꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 자웅동체 특정 뉴런 또는 HSN 활성이 Caenorhabditis elegans 행동에 미치는 영향에 대한 비율계량 칼슘 이미징을 수행하는 것입니다. 이 방법은 동물이 행동 상태를 번갈아 가며 신경 회로 활동이 동물 행동의 변화를 일으키는 방법에 대한 행동 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 높은 신호 대 잡음비로 세포 내 칼슘 활동의 변화를 기록하는 동시에 동물의 행동과 이동을 추적할 수 있습니다.

이 방법은 예쁜꼬마선충의 신경 활동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 초파리 유충 및 얼룩말 물고기를 포함한 다른 투명 모델 시스템에도 적용할 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 Collin's Labs 학생인 Richard Kopcock, Pravat Dhakal 및 Layla Nassar입니다. 동물을 거치기 위하여는, 첫째로 백금 벌레 후비는 물건의 바닥에 씨를 뿌린 선충 성장 매체 한천 판에서 OP50 세균성 음식을 적용하고 씨를 뿌린 선충 성장 매체 판에 N-L 3 P 발기인에서 HSN에 있는 과민한 칼슘 리포터 GCaMP5 그리고 mCherry를 표현하는 동물을 위해 대략 20 늦은 L 4 L-X 2, 000를 옮기기 위하여 후비는 물건 사용하십시오.

실체 현미경으로 발달 중인 외음부의 존재를 흰색 초승달로 둘러싸인 깨끗하고 어두운 점으로 확인하고 섭씨 20도에서 24-40시간 동안 벌레를 배양합니다. 배양이 끝나면 OP50을 새 픽에 적용하고 3마리의 벌레를 파종되지 않은 선충 성장 배지 플레이트로 옮기고 이미징 중에 벌레가 먹을 수 있도록 새 플레이트에 소량의 음식을 남깁니다. 다음으로, 평평하고 둥근 주걱을 사용하여 파종되지 않은 플레이트에서 20 x 20mm 덩어리를 자르고 깨끗한 24 x 60mm 번호 1.5 커버슬립의 한쪽 가장자리에 벌레 면이 아래로 향하게 하여 덩어리를 놓습니다.

그런 다음 한천 덩어리를 커버 슬립 중앙으로 조심스럽게 밀어 넣고 한천 조각 위에 22 x 22mm 번호 1 커버 슬립을 올려 달라붙음과 증발을 줄입니다. 이미저를 설정하려면 웜을 무대에 놓습니다.tage 도립 현미경의 그리고 20x 주관식을 선택합니다. 양안 안렌즈를 사용하여 이미징을 위한 웜을 선택하고 적외선 필터를 밀어 콘덴서 위에 놓습니다.

적절한 비디오 분석 프로그램을 열고 직렬 스테이지 XY 스테이지 최종 통신 스크립트를 실행합니다. CsvWriter를 클릭하고 기록된 X 및 Y 스테이지 정보를 저장할 폴더를 선택합니다. 그런 다음 녹색 화살표 머리를 클릭하여 디지털 수집 장치를 초기화합니다.

적외선 카메라 녹화 소프트웨어의 설정에서 카메라 제어 대화 상자 토글을 선택합니다. 그런 다음 사용자 지정 비디오 모드 메뉴를 선택하고 모드 1 및 픽셀 형식 Raw 8을 선택합니다. Trigger Stroke에서 Trigger Input Line을 3으로, Polarity를 high로, Mode를 14로 설정합니다.

Toggle Enable은 볼륨이 될 때까지 프레임 수집을 중지합니다.tage 트리거 신호가 형광 카메라에서 수신됩니다. 이미지 보기 창이 열린 상태에서 Record(기록)를 클릭하고 이미지 시퀀스를 저장할 폴더를 선택합니다. 버퍼링 녹화 모드를 선택하고 이미지를 JPEG 형식으로 저장합니다.

그런 다음 Start Recording(기록 시작)을 클릭하여 획득을 초기화합니다. 그런 다음 Florescence Acquisition Software에서 Capture 탭을 열고 노출 시간을 10밀리초, Binning을 4X, Image Depth를 16비트로 설정합니다. 폭 512픽셀, 높이 256픽셀의 가운데 카메라 하위 배열을 선택합니다.

이 프로그램은 자동으로 와이드 이미지를 반으로 나누어 별도의 형광 채널을 생성합니다. Show Output Trigger Options를 클릭하고 모든 트리거를 양수로 설정합니다. 트리거 1과 트리거 2가 노출로 설정되고 트리거 3이 25밀리초의 기간으로 프로그래밍 가능으로 설정되었는지 확인합니다.

그런 다음 시퀀스 탭에서 타임 랩스를 선택하고 스캔 설정에서 필드 지연을 50밀리초로 설정하여 20헤르츠에서 이미지를 수집합니다. 임시 버퍼에 저장을 선택합니다. 비율계량 칼슘 이미징의 경우, Sequence 탭에서 Start를 클릭하여 기록을 시작하고 조이스틱으로 웜을 추적하여 관심 세포와 시냅스를 시야 중앙에 초점을 맞춥니다.

형광 기록이 시작되는 순간 트리거가 대기 중인 명시야 카메라와 무대 컨트롤러로 전송되어 동기화된 이미지와 무대 위치를 수집하기 시작합니다. 히스토그램 창에서 통계 버튼을 클릭하여 각 채널에 대한 픽셀 통계를 표시합니다. LED 전원을 조정하여 빨간색 채널에서 8, 000 카운트 이상의 시냅스 전 말단에서 mCherry 형광의 최대 단일 픽셀을 보장하여 배경 위에 약 12비트 동적 범위를 제공합니다.

쉬는 동안 또는 칼슘이 낮은 동안 시냅스전 말단의 Calcium Reporter 신호는 녹색 채널에서 약 2, 500 카운트여야 합니다. 하나의 알을 낳는 활성 상태에 도달할 때까지 동작을 기록합니다. 그런 다음 첫 번째 알 낳기 이벤트 전에 6, 000 프레임과 6, 001 프레임 후에 포함하는 10 분 하위 집합을 저장하십시오.

웜 동작의 명시야 이미지와 X-Y 스테이지 위치의 시점을 동일하게 유지하거나 데이터 스트림의 정확한 동기화가 손실되도록 주의하십시오. 이미지 분할의 경우 이미지 시퀀스를 적절한 비율계량 양자화 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 시퀀스 탭에서 시계열을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 시계열을 초당 20프레임 및 픽셀당 1.25마이크로미터로 설정합니다. 도구 메뉴에서 비율을 선택한 다음 채널 A에 대해 mCherry를 선택하고 채널 B에 대해 GCaMP5를 선택하고 계산을 클릭하여 각 이미지 시퀀스에서 배경을 뺍니다.

비율 채널에 무지개 조회 테이블 적용을 선택하고 mCherry 채널을 사용하여 강도 변조 비율 채널을 생성하고 비율 색상을 mCherry 채널의 밝기에 매핑합니다. 비율을 클릭하여 두 채널을 생성합니다. 객체 찾기 프로토콜을 생성하려면 측정 탭 아래의 강도를 사용하여 객체 찾기 도구를 프로토콜 창으로 드래그하고 톱니바퀴를 클릭하여 mCherry 강도 값 창을 설정하고 객체 찾기로 이동합니다.

배경에서 2 표준 편차보다 크거나 같은 강도 값을 선택하고 세포체와 시냅스전 말단이 감지되도록 주의하십시오. 머리, 꼬리 또는 장 형광과 같은 원치 않는 개체를 제외하는 데 필요한 경우에만 mCherry 채널을 대상으로 하는 추가 필터를 추가합니다. 그런 다음 측정 메뉴를 열고 측정 항목 만들기를 선택하고 이미지 양자화 분석 프로토콜을 실행할 모든 시점을 선택합니다.

GCaMP5 및 mCherry 형광 신호의 동시 획득은 동물의 움직임 및 초점의 변화를 보상하는 픽셀 대 픽셀 비율 채널을 생성하는 데 사용됩니다. 각 동물에 대해 시냅스전 세포 내 HSN 칼슘의 변화는 난자 방출 및 운동의 변화를 포함하여 명시야 영상에서 명백한 행동과 상관관계가 있을 수 있습니다. 실제로, 알을 낳는 활성 상태 전, 도중, 후에 웜 속도의 상당한 차이가 관찰될 수 있습니다.

하나의 알을 낳는 행사를 확대하면 알을 낳는 사건 이전에 GCaMP5 형광의 강력한 변화를 알 수 있습니다. mCherry 개화는 상대적으로 변하지 않았습니다. 또한, GCaMP5:mCherry 비율의 측정된 변화는 난자 방출 약 4초 전에 HSN 칼슘 과도도를 명확하게 보여줍니다.

그 과정에서 외음부 근육 수축은 알 방출로 끝나는 벌레 운동의 명확한 둔화를 분명하게 나타냅니다. 또한, 방금 시연한 바와 같이 벌레의 이미징 및 추적을 통해 먹이 찾기, 일시적인 HSM 칼슘 변화 및 알을 낳는 위치로 이동하기 전에 버스트 발사로 전환되는 HSN 활동으로 인한 알 낳기 행동의 공간적 조직을 시각화할 수 있습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행된다면 한두 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 이미징 단계에서 관심 세포와 시냅스전 말단에 초점을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 광유전학적 활성화와 같은 다른 방법을 수행하여 HSN이 시냅스전 자극에 어떻게 반응하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 예쁜꼬마선충의 산란 회로 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 활성 Caenorhabditis elegans에서 HSN의 비율계량 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.