하나인 인간 1A 세로토닌 수용체 단백질(5-HT1AR)의 재구성을 위해 여기에 설명된 바와 같이, 일체형 막 단백질(IMP)을 거대한 유니라멜라 지질 소포(GUV)에 통합하기 위한 강력하고 일반화가능한 기술로 아가로즈 팽윤을 활용한다.

G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)를 통합 한 모델 지질 막의 건설

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

배우세요 세제 없이 막 단백질을 지질 이중층에 초고속 재구성하는 방법을 퓨조제닉 프로테오리포솜을 이용하여 연구하세요. 이 기법은 생화학 및 합성생물학에서 복잡한 다중 구성 요소 막 시스템을 구축하는 데 활용됩니다.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

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