RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

이 프로토콜의 전반적인 목표는 종양 용해성 바이러스 요법을 향상시키기 위해 조작할 수 있는 숙주 표적을 식별하는 것입니다. 이 방법은 종양 용해성 바이러스 치료 분야의 주요 질문, 예를 들어 어떤 특정 숙주 인자 및 세포 경로가 종양 용해성 바이러스 복제를 조절하는지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 포괄적이고 편향되지 않은 방식으로 종양 용해성 바이러스 요법을 향상시키기 위해 조작할 수 있는 숙주 표적을 식별할

이 프로토콜은 일반적으로 바이러스 복제를 조절하는 숙주 요인을 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 고처리량 스크리닝 분석을 개발한 후 냉동고에서 마이크로타이터 플레이트 배치를 제거하고 20-30분 동안 해동합니다. 그 동안 두 병에 70% 에탄올을 채운 다음 50mL 원뿔형 튜브 2개에 PBS를, 1병에 증류수를 채웁니다.

액체 디스펜서 튜브를 70% 에탄올 병에 담근 다음 튜브 주위에 마스킹 테이프를 붙여 튜브가 멸균된 것으로 간주될 수 있는 지점을 표시합니다. 약 25mL의 70% 에탄올을 사용하여 튜브를 프라이밍합니다. 손실된 부피를 대체하기 위해 병에 추가 에탄올을 붓고 튜브를 최소 5분 동안 에탄올에 그대로 두십시오.

세포 배양 후드를 준비한 후 밀봉된 플레이트를 원심분리하고 실온에서 2분 동안 1026배 G로 설정합니다. 그런 다음 플레이트에서 씰을 제거합니다. 그런 다음 필요한 양의 transfection 시약을 pre-warmed transfection 시약 희석제가 들어 있는 원뿔형 튜브에 피펫으로 넣습니다.

각 플레이트에서 배지를 흡인하여 세포를 트립신화하기 시작합니다. PBS 9mL를 사용하여 세포를 헹구고 플레이트당 트립신 3mL를 피펫팅합니다. 세포를 섭씨 37도에서 약 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 22mL의 배지를 사용하여 세포를 위아래로 10회 재현탁합니다. 각 조직 배양 플레이트의 세포 현탁액을 멸균 병에 결합하고 병을 반전시켜 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 세포 현탁액의 1mL 분취물을 두 개의 별도 마이크로분리 튜브로 피펫팅합니다.

각 마이크로분리관에서 샘플을 제거하고 세포를 계수합니다. 그런 다음 필요한 밀도에 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하고 한 배치의 플레이트에 걸쳐 분배할 수 있을 만큼 충분히 희석된 세포 현탁액을 준비합니다. 세포가 준비되는 동안 에탄올의 액체 디스펜서 튜브를 비우십시오.

약 25mL의 PBS를 사용하여 튜브를 프라이밍한 다음 튜브를 비웁니다. transfection 시약에 담그고 나중에 세포 현탁액에 담글 튜브 부분이 멸균 상태로 유지되도록 합니다. 하나의 원뿔형 tube of transfection 시약 용액으로 안전하게 수행할 수 있는 플레이트를 분리하십시오.

transfection 시약 용액을 위아래로 10회 피펫팅합니다. 그런 다음 웰당 5마이크로리터를 분배하기 전에 용액을 사용하여 튜브를 프라이밍합니다. 1026회 G로 실온에서 1분 동안 플레이트를 원심분리합니다.

그런 다음 사용 중인 transfection 시약에 대해 규정된 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 배양하는 동안 transfection 시약 용액의 튜브를 비우고 PBS가 들어 있는 전체 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 약 25mL의 PBS를 사용하여 프라이밍한 다음 비워 튜브를 헹굽니다.

셀 현탁액이 들어 있는 병을 혼합한 다음 튜브를 현탁액에 놓고 각 팁이 제대로 분배되는지 확인할 수 있도록 튜브를 충분히 프라이밍합니다. 모든 플레이트에 걸쳐 cell suspension의 웰당 30마이크로리터를 분주합니다. 튜브에서 세포 현탁액을 비운 다음 약 25mL의 PBS로 튜브를 헹구고 약 50mL의 증류수를 헹굽니다.

세포 파종 시점부터 45-60분 동안 플레이트를 실온에 두십시오. 그런 다음 방해받지 않는 인큐베이터에서 원하는 길이의 유전자 침묵 동안 플레이트를 배양합니다. 시간을 절약하기 위해 세포를 감염시키기 전날 감염되지 않은 웰용 배지를 포함하여 각 플레이트 배치를 감염시키는 데 필요한 정확한 양의 배지를 멸균 병에 피펫으로 주입합니다.

매체를 섭씨 37도에서 데운 다음 2 병에 70 % 에탄올, 2 개의 50mL 원뿔형 튜브에 PBS, 1 병에 증류수를 채 웁니다. 앞에서 설명한 대로 70% 에탄올로 튜브를 살균합니다. 튜브가 에탄올에 있는 동안 먼저 바이러스를 소용돌이치게 한 다음 필요한 정확한 양의 바이러스를 감염 배지 병에 피펫으로 넣습니다.

그런 다음 25mL의 PBS를 사용하여 튜브를 헹구어 프라이밍한 다음 비웁니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 조직 배양 후드에 넣습니다. 매체를 사용하여 튜브를 프라이밍한 다음 40마이크로리터의 배지를 감염되지 않은 컨트롤 웰에 분배합니다.

매체 튜브를 비우고 PBS 25mL를 사용하여 헹굽니다. 바이러스를 혼합한 후 바이러스가 들어 있는 병에 튜브를 넣고 플레이트에 40마이크로리터의 바이러스를 분배합니다. 플레이트를 400배 G의 실온에서 30분 동안 원심분리합니다.

미리 결정된 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 고정하기 전날, 각 플레이트 배치에 대해 4%의 포름알데히드와 PBS가 포함된 고정 및 스탠딩 용액 한 병을 준비하되 Hoechst 얼룩은 생략합니다. 용액을 빛을 피하는 가연성 캐비닛에 보관하십시오.

다음 날, 70% 에탄올과 PBS를 사용하여 앞에서 설명한 대로 튜브를 헹굽니다. 모든 플레이트에 30마이크로리터의 용액을 분배한 다음 플레이트를 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 배양 후 씰을 플레이트에 적용하고 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 이미징 및 분석을 수행합니다. 여기에 표시된 것은 transfection 시약 희석제만으로 72시간 배양 후 Hoechst 33342로 염색된 786개의 O-세포입니다. 트랜스펙션(Transfection) 시약 및 희석제, 비표적 siRNA, PLK1을 표적으로 하는 siRNA가 포함되어 있습니다.

여기에서 볼 수 있는 생존 그래프는 PLK1 siRNA로 transfection된 세포의 22%가 생존했고, non-targeting siRNA로 transfection된 세포의 94%가 생존했음을 나타냅니다. 이 그래프는 다양한 MOI에서 향상된 GFP를 발현하는 종양 용해성 백시니아 바이러스에 감염된 786개의 O-세포의 실시간 경과 결과를 보여줍니다. 라이브 시간 경과에 걸쳐 0.05의 MOI에서 감염된 세포의 대표적인 이미지가 여기에 나와 있습니다.

21시간의 잠복기는 시점이 선형 범위 내에 있을 때 확산의 증가 및 감소를 감지할 수 있습니다. 3개의 종양 세포주에 걸친 게놈 전체 RNAi 스크리닝에 이어, MAD 방법을 사용하여 3개의 암 세포주 중 최소 2개에 공통적인 1008개의 히트가 확인되었습니다. UPR 및 ERAD 경로 내에서 10개의 히트가 서로 다른 표적 염기서열을 가진 siRNA를 통한 2차 검증을 위해 선택되었습니다.

시약을 분주할 때는 올바른 플레이트 배치가 있는지, 분주를 위한 올바른 부피를 선택했는지, 튜브가 올바른 시약으로 채워졌는지, 항상 시약에 완전히 잠겨 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 종양 용해성 바이러스 요법을 강화하기 위해 조작할 수 있는 숙주 표적을 식별하거나 일반적으로 바이러스 복제를 조절하는 숙주 인자를 식별하기 위해 고처리량 RNAi 스크리닝을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.