Name: 꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 학습하세요 비율 칼슘 이미징을 이용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 HSN 뉴런 활성을 분석하는 방법을. 이 기술은 신경 회로와 행동 변화 간의 관계를 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 KMC (R01 NS086932)에 NINDS에서 교부 금에 의해 투자 되었다. LMN은 NIGMS IMSD 프로그램 (R25 GM076419)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 변종 C. 선 충 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 투자 되는이 연구에 사용. 우리 유용한 토론에 대 한 제임스 베이커와 메이슨 클라인 감사합니다.

1. 긴장, 문화 미디어, 그리고 동물의 장착
<ol><li>성장 OP50 대장균 세균성 음식19시드 표준 60 m m 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 접시에 20 ° C에 C. 선 충 벌레.</li>
	<li>관심의 각 세포 특정 발기인에 대 한 두 개의 플라스 미드 준비: 하나, 운전 기록 세포내 캘리포니아2 +, GCaMP5 및 운전 mCherry GCaMP5 형광 변화의 비율 정량 수 있도록의 식을 두 번째 식과 개체 찾기 및 측정을 단순화 합니다. 참고: GCaMP5:mCherry 비율 영상 초점 및 동물 운동 변화, 세포내 캘리포니아2 +에서 실제 변화에 기인 하는 GCaMP5 형광에 변동에 대 한 해결 합니다.</li>
	<li>LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X 돌연변이 동물의 생식 기에 pL15EK 표시 구조 마커 플라스 미드와 함께 GCaMP5 및 mCherry 표현 플라스 미드를 주입 하 고 복구 비 Muv lin-15(+) 동물 GCaMP5을 표현 하 고 높은 복사 transgene20,,2122에서 mCherry. 라이트-1 돌연변이 백그라운드를 사용 하 여 블루 빛 회피 행동23,24를 줄이기 위해.</li>
	<li>Transgenes 염색체 mosaicism을 복합 돌연변이 체 긴장25의 생성을 단순화를 통합 합니다. 참고: 여기에 설명 된 LX2004 변형 운반 GCaMP5 및 nlp-3 발기인에서 HSNs에 mCherry을 표현 하는 통합 된 높은 복사 transgene (참조 테이블의 재료)26,27, 28 , 29. (e.g.,tph-1, 테스트 HSN 개발 또는 달걀 누워 동작 다른 발기인에 비해 상당한 결함을 일으키는 없이 nlp-3 모터 드라이브 강한 표현 하는 HSNs에 늦게 L4 및 성인 동물 발견 egl-6, 그리고 unc-86). 이 긴장 및 다른 GCaMP5 및 mCherry 복 부 코드 (VC) 모터 신경, 외 음부 근육, 그리고 uv1 신경 내 분 비 세포에서 표현 하는 꼬마 유전학 센터에서 사용할 수 있습니다 그리고 그들의 건설의 세부 사항 설명 27.</li>
	<li>OP50 백 금 벌레의 아래 시드 NGM 천 배지에서 세균성 음식 선택, 적용 하 고 그것을 사용 하 여 전송 ~ 20 후반 L4 LX2004 동물을 GCaMP5과 nlp-3 발기인에서 HSNs에 mCherry. 개발 외 음부는 stereomicroscope에 둘러싸인 하얀 초승달 분명 어두운 반점으로 나타나는지 확인 합니다. 동물 24-40 h 20 ° C에서 품 어.</li>
	<li>부 화 후 선택에 OP50 적용 및 전송 ~ unseeded NGM 플레이트, 영상 동안에 먹이를 벌레에 대 한 뒤에 음식의 작은 금액을 떠나 벌레의 3. 너무 작은 세균 음식 음식을 너무 많이 배경 형광을 증가 하 고 산소를 발생 하는 동안 접시의 중심에서 방황 벌레 격려로 충분 한 음식, 확인 합니다.</li>
	<li>평평한 둥근된 주걱을 사용 하 여 잘라는 ~ 20 m m x 20 m m 벌레를 들고 접시에서 청크와 덩어리 얼굴-다운 깨끗 한 24 m m x 60 m m #1.5 coverslip (그림 1)의 센터에 전송. 한쪽에 coverslip 아래 갇혀 영상과 간섭에서 거품을 유지 하는 응용 프로그램을 시작 합니다. 22 x 22 mm #1 coverslip 고집과 증발을 줄이기 위해 덩어리의 상단에 적용 됩니다.</li>
</ol>2. 하드웨어 및 계측 설정
<ol><li>무대, ≥ 0.7는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 유전자 변형 웜 숫자 조리개 계획-Apochromat 20 객관적인, 전동 XY 스테이지와 조이스틱, 이미지 분할, 형광 제어 x 동시 GCaMP5에 대 한 필터 및 mCherry 여기 및 방출, 카메라 영상, 형광 및 적외선 관찰법 및 트리거 발광 다이오드 (LED) 조명 시스템 (그림 2A). 참고: 80/20 빔-스플리터 형광 카메라 이미지 신호의 80%와 20%를 보냅니다 명시 카메라. 똑바로 현미경을 사용하실 수 있습니다, 하지만 NGM 덩어리가 경우 유리 슬라이드와 큰 coverslip 배치 되어야 합니다.<ol>
<li>쌍 안 접 안 렌즈를 사용 하 여 선택 이미징에 대 한 웜. 동물을 선택 하면 콘덴서 위의 장소에 적외선 필터를 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 트리거<ol>
<li>각 형광 카메라에 3 개의 TTL 트리거 출력 라인의 동축 케이블을 연결 합니다. 첫 번째 출력 LED 조명 시스템의 BNC 입력 # 3에 연결 합니다.</li>
		<li>두 번째 출력 녹색 BNC '바나나' 어댑터에 연결 하 고 GPIO를 실행 하는 8 핀 GPIO 커넥터에서 갈색 전선 입력 #3 (4 핀) 및 적외선 카메라의 지상 (핀 5) 각각.</li>
		<li>#8 디지털 입력을 실행 하는 점퍼 와이어와 세 번째 출력 BNC '바나나' 어댑터에 연결 하 고 디지털 수집 장치 (그림 2B)에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>디지털 수집 장치 (DAQ)<ol>
<li>DAQ 마이크로컨트롤러 보드 연결 ( 재료의 표참조) USB 케이블을 통해 PC에. Firmata ( 테이블의 자료를 참조) 프로토콜 및 57600 보드에서 USB 포트를 통신 구성 표준 펌웨어를 업데이트 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Led<ol>
<li>LED 컨트롤러 소프트웨어 실행 ( 재료의 표참조). 모두 470 및 590 nm Led에 대 한 '연속 '제어'를 선택 합니다 트리거 채널 ' 3'에서 트리거 모드를 전환 합니다.</li>
		<li>설정 하 고 각 LED에 대 한 LED 전원 입력 (예를 들면, 세트는 470 nm LED 590 nm LED을 20% ~ 40%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>직렬 단 통신 스크립트 ' XY-단계-최종 ' 분재 ( 재료의 표참조)에서30을 실행 합니다. 회색 'CsvWriter' 노드를 클릭 하 고 기록 된 저장 폴더 선택 X 및 Y 무대 정보 (그림 3). 초기화는 DAQ를 도구 모음에서 녹색 화살표를 누릅니다. 참고: 스크립트 형광 카메라는 TTL 신호를 보낼 때 X 및 Y 무대 위치를 녹음을 시작 합니다. 이 스크립트의 출력 데이터의 4 열: 프레임 번호를 위치 (µ m) X, Y 위치 (µ m), 프레임 (s) 사이의 간격.</li>
	<li>적외선 카메라 레코딩 소프트웨어에서에서 ( 재료의 표참조) ' 사용자 정의 비디오 모드,' 선택 "모드 1" (2 x 2 비 닝, 1024 x 1024 픽셀), 및 "픽셀 형식 Raw 8". 아래 ' 트리거 / 스트로브 ', "3", "높음", '14"'모드'를 극성 트리거 입력된 라인 (GPIO)를 설정. '사용' TTL 트리거 신호를 받을 때까지 프레임 수집을 중지 하려면 전환 합니다.<ol>
<li>그 창을 열어두고, 메인 카메라 보기 도구 모음에서 빨간색 "기록" 버튼을 클릭 합니다. 이미지 시퀀스에 저장할 폴더를 선택 합니다. 'Buffered' 기록 모드를 선택 하 고 '이미지' JPEG 형식으로 저장. 인수를 초기화 "녹화 시작"을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 카메라와 이미지 분배기 참고: GCaMP5 및 mCherry 형광 채널 비율 정량에 대 한 적절 한 이미지 등록 되도록 동시에 수집 될 해야 합니다. 이미지 분할 한 센서에 GCaMP5 및 mCherry 형광의 2 채널 인수 수 있습니다.<ol>
<li>이미지 수집 소프트웨어의 '캡처' 탭에서 4 배, 및 16 비트 이미지 깊이 binning 10 ms ( 재료의 표참조) 설정된 노출 시간. 512 x 256 픽셀 높이의 중심으로 카메라 하위를 선택 합니다. ' 출력 트리거 옵션 보기 '를 클릭 하 고 '긍정적인.'를 모든 트리거 설정 참고: DAQ는 그들은 10ms 이하의 TTL 트리거를 놓칠 수 가끔.</li>
		<li>' 트리거 1'과 ' 방 아 쇠 2'는 설정 확인 '노출' ' 방 아 쇠 3' '풀 그릴'로 설정 하는 동안 '시퀀스' 탭 아래 25 양의 '기간', 20 Hz. 선택 '저장 임시 버퍼를 합니다.'에서 이미지를 수집 50 ms의 ' 필드 Delay1'와 ' 시간의 경과 '를 선택합니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMT 고 3 채널 confocal 영상 중 강도 레이저<ol>
<li>배경 형광은 최소 (블랙 레벨) 바로 위에 수준에서 PMT 이득 설정. 단일 포화 12-비트 또는 16 비트 픽셀 mCherry 채널에는 연 접에 관찰 될 때까지 561 nm (녹색) 레이저 파워를 증가.</li>
		<li>GCaMP5 형광은 그냥 배경 위에 연 접에 보이는 488 nm (블루) 레이저 강도 조정 합니다. 이 낮은 설정은 강한 캘리포니아2 + 과도 응답에는 형광 증가할 때 GCaMP5 픽셀의 채도 방지 합니다. 빛 캡처를 최대화 하기 위해 모든 방법을 confocal pinhole을 엽니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 비율 캘리포니아2 + 이미징 및 동작 녹화
<ol><li>형광 수집 소프트웨어에 '시퀀스' 탭에서 녹음을 시작 하려면 "시작" 클릭 합니다. 조이스틱, 초점에서 및 시야 (FOV)의 중심에 셀과 관심의 시 냅 스를 유지와 함께 벌레를 추적 합니다. 각 채널의 픽셀 통계를 표시 하려면 막대 그래프 창에서 '통계' 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>LED 전원 ≥의 연 접 종점에 최대 단일 픽셀 mCherry 형광 8000 카운트 되도록 조정 (~ 4000 photoelectrons), 주는 한 ~ 배경 위에 12 비트 동적 범위 (~ 100 photoelectrons). GCaMP5 신호 연 접는 휴식 (낮은) 캘리포니아2 + 주위 되어야 동안에 ~ 2500 계산-그냥 배경 위에 표시.</li>
	<li>레코드에 도달할 때까지 한 계란-누워 활성 상태; 일반적으로 야생-타입 웜7에서 20-30 분 마다 발생합니다. 10 민 하위 집합 (12,001 프레임), 첫 번째 계란-누워 이벤트 (프레임 6,001) 전후 6000 프레임을 저장 합니다. 동작 및 XY 스테이지 위치의 timepoints 벌레의 명시 이미지의 동일한 하위 집합을 유지 해야 합니다. 또는 데이터 스트림의 정확한 동기화 손실 됩니다.</li>
	<li>ImageJ BioFormats 플러그인을 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 비율 정량 소프트웨어에 가져올 수 있도록 이미지 시퀀스 이미지 Cytometry 표준 (.ics) 형식으로 변환 하려면.</li>
</ol>4. 이미지 세분화 및 정량 분석
<ol><li>비율 정량 소프트웨어에 이미지 시퀀스 가져오기 ( 재료의 표참조). '도구' 메뉴에서 ' 자동 대비 '를 클릭 하 고 적절 한 블랙을 설정 하는 각 채널의 명암 조정 (~ 1800) 수준 (10000) 흰색. MCherry 및 GCaMP5 채널 색상 지정 올바른그림 4(A-C)을 확인 하려면 도구 메뉴에서 ' 색상 변경...'을 선택 합니다.<ol>
<li>'시퀀스' 탭에서 시계열을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 20 프레임/s 및 1.25 µ m/픽셀을 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'도구' 메뉴에서 '비율'을 선택 하 고 ' 채널 B'에 대 한 '채널 A'와 "mCherry" "GCaMP5"를 선택 합니다. 각 이미지 시퀀스에서 배경 빼기 '임계값' 옆 "계산"을 클릭 합니다. "무지개 LUT 비율 채널에 적용"을 선택 합니다. 참고: 0.3 (낮은 캘리포니아2 +)의 평균 초기 계획 비율 및 2-3 (높은 캘리포니아2 +)의 최대 비율 기록에 대 한 적절 한 코드 체계표 것 0 (파란색)에서 1 (빨간색).</li>
	<li>(그림 4D) mCherry 채널을 사용 하 여 강도 변조 비율 채널을 생성 합니다. 강도 변조 비율 채널은 비 색 mCherry 채널의 밝기에 매핑되는 수백만의 색상 이미지입니다.</li>
	<li>'측정' 탭에서 '프로토콜' 창에 ' 찾을 개체 사용 하 여 강도 ' 도구를 드래그 하 여 개체 검색 프로토콜을 만듭니다. MCherry의 창에 강도 값을 설정 하 고 개체를 찾을 수를 '장부'를 클릭 합니다.<ol>
<li>강도 값 ≥ 2 선택 배경 위에 표준 편차 (SD) (의예, 한 ~ 65535의 2500, 상한). 연 접 종점 검출 되 고 측정 메뉴에서 선택 하는 '자동으로 업데이트 피드백' 다는 것을 확인 하십시오. 참고: 소프트웨어 식별할 수 있습니다 또한 개체 ' SD 강도.' 관련된 프로토콜을 사용 하 여 백그라운드에서 그들의 표준 편차 그러나, 특히 밝은 개체는 FOV를 입력 하면, 그것은 변경할 수 있습니다 극적으로 평균 강도 HSN을 찾는 데 사용 되는 강도 대진표에 영향을 미치는 그 timepoints 동안. 이 변화는 원시 강도 값 개체를 찾는 데 사용 하는 경우 발생 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>머리, 같은 원치 않는 개체를 제외 하는 데 필요한 경우만 mCherry 채널 (크기, 최대 강도, 등)을 대상으로 하는 추가 필터 꼬리, 및 형광 직감을 추가 합니다. 측정 메뉴에서 ' 측정 항목 만들기 '를 선택합니다 하 고 ' 모든 Timepoints'를 선택합니다 참고:이 쉼표로 구분 된 값 (.csv) 파일을 파일 메뉴에서 '내보내기' 명령을 사용 하 여 내보낼 수 해야 모든 측정을 쓰기 프로토콜을 실행 됩니다.</li>
	<li>Exported.csv 파일을 열고 새로운 시트로 Timepoint, 지역 (µ m2), 평균 (비율 채널), 중심 X (µ m), 및 중심 Y (µ m) 데이터를 복사. 열 머리글 없이 a.csv 파일을 내보냅니다. 비율 정량 소프트웨어 timepoint 당 하나 이상의 개체로 관심의 셀을 분류할 수 있습니다.<ol>
<li>'AnalzyeGCaMP_2017.m' 사용자 지정 스크립트를 사용 하 여 이러한 개체를 재결합. 참고: 스크립트 또한 캘리포니아2 + (비율) 봉우리는 데이터에서를 식별 하 고 그들의 timepoints, 피크 진폭 및 피크 폭의 a.csv 파일을 저장 합니다. 그것은 또한 원시와 주석 비율 추적에 대 한 포스트 스크립트 파일을 생성합니다. 이 정보와 함께, 캘리포니아2 + 과도 진폭 및 간 과도 간격을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>출력 X, Y 값은 중심 각 형광 개체에서 분재에서 XY 스테이지 스크립트에 의해 기록 된 X 및 Y 값을 추가 합니다. Net XY 위치를 사용 하 여 웜 운동 추적을 생성 하 고 셀 변위와 속도 다른 동작 상태31를 계산.</li>
	<li>가상 스택으로 ImageJ로 기록 된 대물 이미지를 가져옵니다. 계란-누워 이벤트 및 기타 주석을. 캘리포니아2 + 봉우리에 이러한 이벤트의 타이밍을 비교 하 여 비율 추적에서.</li>
</ol>

저자는 아무 경쟁 관심사 존재 선언 합니다.

Transgenes:
MCherry 식 코 돈 최적화 및 intron 삽입을 통해 개선 되었습니다 (그리고 대부분의 사용 가능한 GCaMP 기자 하지 않은), 때문에 주사 ~ 강한 Ca 중 GCaMP5 형광의 유사한 수준을 지키기 위하여 GCaMP5 표현 플라스 미드의 금액 x 4 2 + 과도입니다. Lin-15(n765ts) 돌연변이의 구조 유전자 변형 동물 계란-누워 다른 동작35에 대 한 최소한의 효과와 손쉬운 복구 할 수 있습니다. 균일 한 식 및 다른 동물25사이 조건 이미징 Transgenes는 통합 한다. 항생제 저항36,를 포함 하 여 선택 가능한 마커37 및 온도 민감한 lethals38 의 구조 또한 작동 한다, 그러나, 비-유전자 변형 동물 죽은, 때문에 transgene 통합의 확인 및 homozygosity 마커를 표시 형25제시에 비해 더 어려운입니다. 지배적인 마커 정상적인 운동을 방해 하 고 피트 니스, rol-6(dm), 같은 감소 피할된39이어야 한다. 라이트 1 이미징 돌연변이 배경 영상23,,4041동안 블루 빛 탈출 응답을 줄이기 위해 필수적 이다. Gur-3, 라이트-1 병렬에서 역할의 추가 돌연변이 잔여 동작과 푸른 빛42에 의해 발생 하는 생리 적 변화 최소화 추가 수 있습니다. 편리 하 게, gur-3, 라이트-1, 린-15 는 모두 하 고 있으며 캘리포니아2 + 이미징 및 optogenetic 실험에 대 한 새로운 긴장의 건설을 단순화 한다 염색체 X의 오른쪽 절반에.
때문에 노출 시간이 짧은 20 Hz에서 이미지 수집, GCaMP5 및 mCherry 신호 밝은 되어야 합니다. 시끄러운 캘리포니아2 + 녹음에 대 한 가장 가능성이 설명은 약한 기자 식으로 발생 하는 희미 한 형광 이다. 발기인은 또한 합리적으로 되 고 몇 군데 지역에 대 한 특정 해야 합니다. HSN 셀 몸과 외 음부 근육에 시 냅 스 인 바디의 중심에 있기 때문에 머리와 꼬리에 nlp-3 발기인에서 추가 식을 일반적으로 시야 밖에 서 이며에 추가 필터를 사용 하 여 제외할 수는 비율 정량 소프트웨어입니다. 되도록 세포내 캘리포니아2 +에서 GCaMP5 형광 결과 실제 변화에서에 변화를 관찰, GCaMP5 대신 GFP 표현 제어 transgenes 독립적으로 준비 해야 하 고26을 분석. 새로운 Ca2 + 기자와 다른 Ca2 + 감도, 속도, 색상 확대 이미징 도구를 사용할 수의 선택 하지만 각 새로운 기자 유효성을 검사 해야 사용 하 여 Ca2 +-구분 형광 변종14 ,16.
미디어:
고품질 한 천으로 이미징 NGM 접시를 준비 한다. 낮은 품질 agar 압력가 마로 소독, 떠나는 작은 입자는 분산형 이미징, 및 증가 배경 형광 빛에 완전히 분해 하지 됩니다. 분자 생물학 학년 agarose를 대신 사용할 수 있습니다 하지만 추가 금액 등가 플레이트 견고를 유지 하기 위해 감소 되어야 한다.
다른 설치 방법에 대 한 비교:
계란-누워 동작 회로에 이미지 활동에 이전 접근 agarose 패드 접착제로 움직일 웜 사용. 이러한 조건, 회로 활동 및 계란-누워 동작 문화 미디어 osmolarity8,10,,4445감소 없이 선호 하지 않습니다. 최근 기록은 몇 가지 웜 동작 자유롭게 행동 하는 동물에서 본 고정된 동물에서 관찰 된 세포 활동의 관계에 대 한 질문을 제기 운동 상태에 의해 변조 된 것은 제안 합니다. 우리는 최근 계란-누워 회로 활동 운동26,27와 위상 예기치 않게 나타났습니다. 마찬가지로, compartmentalized 캘리포니아2 + 에서 RIA interneuron 신호 통합 감각 신경 및 맨 위 모터 신경에서 활동 움직임46를 구하고 하는 동안. 배변 행동은 또한 정확 하 고 틀에 박힌 변화 폐기물47를 추방 하기 전에 그들의 꼴을 준 자리에서 이동 하는 동물을 허용 하는 운동에 의해 동반 됩니다. 함께, 이러한 결과 움직이지 동물에서 회로 활동의 간략 한 녹음 자유롭게 행동 하는 동물에서 얻은 그 근본적으로 다를 수 있습니다 것이 좋습니다.
바로 아래는 coverslip 임에도 불구 하 고 벌레의 동작은 표준 NGM 접시에 본 비슷합니다. 누워 계란 해치로 이동 하며 작은 양의 음식 입금 L1 애벌레 성인 (데이터 표시 되지 않음)으로 성장 하 큰 한 청크 크기 적당 한 가스 교환 가능 하며 탈수, 비록 음식을 너무 많이 배경 형광을 증가할 것 이다 저항. 이 방법은 성인을 위한 최고 동안, 기술은 이미지 L4 동물도 사용할 수 있습니다. 그러나, 청크 사이 coverslip 수성 층의 두께 더 작은 애벌레 어려움이 크롤 링, 그리고 자주 움직이는 성인에 갇혀 얻을 수 있습니다.
이 설치 기술 한계 시체의 정확한 지역 직접 기계적 또는 화학적 자극은 어렵다는 것입니다. 최근 개발 패턴된 조명 기술에 머리 또는 꼬리 표현 미생물 opsins 별도 조명 별도 여기 및 midbody48,49에 GCaMP/mCherry 형광의 탐지에 대 한 허용. 그 결과, optogenetic 접근을 사용 하 여이 문제를 극복 하기 위해 가능한 수 있습니다.
다른 Ca에 대 한 비교 2 + 이미징 접근:
이 메서드는 세포질 캘리포니아2 + 에서 단일 변경 기록에 대 한 아주 잘 작동, 세포와 그들의 시 냅 스 영역을 해결 합니다. 머리에 신경의 실시간, 체적 영상 최근 quantitate nucleoplasmic 칼슘50,,5152에 변화 하는 세포 핵의 위치 셀 식별에 대 한 사용 하 여 달성 되었습니다. 핵과 시 냅 스 캘리포니아2 + 사이 관계는 불분명 남아 있습니다. 우리의 데이터 HSN 세포내 캘리포니아2 + 에서 가장 눈에 띄는 변경 셀 소마 (그림 4D)에서 연 접 테르미니에서 발생 하는 것이 좋습니다. HSN와 VC 신경의 연 접 테르미니26postsynaptic 외 음부 근육 포함 됩니다. 회전 하는 디스크 또는 체세포 칼슘 셀 식별에 대 한 몇 가지 방법으로 의존 하지 않고 특정 셀에 연 접 캘리포니아2 + 신호를 돌리다 빛 시트 기술을 함께 Z 차원에서 충분 한 해상도 것 여부는 확실 하지 않습니다. . 여기 설명 된 기술을 사용 하 여 각 10 분, 2 채널 12,001와 녹음 256 x 256 픽셀 16 비트 TIFF 이미지는 ~ 4 GB. 비율과 강도 변조 비율 채널을 두 번 파일 크기 ~ 8GB. 두 genotypes (야생 형 및 실험)의 각각에서 10 동물을 기록 하는 전형적인 실험 거의 150 GB의 기본 데이터를 생성 하 고 수집 하 고 분석 20 h를 요구 한다. 더 많은 데이터와 같은 몇 가지 연구 완료 왜 설명 하는 분석 시간 volumetric 분석 timepoint 당 10 Z 조각 가진 크기 순서 필요 합니다.
하드웨어:
우리는 기록 하 고 분석 하는 높은-성능 듀얼 프로세서 워크스테이션에서 이미지 시퀀스 (예: 게임) 그래픽 카드, 64 GB의 RAM, 그리고 고성능 솔리드 스테이트 드라이브 ( 재료의 표참조). 데이터 네트워크 중복 배열의 독립 디스크 (RAID)에 저장 하 고 오프 사이트 데이터 센터에 클라우드로 백업 해야 합니다.
금속 할로겐 또는 수은 기반 광원 펄스 형광 여기 Led 조명을 사용 하 고 출력 하는 것이 좋습니다. 몇몇 상업적으로 사용 가능한 멀티 컬러 LED 시스템을 사용할 수 있습니다. 이러한 LED 시스템의 일부는 더 높은 초기 비용, 그러나 그들은 긴 수명 (> 20000 h), 수 동시에 4 개 이상의 다른 fluorophores 자극 있고 낮은 대기 시간 (10-300 µs 스위치 직렬 또는 TTL 인터페이스를 사용 하 여 정확한 시간적 제어를 제공 시간)입니다. 때 데이터가 실제로 수집 되는 샘플만 조명 하면 트리거링. 우리는 일반적으로 10 ms 노출 모든 50 밀리초 (20% 듀티 비율)를 사용합니다. 이 phototoxicity 고 이미지 캡처, 이전에 보고 된43동안 모션 흐림.
우리는 그들의 속도 및 작은, 중요 한 픽셀의 큰 배열에 대 한 sCMOS 카메라를 사용합니다. EM-CCD 카메라는 더 비싼 대안 이지만 '블 룸' 효과 캡처된 photoelectrons 인접 한 픽셀에 흘리 고에서 발생할 수 있습니다. 새로운 백 조명 sCMOS 카메라 비용 크게 절감된에 EM CCDs의 비슷한 햇빛이 있다. 관계 없이 어떤 센서를 사용 하는 GCaMP5 및 mCherry 채널 가져와야 합니다 동시에. 벌레의 이동에 순차 캡처는 제대로 등록 된 이미지 비율 정량에 적합으로 이어질 것입니다. 듀얼 채널 영상 분한 후 하나의 카메라에 달성 될 수 있다 이미지 분배기 (그림 2)를 사용 하 여 또는 두 개의 동일한 카메라를 사용 하 여 채널의. 16 비트 이미지의 동적 범위는 정확한 비율 정량에 대 한 8 비트 이미지에 권장 됩니다. 대물 웜 동작의 이미지, 우리 JPEG 압축 후 큰 2 x 2 범주화 된 1024 x 1024 8 비트 이미지 시퀀스를 캡처하는 1 인치 4.1 MP 근처-적외선 u s b 3 카메라를 사용 하 여 캡처. 새로운 현미경 모델에서 사용할 수 있는 더 큰 FOV 0.63 x demagnification만: 약간의 vignetting (그림 4E) 후 20 x에서 시각을 성인 웜 수 있습니다.
표준 TTL 전압 신호를 사용 하 여 조명 및 프레임 캡처를 동기화 하는 것이 좋습니다. 다른 소프트웨어 프로그램에서 잠재적인 대기 시간 때문에 사용자가 형광 카메라 트리거 출력 마스터와 구성 TTL 출력 다른 모든 장치를 운전 하는 것이 좋습니다. 이 방법에서는, 명시 및 위치 정보는 각 Ca2 + 측정에 대 한 수집 됩니다.
슬릿-또는 공 진 포인트 검사 confocal 현미경 confocal 공유 시설에서 일반적으로 발견 또한 비율 캘리포니아2 + 이미징 동안 우수한 성능을 제공 합니다. 그런 계기는 대물24함께 여러 형광 채널 캡처를 사용할 수 있습니다. 이 경우에, confocal pinhole의 최대 직경에 열 한다 그리고 GCaMP5, mCherry, 및 적외선 관찰법 신호를 분리 하는 스펙트럼 검출기를 사용 해야 합니다. 이 두께에서 가벼운 컬렉션을 극대화 (~ 20 µ m) 밖으로의 초점 형광의 거부 하면서 슬라이스. 하나의 단점은 작은 FOV와 하드웨어 및 소프트웨어 사용자 지정에 대 한 더 많은 제한입니다.
소프트웨어:
대부분의 제조 업체는 발송 하 고 독점 소프트웨어를 포함 하 여 입력 및 출력을 트리거링의 구성 그들의 카메라와 현미경을 설치. 기능 및 녹음 하는 동안이 소프트웨어의 성능 달라질 수 있습니다. 빨리 움직이는 벌레 추적 하기 어려울 수 있습니다, 때문에 이미지 표시 해야 원활 하 고 안정적인 20 Hz에서 기록 하는 동안. 성능 향상을 위해 이미지 시퀀스 저장할 수 있습니다 일시적으로 RAM에 실험의 끝에 저장 하는 행동 관련 하위 집합으로. 이러한 2 채널 이미지 시퀀스 파일 비율 정량 소프트웨어로 가져오기 위한 오픈 이미지 Cytometry 표준 형식 (.ics)으로 변환할 수 있습니다. 오메-TIFF는 최근 오픈 소스 이미지 형식, 비록 다른 설치 수 있습니다 4 GB 보다 더 큰 TIFF 이미지 시퀀스를 저장할 수 없습니다.
정량 파이프라인의 주요 기능은 비율 채널 그리고 관심사의 세포를 찾을 수 mCherry 형광을 사용 하 여 편견된 이미지 세분화 절차의 세대입니다. 각 발견 개체에서 개체 크기, XY 중심 위치 및 최소, 의미, 그리고 각 채널 (를 포함 하 여 비율 채널)에 대 한 최대 형광 강도 값은 계산 됩니다. 함께, 이러한 값 quantitate 세포내 캘리포니아2 + 녹음에서 각 timepoint에 변경 하는 데 사용 됩니다. 각 timepoint에 대 한 개체 측정 다음 후속 분석을 위한 a.csv 파일로 내보내집니다.
여기에 설명 된 프로토콜의 주요 한계는 소프트웨어 제품의 패치워크를 통해 다양 한 형태의 데이터 이동에 대 한 의존 이다. 추가 자극 그 소프트웨어의 일부 오픈 소스와 무료 이며 다른 폐쇄 하는 동안, 비싼, unevenly 업데이트입니다. 주요 개선 사용 하거나 비슷한 수준의 성능 및 용이성-사용의 수집에서 분석을 제공 하는 소프트웨어 (이상적으로 오픈-소스)의 한 조각을 개발 하는 것입니다. 위에서 설명 했 듯이, 비율 분석 파일 크기와 실험을 완료 하는 데 필요한 시간을 두 배로. 분재 실시간, 크게 개선 처리량에서 이미지 및 기타 데이터 스트림을 수집 하 여 분석 수 같은 사용자 지정이 가능한 프레임 워크에 통합 될 수 있는 카메라 드라이버의 세대.
미래 전망:
우리는 일반적으로 수동으로 웜 움직임을 추적, 하는 동안 추적 적외선 밝은 또는 어두운-필드 녹음에서 감지 웜 중심의 자동 폐쇄 루프 조정 단계 위치를 제공 하는 노드를 처리 하는 추가 이미지에 대 한 허용 해야 추적 (그림 3 및 데이터 표시 되지 않음). 이 방법으로 얻은 형광 기록의 대부분은 어둡고 생물학 데이터를 재미 없는. 에 센서 또는 실시간 포스트 수집 이미지 처리 기술 관련 개체에 이미지 시퀀스를 자르기 것 증가 공간 해상도 대 한 허용 하 고 각 추가 Z-조각 수집 하는 경우에 특히 데이터 분석 파이프라인을 신속 하 게 timepoint 회로에 모든 사전 및 postsynaptic 세포 내에서 활동을 시각화.

신경 과학의 중앙 목표는 신경 회로 드라이브 동물 행동에 통신 하는 방법을 이해 하는 것입니다. 신경 회로 회로 활동, 그로 인하여 행동 변화 그들의 환경에 대응 하는 동물에 필요한 운전 변경 하려면 다양 한 감각 신호의 범위를 통합 합니다. 선 충 류, C. 선 충, 있다 302 뉴런의 시 냅 스 연결 되어 완전히 매핑된1와 간단한 신 경계. 또한, 인코딩할 neurotransmission에 관련 된 단백질을 위한 유전자는 매우 C. 선 충 및 포유류2사이 보존 됩니다. 신경 시스템의 해 부 단순에도 불구 하 고 신경 행동3를 조절 하는 방법을 이해 하는 비옥한 플랫폼을 제공 하는 보존된 행동의 복잡 한 레 퍼 토리를 표시 합니다.
C. 선 충 은 다양 한 유전자 조작, 레이저 셀 절제, electrophysiological 기법 뿐만 아니라 vivo에서 광학 이미징4,5등 접근의 적용 의무가. 최근 연구는 주요 신경 전달 물질 신호 C. 선 충 등은 해와 GABAergic 신경 네트워크 시스템의 상세한 지도 생산 했습니다. 모든 신경 G-단백질 결합 수용 체의 표현 지도에 지속적인 연구와 이러한 연구가이 모델 매우 상세한 구조를 활용 하 여 독특한 위치에 놓고 기능 신경 연결 지도 완벽 하 게 이해 하는 것이 다른 수용 체 그리고 드라이브 동물 행동의 다양 한 측면에 날짜 표시줄을 통해 신호를 다른 신경 전달 물질.
어떤 시스템에서 동적 신경 활동 패턴을 공부 하기 위해 필수적인 전제 조건 동작 중 개별 뉴런 또는 전체 회로에 활동을 기록 하기 위해 강력한 방법론을 개발 하는 것입니다. 특히 중요 한 시 냅 스 소포 융해는 연 접 활동 시각화 같은 광학 접근법의 순종이입니다. 세포내 캘리포니아2 +, 민감한 검출기의 증가 가용성 함께 신속 하 고 매우 민감한 형광 기자 동작 시 세포와 시 냅 스 활동이 깨어 있는, 살아있는 동물에서의 녹음을 혁명 있다. 시 냅 스 전기 활동의 주요 결과 Ca2 + 채널을 조절 하는, 때문에 세포내 캘리포니아2 + 에서 변경 셀 활동에 충실 하 게 보고서 행동 관련 변화 생각 된다.
이 연구에서 우리는 C. 선 충6,7에 낳는 행동을 촉진 serotonergic HSN 모터 신경에 있는 비율 캘리포니아2 + 이미지를 수행 하는 방법을 제시. 동작5,,89,10,11 동안 캘리포니아2 + C. 선 충 에서 활동과 계란-누워 회로 시각화 하는 이전 노력을 바탕으로이 접근 . 메서드를 사용 하면 동시에 계란-누워 이벤트와 셀/회로 활동에서 관찰 된 변화 뿐만 아니라 동물 운동 상태에서 변화를 상관 관계를 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 어른 벌레의 활동을 공부 우리가 우리의 실험실에서 게시 되지 않은 작업이 이렇게 네 번째 애벌레 (L4) 단계에서 뿐만 아니라 청소년 동물 확장할 수 있습니다 보여 줍니다. 그것은 가능성이 뚜렷한 회로 및 동작에 기능 다른 선 충 C. 뉴런의 활동 마찬가지로이 기술 접근 해야한다. 다른 최근 빠른 Ca2 + 지표 겹치지 방출 스펙트럼12,13,,1415,16, optogenetic 도구17 개발 , 유전자 인코딩 막 전압18광학 지표, 변화 신경 회로 활동에 뚜렷한 동작 상태를 드라이브 하는 어떻게에 관통 ' 모든 광학 ' 조사를 수행 하기 위해 우리를 허용 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>C. elegans 성장, 재배 및 장착</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli 박테리아 균주, OP50</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>OP50</td><td>C. elegans를 위한 음식. 우라실 auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1</td></tr><tr><td>HSN GCaMP5+mCherry 웜 균주</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>LX2004</td><td>HSN에서 GCaMP5 및 mCherry 발현을 유도하기 위해 nlp-3 프로모터를 사용한 통합 이식유전자.&nbsp; 전체 유전자형:&nbsp; vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X</td></tr><tr><td>lite-1(ce314), lin-15(n765ts) transgene preparation을 위한 돌연변이 균주</td><td>저자</td><td>LX1832</td><td>pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid를 사용한 미세주입 후 고복사 전이유전자 회수를 위한 균주. 또한 청색광 민감도를 감소시키는 linked lite-1(ce314) 돌연변이를 가지고 있습니다. 요청에 의해 저자가 입수할 수 있음</td></tr>: <tr><td>pL15EK lin-15a/b 게놈 구조 플라스미드</td>, <td>저자</td><td>pL15EK</td><td>LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X 균주에 주입 후 형질전환 동물 회수를 위한 구조 플라스미드. <</td></tr><tr>em>nlp-3 promoter의 HSN에서 mCherry의 발현을 위해<td>pKMC299 plasmid</td><td>저자</td><td>pKMC299</td> Plasmid의 요청에 의해 저자가 사용할 <td>수 있습니다. <> <em<nlp-3/em> 3' 미번역 영역</td></tr><tr><td>pKMC300 플라스미드</td><td>저자</td><td>pKMC300</td><td>플라스미드 em>nlp-3 프로모터의 HSN에서 GCaMP5의 발현을 위한 pKMC300 플라스미드가 있습니다. NLP-3 3' 번역되지 않은 영역</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>P8281</td><td>NGM 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>P5655</td><td>NGM 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td>NGM 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Alfa Aesar</td><td>12312</td><td>NGM 플레이트 제조</td></tr>용 <tr><td>Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211820</td><td>NGM 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td>NGM 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td>NGM 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>한천, 세균 유형 A, 초순수</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>NGM 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-164&nbsp;</td><td>NGM 플레이트 준비용</td></tr><tr><td>24 x 60 mm 마이크로 커버 유리, #1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td>웜을 이미지화하는 커버 유리</td></tr><tr><td>22 x 22 mm 마이크로 커버 유리, #1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>한천 덩어리 상단을 덮는 커버 유리</td></tr><tr><td>투과광 베이스가 있는 실체현미경</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>웜 변형 유지, 스테이징 및 플래티넘</td></tr><tr><td>이리듐 와이어 장착을 위한 해부 현미경, (80:20), 0.2mm</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA39526-BW</td><td>웜 이동</td></tr><tr><td><강>칼슘 이미징 현미경</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진동 방지 공기 테이블</td><td>TMC</td><td>63-544</td><td>Micro-g' 실험실 테이블 30" x 48" 방진 테이블(25mm 상단 도</td></tr><tr><td>립 복합 현미경</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Axio Observer.Z1 반전 microscope</td></tr><tr><td>Sideport L80/R100 (3 position)</td><td>Zeiss</td><td>425165-0000-000</td><td>출력의 20%를 명시야(CMOS) 카메라로, 80%를 형광(sCMOS) 카메라로 전환하기 위해</td></tr><tr><td>Tilt Back Illumination Carrier</td><td>Zeiss</td><td>423920-0000-000</td><td>적외선/행동 이미징</td></tr><tr><td>램프하우징 12V/100W w/ 수집기</td><td>Zeiss</td><td>423000-9901-000</td><td>적외선/행동 이미징</td></tr><tr><td>할로겐 램프 12V/ 100W</td><td>Zeiss</td><td>380059-1660-000</td><td>적외선/행동 이미징용. 백색광 LED는 상당한 적외선을 방출하지 않으므로 적외선 대역 통과 필터</td></tr><tr><td>32mm 적외선 대역 통과 필터 (750-790 nm) 후</td> 명시야 이미징을 허용하지 않습니다 할로겐 램프 <td>Zeiss</td><td>447958-9000-000</td><td>BP 750-790; DMR 32mm, 명시야 및 동작용 적외선 조명용</td></tr><tr><td>6-필터 콘덴서 터렛(LD 0.55 H/DIC/Ph), 전동</td><td>Zeiss</td><td>424244-0000-000</td><td>적외선/동작 이미징</td></tr>용 <tr><td>콘덴서 및 셔터</td><td>Zeiss</td><td>423921-0000-000</td><td>적외선/행동 이미징</td></tr>용 <tr><td>포토튜브가 있는 쌍안경 CMOS 카메라</td><td>Zeiss</td><td>425536-0000-000</td><td>적외선/행동 이미징용</td></tr><tr><td>접안경 10x, 23mm</td><td>Zeiss</td><td>444036-9000-000</td><td>아가르 청크의 웜 현지화용</td></tr><tr><td>C-마운트 어댑터 2/3" 0.63x 확대경</td><td>Zeiss</td><td>426113-0000-000</td><td>마운트용 적외선 CMOS 카메라</td></tr><tr><td>CMOS 카메라 적외선 명시야 및 동작을 위한 카메라 (1" 센서)</td><td>FLIR (이전에는 Point Grey Research)</td><td>GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>명시야 이미징을 위한</td></tr><tr><td>카메라 USB 3.0 호스트 컨트롤러 카드</td><td>FLIR (이전에는 Point Grey Research)</td><td>ACC-01-1202</td><td>Fresco FL1100, 4 포트</td></tr><tr><td>8 핀, 1m GPIO 케이블, Hirose HR25 원형 커넥터&nbsp;</td><td>FLIR (formerly Point Grey Research)</td><td>ACC-01-3000</td><td>TTL 트리거링용 케이블. 녹색 선은 GPIO3 / Pin 4에 연결되고 갈색 선은 Ground / Pin 5</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td>배율, 개구수 및 작동 거리의 최상의 조합</td></tr><tr><td>6-cube Reflector Turret, Motorized</td><td>Zeiss</td><td>424947-0000-000</td><td>형광 이미징용</td></tr><tr><td>Fluorescence Light Train, 전동</td><td>Zeiss</td><td>423607-0000-000</td><td>형광 이미징용</td></tr><tr><td>형광 셔터</td><td>Zeiss</td><td>423625-0000-000</td><td>형광 이미징용</td></tr><tr><td>GFP 및 mCherry 이중 여기 및 방출 필터 큐브(현미경용)</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed 형광 이미징용</td></tr><tr><td>LED 조명 시스템</td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Triggerable Colibri.2 형광 조명용 LED 시스템</td></tr><tr><td>GFP LED 모듈(470nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td>Colibri.2 GFP 형광 여기용</td></tr><tr><td>LEDMCherry LED 모듈(590nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9082-000</td><td>Colibri.2 mCherry 형광 여기용</td></tr><tr><td>LED 투사광 장비용 조리개 스톱 슬라이더</td><td>Zeiss</td><td>000000-1062-360</td><td>LED 조명을 카메라 시야</td></tr><tr><td>로 제한하기 위한 시야 조리개 조리개C-마운트 어댑터 1" 1.0x</td><td>Zeiss</td><td>426114-0000-000</td><td>이미지 스플리터 및 sCMOS 형광 카메라용 어댑터</td></tr><tr><td>이미지 스플리터</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Gemini W-View, 기타 이미지 스플리터를 사용할 수 있지만 sCMOS 카메라의 대형 센서 크기에 최적화되지 않을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>GFP / mCherry 이색성 미러(이미지 스플리터)</td><td>Semrock</td><td>Di02-R594-25x36</td><td>mCherry 및 적외선에서 GCaMP5 분할 신호</td></tr><tr><td>GFP 방출 필터 (이미지 스플리터)</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30-25</td><td>GCaMP5 형광</td></tr><tr><td>캡처Cherry/ 방출 필터 (이미지 스플리터)</td><td>Semrock</td><td>FF01-647/57-25</td><td>이 필터는 명시야 이미징에 사용되는 적외선을 제외하는 데 필요합니다</td></tr><tr><td>형광용 sCMOS 카메라 (1" 센서)</td><td>Hamamatsu</td><td>A12802-01 / C11440-22CU</td><td>오르카 플래시 4.0 V2. 최신 모델은 센서의 개별 반쪽에서 별도의 이미지 획득 설정을 허용하여 이미지 분배기</td></tr><tr><td>전동 XY Stage</td><td>M&auml과 함께 2채널 이미지를 획득할 수 있습니다. rzh&auml; 사용자</td><td>스캔 IM 130 x 100</td><td>스테이지 이동; 이 스테이지의 XY 해상도는 0.2마이크로입니다. M / 단계&nbsp;</td></tr><tr><td>XY 스테이지 컨트롤러, 조이스틱,</td><td>LUDL</td><td>MAC6000, XY 조이스틱</td>, <td>웜 수동 추적. MAC6000 컨트롤러는 232 보드 디지털 수집 보드(DAQ)로 구성된 직렬(RS-115200) 포트를 통해 PC에 연결해야 합니다</td></tr><tr><td>.</td> <td>Arduino</td><td>Uno</td><td>sCMOS 카메라에서 TTL 트리거를 수신합니다. Uno는 표준 Firmata 패키지와 함께 로드되어야 하며 컴퓨터 USB 포트는 57600 baud</td></tr><tr><td>BNC Male to BNC Male 케이블 - 6피트</td><td>Hosa Technology</td><td>HOBB6</td><td>BNC 커넥터로 구성되어 있습니다. TTL 트리거링을 위한 BNC</td></tr> 커넥터 <tr><td>금도금 BNC Male to SMA 수 동축 케이블(8.8")</td><td>uxcell</td><td>608641773651</td><td>형광 카메라 트리거 출력</td></tr><tr><td>BNC 턴 헤드 어댑터</td><td>Hantek</td><td>RRBNCTH21</td><td>BNC-바나나 플러그 어댑터(4mm)</td></tr><tr><td>BNC 암-암 커넥터</td><td>Diageng</td><td>20130530009</td><td>-암 BNC 어댑터로 카메라의 BNC 출력을 바나나 플러그</td></tr><tr><td>무납땜 유연한 브레드보드 점퍼 와이어</td><td>Z&에 연결합니다. T</td><td>GK1212827</td><td>BNC 트리거 출력을 Arduiono DAQ에 연결합니다. 남성에서 남성으로.</td></tr><tr><td>고성능 워크스테이션</td><td>HP</td><td>Z820</td><td>Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon 프로세서, 솔리드 스테이트 C: 드라이브, 시리얼 (RS-232) 포트, 이더넷 연결을 위한 다중 PCIe3 슬롯, USB 3.0 카드 및 추가 솔리드 스테이트 드라이브</td></tr><tr><td>M.2 솔리드 스테이트 드라이브</td><td>삼성</td><td>MZ-V5P512BW</td><td>고속 스트리밍 및 이미지 데이터 분석</td></tr><tr><td>M.2 솔리드 스테이트 드라이브 어댑터&nbsp; 워크스테이션용</td><td>Lycom</td><td>DT-120</td><td>M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter</td></tr><tr><td>Network Attached storage</td><td>Synology</td><td>DS-2415+</td><td>이미징 데이터 저장 및 분석</td></tr><tr><td>하드 디스크 드라이브</td><td>Western Digital</td><td>WD80EFZX</td><td>RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. 이미징 데이터 저장(10개 드라이브 + 2개 드라이브 중복)</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Acquisition</td><td>Hamamatsu</td><td>HCImage DIA</td><td>20fps에서 2채널(GCaMP5 및 mCherry) 형광 이미지 시퀀스 레코딩</td></tr><tr><td>Brightfield Acquisition</td><td>FLIR(구 Point Grey Research)</td><td></td><td>Flycapture 명시야 JPEG 이미지 시퀀스 레코딩</td></tr><tr><td>스테이지 시리얼 포트 리더</td><td>분재</td><td>https://bitbucket.org/horizongir/bonsai</td><td>행동 중 웜 추적을 용이하게</td></tr> 합니다. <tr><td>LED 컨트롤러 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>Micro Toolbox Test 2011</td><td>Colibri.2 유닛의 다양한 LED에 대한 강도 및 트리거 입력을 설정합니다.</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td>Ratiometric Quantitation 소프트웨어 Excel Microsoft로 가져오기 위한 이미지 시퀀스 및 형식 변경 사항에 대한 간단한 검토</td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp; 2002984-001-000001</td><td>MATLAB 분석을 위한 Volocity에서 쉼표로 구분된 값 데이터의 부분 집합을 생성하기 위해</td></tr><tr><td>Peak Finding</td><td>MATLAB</td><td>R2017a</td><td>비율 피크 특징 계산에 사용되는 스크립트</td></tr><tr><td>Ratiometric Quantitation</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>비율계량 이미지 채널 계산, 객체 찾기를 위한 이미지 세분화 및 발견된 객체의</td></tr> <tr><td>비율 측정을 용이하게 합니다.Scripts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY-stage-final.bonsai</td><td>분재</td><td>TTL 트리거 DAQ 및 스테이지 위치 직렬 포트 리더</td><td>는 연결된 Arduino가 프레임 노출 중에 sCMOS 카메라로부터 양의 TTL 신호를 수신할 때 X 및 Y 스테이지 위치(미크론)를 기록합니다. 스크립트는 프레임 번호, X 위치(미크론), Y 위치(미크론) 및 프레임 간 경과 시간(일반적으로 20fps로 녹화할 때 ~50msec)의 4개 열이 있는 .csv 파일을 작성합니다. 이 출력의 X 및 Y 스테이지 위치(각각 2열과 3열)가 AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB 스크립트의 X 및 Y 중심 위치(각각 4열과 5열)에 추가되어 녹음을 위한 형광 물체의 최종 X 및 Y 위치를 제공합니다.</td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

그것은 행동 하는 동물에서 신경 회로 활동 마 취 또는 움직이지 동물에 본에서 실질적으로 차이가 점점 더 분명 되었다. 매우 민감한, 유전자 인코딩된 형광 기자 캘리포니아2 + 의 세포와 동작 동물에 비-침략 적 광학 접근을 사용 하 여 시 냅 스 활동의 기록을 혁명 있다. 유전자와 결합 될 때 optogenetic 기술, 분자 메커니즘을 다른 동작 상태를 확인할 수 있습니다 동안 셀 및 회로 활동을 조절 하 고.
여기는 자유롭게 행동 하는 꼬마 선 충 벌레에 단일 뉴런의 비율 캘리포니아2 + 이미징 방법에 설명 합니다. 동물에서 기록 허용 부드럽게 오버레이 웜 표준 선 충 류 성장 미디어 (NGM) agar에 유리 coverslip로 차단 간단한 설치 기술 시연 무제한 움직임과 동작 동안 고해상도. 이 기술을 사용 하 여 민감한 Ca2 + 기자 GCaMP5 그들은 드라이브를 낳는 행동으로 세포내 캘리포니아2 + serotonergic 자웅 동체 특정 신경 (HSNs)에 있는 변화를 기록. MCherry, Ca2 +공동 표현으로-구분 형광 단백질, 우리 내 HSN의 위치를 추적할 수 있습니다 ~ 1 µ m 및 변동 변화 초점 또는 운동에 의해 발생 하는 형광에 대 한 올바른. 동시, 적외선 관찰법 이미징 동작 기록 및 동물 추적 전동된 스테이지를 사용 하 여 수 있습니다. 이러한 미세한 기술 및 데이터 스트림 통합, 비활성 및 활성 동작 상태 이상 수만 분의 진행으로 C. 선 충 계란-누워 회로 캘리포니아2 + 활동 기록할 수 있다 우리.

간단한 설치 기술 설명 (그림 1) 유리 coverslip (그림 4)를 통해 동물 행동에 기록 하는 높은 해상도 허용 하면서 L4와 성인 C. 선 충 의 문화 환경에 최소한의 변경 발생 합니다. LED 광원, 무대 컨트롤러 및 카메라 노출의 동기화 수 20 프레임/s에서 여러 스트림에서 데이터 수집에 대 한 최대 1 h. 중간에 높은 수 가늠 구멍 목표 (0.7-0.8)와 배율 (20 x) 제공 좋은 4 x 4 픽셀 비 닝 (1.25 µ m/픽셀)와 계란-누워 동작 회로에 시 냅 스 영역의 공간 해상도. 동시 취득은의 GCaMP5 및 mCherry 형광 신호 (그림 4A, B)는 동물 운동에 초점 (그림 4D) 변화에 대 한 보상으로 픽셀 비율 채널을 생성 하는 데 사용 됩니다. HSN 연 접 종착역은 큰 C. 선 충에 많은 신경 셀 시체와 연 접 HSN 캘리포니아2 + 에서 변화 명확 하 게 구상 될 수 있다. 적외선 관찰법 카메라의 큰 FOV 웜을 (그림 4E)을 기록 하는 동안 수동으로 추적할 수 있습니다. 각 동물에 대 한 세포내 캘리포니아2 + 에서 변경 동작 명시 이미징 등 계란 자료 변화 운동의 (그림 4E) 분명 상관 될 수 있다.
HSN 캘리포니아2 + 그리고 속도의 정량 확인 벌레에 그들의 운동 변경 그들은 계란-누워 동작을 전환 합니다. 전에, 하는 동안, 그리고 계란-누워 활성 상태 (그림 5A) 후 웜 속도에 큰 차이가 있다. 이 영상 또는 추적 시스템에 내재 된 잡음에 의해 발생 하지 않습니다. 우리는 강한 관찰 한 계란-누워 이벤트로 확대, 계란-누워 이벤트 mCherry 형광은 상대적으로 이전 GCaMP5 형광 (δ/F)에 변화 (그림 5B) 변경. GCaMP5:mCherry 비율 (ΔR/R)에 측정된 변화 명확 하 게 표시는 HSN 캘리포니아2 + 과도 ~ 달걀 출시 (그림 5B) 4 s 사전. 외 음부 근육 수축과 일치, 웜 운동의 분명 둔화 발생 합니다 계란 끝 출시. 이전 결과 강한 외 음부 근육 수축 그리고 계란 릴리스 8,,1027는 HSNs에 의해 innervated 있습니다 해 VC 모터 뉴런 피크 활동을 보여 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 표시 VC 뉴런의 optogenetic 활성화 운동의 즉시 감속 드라이브 VC 신경 외 음부 근육 수축에 의해 활성화 될 수 있습니다 제안, 그로 인하여 달걀 출시27의 피드백을 받을 때까지 운동 속도 .
영상과 추적 시스템 설명 계란-누워 동작 (그림 5C)의 공간 조직의 시각화 수 있습니다. 이전 표시, 웜 입력 활성 상태로32직전 앞으로 운동의 지속적인된 실행. 웜 한 천 덩어리의 센터에서 박테리아에 구하고 그들의 시간의 대부분을 보내는. 항목이 활성 상태로, 이전 웜 드문 HSN Ca2 + 과도의 모양을 일치 음식을 멀리 이동 합니다. HSN 활동 다음 여러 간격이 HSN 캘리포니아2 + 과도 낳는 이벤트를 유지 하는로 버스트 발사에 전환 합니다. 벌레 종종 돌아서, 다시 앞으로 운동, 그리고 다시 그들의 시작 위치 OP50 박테리아 근처 쪽으로는 길에 알. 우리는 로컬 O2 와 CO2 농도 변화 벌레 계란33,34을 결정 좌우 수 추정 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> 그림 1. C. 선 충 계란-누워 회로 활동 및 행동의 고해상도 이미징 기술을 장착. 상단, 측면에서 마지막 마운트입니다. 바닥, 큰 coverslip의 바닥을 통해 본으로 최종 마운트. 화살표는 OP50 세균성 음식, C. 선 충 벌레 및 계란, NGM 한 천 덩어리와 큰 24 m m x 60 m m coverslip 사이 끼여 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> 그림 2 . Widefield 비율 캘리포니아2 + 이미징 및 거꾸로 epifluorescence 현미경에 기록 하는 동작. (A) 웜 위치 및 행동 (0.8 없음) x 20 통해 명시에서 캡처한 계획 Apochromat 목표 NGM 청크를 통해 할로겐 램프에서 발산 되는 적외선 (750-790 nm) 빛 (보라색 화살표)를 사용 하 여. 조이스틱 및 전동된 스테이지 컨트롤러 보기의 필드에 벌레 기록 하는 동안 유지 하는 데 사용 됩니다. 단계 위치 (δ x, δ y) PC 직렬 포트에 의해 보내집니다. 470을 사용 하 여 벌레에 표현 하는 GCaMP5 및 mCherry 단백질 흥분 (파란색 화살표) 및 590 nm (노란색 화살표) 발광 다이오드 (LED). GCaMP5 방출 (녹색 화살표) 적외선 빛 함께 mCherry (주황색 화살표) 형광 멀티 밴드 dichroic 거울을 통해 전달 ( 재료의 표참조). 80/20 빔-스플리터 적외선-민감한 CMOS 카메라 (보라색 화살표)에 캡처 0.63 x demagnifer 통해 빛의 20%를 전송합니다. 빛의 나머지 80%는 GCaMP5를 분리 하는 이미지 분배기를 현미경의 측면 포트를 통해 전달 되 고 mCherry 형광에 적외선 관찰법 빛을 제거 하는 동안 sCMOS 카메라의 반쪽을 분리. 둘 다 카메라에서 데이터는 u s b 3 케이블을 통해 PC에 전송 됩니다. 트리거 포트 (파란색) 형광 sCMOS 카메라에서 보내는 데 사용 됩니다 + 5V TTL LED 조명 시스템, 적외선 관찰법 CMOS 카메라와 디지털 수집 장치 (DAQ)을 트리거합니다. (B) 트리거 3 출력 TTL 신호를 DAQ 디지털 핀 # 8에 의해 검색 하 여 USB 연결을 통해 PC로 전송. 이러한 디지털 입력 방 아 쇠는 ' 어디 XY' X 및 Y 위치 각 GCaMP5/mCherry 형광/적외선 이미지 캡처에 대 한 단계를 읽고 분재 소프트웨어 스크립트 (XY-단계-최종) 직렬 명령. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> 그림 3 : 분재 직렬 단 통신 스크립트 XY 스테이지 최종 레이아웃. 탑 (핑크) DigitalInput 노드는 DAQ의 핀 # 8에 TTL 트리거 읽습니다. 각 긍정적인 TTL 전압 (녹색)는 DAQ (파란색)는 타임 스탬프를 만드는 및 직렬 포트 (회색)를 통해 무대 컨트롤러 (핑크) ' 어디 XY?' 문자열을 씁니다. (핑크) SerialStringRead 노드 X 및 Y 좌표 응답 무대 컨트롤러에서 읽습니다. 이 문자열은 다음 미크론으로 변환 하 고 구분으로 X 및 Y 좌표를 무대. 마지막으로,이 4 개의 스트림 zip 노드 (파란색)를 사용 하 여 결합 하 고 4 column.csv 파일은 작성: TTL 신호 수신 (범위 노드, 핑크)의 프레임 수, X 및 Y 좌표 및 후속 timepoints 사이의 간격 (일반적으로 ~ 50 ms 때 20 Hz에 기록)입니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> 그림 4 : HSN 형광 및 계란-누워 동작 동안 전체 동물 명시의 대표적인 현미경. (A-D) 그냥 계란 릴리스 이전 HSNs에서 GCaMP5 및 mCherry 형광의 동시 비율 이미지입니다. HSN 연 접 테르미니 화살촉으로 표시 됩니다. (C) GCaMP5의 병합 및 mCherry 형광 (D) GCaMP5:mCherry 강도 변조 비율; 높은 비율 (빨간색) 높은 세포내 캘리포니아2 + 는 연 접에 나타냅니다. (E) 전체 웜 계란 해 고 직후의 명시 이미지. 화살촉 있는 달걀 누워 외 음부의 앞쪽 및 후부 반쪽을 나타냅니다. 모든 이미지에 대 한 눈금 막대는 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> 그림 5 : 계란-누워 동작 동안 HSN 캘리포니아2 + 그리고 운동 속도의 기록. (A) 세포내 캘리포니아2 + 과도 (ΔR/R; 레드) 즉각적인 웜 속도 (µ m/s; 블루) 함께 대 한 응답에서 GCaMP5:mCherry 비율 변경의 자취. 계란-누워 이벤트 화살촉으로 표시 됩니다. HSN GCaMP5 형광 (그린, δ/F), mCherry 형광 (레드, δ/F), GCaMP5:mCherry 형광 비율 (블랙; ΔR/R), 그리고 벌레의 (B) 추적 속도 계란 릴리스 순간 주위 (파란색). (C) 전체 10 분 녹화 하는 동안 계란-누워 및 운동 동작의 공간 조직 벌레 추적 mCherry 형광 기록에서 얻은 HSN의 중심 위치에 추가 했다 XY 스테이지 정보에서 얻은 것입니다. HSN 과도 (빨간 원)의 타이밍, 계란-누워 이벤트 (검은 화살표), 시작 및 녹음 (녹색과 블루 다이아몬드)의 끝이 표시 됩니다. 눈금 막대는 1 m m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

이 절차의 전반적인 목표는 자웅동체 특정 뉴런 또는 HSN 활성이 Caenorhabditis elegans 행동에 미치는 영향에 대한 비율계량 칼슘 이미징을 수행하는 것입니다. 이 방법은 동물이 행동 상태를 번갈아 가며 신경 회로 활동이 동물 행동의 변화를 일으키는 방법에 대한 행동 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 높은 신호 대 잡음비로 세포 내 칼슘 활동의 변화를 기록하는 동시에 동물의 행동과 이동을 추적할 수 있습니다.이 방법은 예쁜꼬마선충의 신경 활동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 초파리 유충 및 얼룩말 물고기를 포함한 다른 투명 모델 시스템에도 적용할 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 Collin's Labs 학생인 Richard Kopcock, Pravat Dhakal 및 Layla Nassar입니다. 동물을 거치기 위하여는, 첫째로 백금 벌레 후비는 물건의 바닥에 씨를 뿌린 선충 성장 매체 한천 판에서 OP50 세균성 음식을 적용하고 씨를 뿌린 선충 성장 매체 판에 N-L 3 P 발기인에서 HSN에 있는 과민한 칼슘 리포터 GCaMP5 그리고 mCherry를 표현하는 동물을 위해 대략 20 늦은 L 4 L-X 2, 000를 옮기기 위하여 후비는 물건 사용하십시오.실체 현미경으로 발달 중인 외음부의 존재를 흰색 초승달로 둘러싸인 깨끗하고 어두운 점으로 확인하고 섭씨 20도에서 24-40시간 동안 벌레를 배양합니다. 배양이 끝나면 OP50을 새 픽에 적용하고 3마리의 벌레를 파종되지 않은 선충 성장 배지 플레이트로 옮기고 이미징 중에 벌레가 먹을 수 있도록 새 플레이트에 소량의 음식을 남깁니다. 다음으로, 평평하고 둥근 주걱을 사용하여 파종되지 않은 플레이트에서 20 x 20mm 덩어리를 자르고 깨끗한 24 x 60mm 번호 1.5 커버슬립의 한쪽 가장자리에 벌레 면이 아래로 향하게 하여 덩어리를 놓습니다.그런 다음 한천 덩어리를 커버 슬립 중앙으로 조심스럽게 밀어 넣고 한천 조각 위에 22 x 22mm 번호 1 커버 슬립을 올려 달라붙음과 증발을 줄입니다. 이미저를 설정하려면 웜을 무대에 놓습니다.tage 도립 현미경의 그리고 20x 주관식을 선택합니다. 양안 안렌즈를 사용하여 이미징을 위한 웜을 선택하고 적외선 필터를 밀어 콘덴서 위에 놓습니다.적절한 비디오 분석 프로그램을 열고 직렬 스테이지 XY 스테이지 최종 통신 스크립트를 실행합니다. CsvWriter를 클릭하고 기록된 X 및 Y 스테이지 정보를 저장할 폴더를 선택합니다. 그런 다음 녹색 화살표 머리를 클릭하여 디지털 수집 장치를 초기화합니다.적외선 카메라 녹화 소프트웨어의 설정에서 카메라 제어 대화 상자 토글을 선택합니다. 그런 다음 사용자 지정 비디오 모드 메뉴를 선택하고 모드 1 및 픽셀 형식 Raw 8을 선택합니다. Trigger Stroke에서 Trigger Input Line을 3으로, Polarity를 high로, Mode를 14로 설정합니다.Toggle Enable은 볼륨이 될 때까지 프레임 수집을 중지합니다.tage 트리거 신호가 형광 카메라에서 수신됩니다. 이미지 보기 창이 열린 상태에서 Record(기록)를 클릭하고 이미지 시퀀스를 저장할 폴더를 선택합니다. 버퍼링 녹화 모드를 선택하고 이미지를 JPEG 형식으로 저장합니다.그런 다음 Start Recording(기록 시작)을 클릭하여 획득을 초기화합니다. 그런 다음 Florescence Acquisition Software에서 Capture 탭을 열고 노출 시간을 10밀리초, Binning을 4X, Image Depth를 16비트로 설정합니다. 폭 512픽셀, 높이 256픽셀의 가운데 카메라 하위 배열을 선택합니다.이 프로그램은 자동으로 와이드 이미지를 반으로 나누어 별도의 형광 채널을 생성합니다. Show Output Trigger Options를 클릭하고 모든 트리거를 양수로 설정합니다. 트리거 1과 트리거 2가 노출로 설정되고 트리거 3이 25밀리초의 기간으로 프로그래밍 가능으로 설정되었는지 확인합니다.그런 다음 시퀀스 탭에서 타임 랩스를 선택하고 스캔 설정에서 필드 지연을 50밀리초로 설정하여 20헤르츠에서 이미지를 수집합니다. 임시 버퍼에 저장을 선택합니다. 비율계량 칼슘 이미징의 경우, Sequence 탭에서 Start를 클릭하여 기록을 시작하고 조이스틱으로 웜을 추적하여 관심 세포와 시냅스를 시야 중앙에 초점을 맞춥니다.형광 기록이 시작되는 순간 트리거가 대기 중인 명시야 카메라와 무대 컨트롤러로 전송되어 동기화된 이미지와 무대 위치를 수집하기 시작합니다. 히스토그램 창에서 통계 버튼을 클릭하여 각 채널에 대한 픽셀 통계를 표시합니다. LED 전원을 조정하여 빨간색 채널에서 8, 000 카운트 이상의 시냅스 전 말단에서 mCherry 형광의 최대 단일 픽셀을 보장하여 배경 위에 약 12비트 동적 범위를 제공합니다.쉬는 동안 또는 칼슘이 낮은 동안 시냅스전 말단의 Calcium Reporter 신호는 녹색 채널에서 약 2, 500 카운트여야 합니다. 하나의 알을 낳는 활성 상태에 도달할 때까지 동작을 기록합니다. 그런 다음 첫 번째 알 낳기 이벤트 전에 6, 000 프레임과 6, 001 프레임 후에 포함하는 10 분 하위 집합을 저장하십시오.웜 동작의 명시야 이미지와 X-Y 스테이지 위치의 시점을 동일하게 유지하거나 데이터 스트림의 정확한 동기화가 손실되도록 주의하십시오. 이미지 분할의 경우 이미지 시퀀스를 적절한 비율계량 양자화 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 시퀀스 탭에서 시계열을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 시계열을 초당 20프레임 및 픽셀당 1.25마이크로미터로 설정합니다. 도구 메뉴에서 비율을 선택한 다음 채널 A에 대해 mCherry를 선택하고 채널 B에 대해 GCaMP5를 선택하고 계산을 클릭하여 각 이미지 시퀀스에서 배경을 뺍니다.비율 채널에 무지개 조회 테이블 적용을 선택하고 mCherry 채널을 사용하여 강도 변조 비율 채널을 생성하고 비율 색상을 mCherry 채널의 밝기에 매핑합니다. 비율을 클릭하여 두 채널을 생성합니다. 객체 찾기 프로토콜을 생성하려면 측정 탭 아래의 강도를 사용하여 객체 찾기 도구를 프로토콜 창으로 드래그하고 톱니바퀴를 클릭하여 mCherry 강도 값 창을 설정하고 객체 찾기로 이동합니다.배경에서 2 표준 편차보다 크거나 같은 강도 값을 선택하고 세포체와 시냅스전 말단이 감지되도록 주의하십시오. 머리, 꼬리 또는 장 형광과 같은 원치 않는 개체를 제외하는 데 필요한 경우에만 mCherry 채널을 대상으로 하는 추가 필터를 추가합니다. 그런 다음 측정 메뉴를 열고 측정 항목 만들기를 선택하고 이미지 양자화 분석 프로토콜을 실행할 모든 시점을 선택합니다.GCaMP5 및 mCherry 형광 신호의 동시 획득은 동물의 움직임 및 초점의 변화를 보상하는 픽셀 대 픽셀 비율 채널을 생성하는 데 사용됩니다. 각 동물에 대해 시냅스전 세포 내 HSN 칼슘의 변화는 난자 방출 및 운동의 변화를 포함하여 명시야 영상에서 명백한 행동과 상관관계가 있을 수 있습니다. 실제로, 알을 낳는 활성 상태 전, 도중, 후에 웜 속도의 상당한 차이가 관찰될 수 있습니다.하나의 알을 낳는 행사를 확대하면 알을 낳는 사건 이전에 GCaMP5 형광의 강력한 변화를 알 수 있습니다. mCherry 개화는 상대적으로 변하지 않았습니다. 또한, GCaMP5:mCherry 비율의 측정된 변화는 난자 방출 약 4초 전에 HSN 칼슘 과도도를 명확하게 보여줍니다.그 과정에서 외음부 근육 수축은 알 방출로 끝나는 벌레 운동의 명확한 둔화를 분명하게 나타냅니다. 또한, 방금 시연한 바와 같이 벌레의 이미징 및 추적을 통해 먹이 찾기, 일시적인 HSM 칼슘 변화 및 알을 낳는 위치로 이동하기 전에 버스트 발사로 전환되는 HSN 활동으로 인한 알 낳기 행동의 공간적 조직을 시각화할 수 있습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행된다면 한두 시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 이미징 단계에서 관심 세포와 시냅스전 말단에 초점을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 광유전학적 활성화와 같은 다른 방법을 수행하여 HSN이 시냅스전 자극에 어떻게 반응하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 예쁜꼬마선충의 산란 회로 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 활성 Caenorhabditis elegans에서 HSN의 비율계량 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

ratiometric-calcium-imaging-individual-neurons-behaving

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

이 비디오는 유전적으로 암호화된 형광 리포터 단백질을 사용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 개별 뉴런에서 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. 이 연구는 기생충의 움직임을 이미징하고 뉴런에서 리포터 형광 비율을 측정하여 세포 내 칼슘 수치를 알을 낳는 동안 뉴런 활동 및 행동 변화와 상관시키는 단계를 간략하게 설명합니다.

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

우리는 대규모 다중 단일 단위 기록 및 실리콘 프로브와 설치류 동물 행동은 현지 필드 가능성에 대한 방법을 설명합니다. 드라이브 제조, 드라이브 및 프로브 주입 공정에 프로브 첨부 파일은 쉽게 복제에 대한 충분한 세부 사항에 그림하고 있습니다.

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을...

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

학습하세요 비율 칼슘 이미징을 이용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 HSN 뉴런 활성을 분석하는 방법을. 이 기술은 신경 회로와 행동 변화 간의 관계를 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

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