Name: 트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 학습하세요 초파리 Notch 수용체와 트랜스-리간드의 결합 및 시스-리간드에 의한 억제를 평가하는 세포 응집 분석법을 통해 신호전달 메커니즘을 규명하는 방법을 배우세요.

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저자 인정 NIH/NIGMS에서 지원 (HJN에 R01GM084135) 및 Glycoscience (부여 #110071 HJN), 그리고 톰 V. 리 토론 및 분석 실험에 대 한 제안에 대 한 감사에 대 한 미즈타 니 재단과 Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, 로버트 플레밍, 켄 어바인과 플라스 미드를 세포 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)

1. 가짜 최저 두 배 좌초 RNA (dsRNA)의 준비
<ol>
	<li>제품의 PCR 증폭
	<ol>
		<li>야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분). 
		녹색 형광 단백질 강화 (EGFP) dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 반전 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		Shams dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT 반전 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA 참고: EGFP dsRNA 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>젤-제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 젤 정화 키트를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품을 정화.</li>
	<li>전사 체 외에 상업 제품 제조 업체의 프로토콜에 따라 T7 발기인에서 속기의 능력을 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 dsRNA를 정화 하 고-80 ° c.에 저장</li>
	<li>다음 단계 (1.5.1-1.5.5)를 사용 하 여 가짜 최저의 효율성을 평가 합니다.
	<ol>
		<li>태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린-스 셀 사용 하 여 수동으로 hemocytometer 및 플레이트 5 x 105 s 2 셀에는 6의 각 잘 잘 플레이트 1 mL/슈나이더의 매체의 10% 보충 수.</li>
		<li>각 잘 하 EGFP-또는 shams dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>수확 컨트롤 (EGFP dsRNA 치료) 및 25 ° C에서 5 분 동안 1000 x g와 RNA 분리에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 프로세스에서 원심 분리에 의해 아래로 산 뒤 부드러운 pipetting으로 shams dsRNA 취급 S2 셀 제조 업체의 프로토콜입니다.</li>
		<li>분 광 광도 계 및 프로세스 100 사용 하 여 RNA를 정량 1 단계 qRT-PCR 상업 정량 시 약 및 뇌관/프로브와 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여에 대 한 RNA의 ng: 변성 (95 ° C, 15 s) 및 소 둔/확장 (60 ° C, 1 분). 참고: 뇌관/프로브 세트와 이러한 연구에서 shams 및 제어 qRT-PCR 실험을 위해 사용 하는 악기에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
		<li>2-ΔΔCT 방법16를 사용 하 여 상대 shams mRNA 레벨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 평가의 노치 수용 체와 트랜스사이의 바인딩-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀 (S2 노치 수용 체를 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀 및 플레이트 5 x 105 S2 및 안정적인 S2-노치 셀에 1 ml에서 6 잘 플레이트/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: S2 노치 셀, 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)에서 사용할 수 있는 미디어에 200 nM 토트를 추가 합니다. 0.5 m m 토트 재고 솔루션을 준비 하려면 먼저 1 M NaOH의 250 µ L에 20 mM 토트 솔루션 준비. 다음, 0.5 m m 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수에-20 ° c.에가을이 솔루션을 희석 S2-노치 셀에 노치 단백질의 표정은 pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인의 제어.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다. 참고: CuSO4 metallothionein 발기인에 의해 제어 하는 단백질의 표정을 유도 하는 데 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호를 보내는 셀 (S2 셀 델타 또는 Serrate ligands 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>사용 하 여 수동으로 hemocytometer를 접시 ~ 5 x 106 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 1 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 셀/슈나이더의 매체의 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: 미디어에 S2-델타 셀 200 nM 토트와 100 µ g/mL hygromycin S2 Serrate톰 셀을 추가 합니다. 델타와 Serrate톰의 표정-Serrate12의 토마토 태그, 기능 버전- pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인을 받고 있다.</li>
		<li>0.7 m m ligands의 표현을 유도 하는 3 h 25 ° C에서 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
	<ol>
		<li>DsRNA 취급 S2 수확 (제어)과 부드러운 pipetting 접시 2.5 x 105 셀/잘 hemocytometer에 의해 수동 계산 후 24-잘 접시에에서 의해 S2-노치 셀.</li>
		<li>5 x 105 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 슈나이더의 매체의 200 µ L의 전체 볼륨에 추가 (보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스). 참고: 모든 S2 셀 (를 포함 하 여 도금, 유도 및 dsRNA 처리) 처리는 biosafety 캐비닛 아래 이루어졌다.</li>
		<li>150 rpm (942.48 rad/min)에서 궤도 통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>1 분 후 각의 내용을 혼합 하 고 꺼내 20 µ L의 수를 계산 합니다.<ol>
			<li>10 배 확대 (PLL 10/0.25 목표)를 사용 하 여 거꾸로 화합물 현미경 대표 이미지 걸릴 동시에.</li>
			<li>수동으로 집계를 계산 (&#62; 6 셀)는 hemocytometer를 사용 하 여.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>이미지 수집 및 5 분 후, 15 분 집계의 계산을 반복 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>트랜스의 정량화를 수행-바인딩.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>S2-노치와 S2-델타 또는 S2 Serrate톰 셀 사이의 mL 당 집계 수를 계산 ( 트랜스의 크기-바인딩).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다.노치와 트랜스간의 바인딩의 저해의 평가- Cis에 의해 ligands-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>플레이트 5 x 105 s 2 셀의 1 mL에는 6-잘 접시/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>공동 transfect dsRNA 치료 셀 pBluescript 및 pMT 노치11 (DGRC) 혼자 또는 pMT 노치 및 pMT 델타11 (DGRC) 또는 pMT Serrate총17 DNA는 2 µ g/잘 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 transfection 시 약의 농도. 참고: pBluescript 컨트롤로 사용 됩니다. 공동 transfected 세포 S2-노치 이라고 불릴 것 이다 &#38; 델타과도 또는 S2-노치 &#38; Serrate과도 셀이.</li>
		<li>뚜렷이 페 S2 셀 24 h에 대 한 25 ° c를 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치와는 ligands의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2.2에 설명 된 대로 신호를 보내는 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>2.3 섹션에 설명 된 대로 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.</li>
	<li>트랜스의 저해를 계량- cis에 의해 바인딩-ligands.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>Cis에 의해 억제의 크기를 정량화-다음과 같이 ligands.<ol>
			<li>S2-노치과도 S2-델타 세포 사이의 집계의 수로 A 를 정의 합니다.</li>
			<li>S2 셀 사이의 집계 수 노치와 델타 정도 공동 페 B 정의 (S2-노치 &#38; 델타과도)와 S2-델타 세포.</li>
			<li>상대 집계 C 계산 = (B x 100) /A</li>
			<li>Cis-ligand (델타 또는 Serrate) 100-의해 억제의 크기를 계산 C. 참고: 한 예로, 상대 집계가 45%, cis-ligands 횡단을 억제 하는 것으로 간주 됩니다-55% 바인딩.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

정식 노치 신호 노치 수용 체와 ligands5간의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 노치 통로에 대부분의 연구는 주로 노치와 인접 셀 (트랜스)에 ligands의 바인딩은 고려, 하지만 노치와 같은 셀 ligands 할 상호 작용, 그리고 이러한 소위 cis-상호 작용 단계에서 억제 역할을 재생할 수 있습니다 신호3,4. 따라서, 정식 노치 신호에 한정자의 영향을 기본 메커니즘을 해독, 그것은 종종 두 종류 (트랜스 와 cis) 노치 ligand 상호 작용의 검사 관련. 그러나, 동물 개발 하는 동안 많은 컨텍스트에서 이러한 상호 작용 및 그들의 피드-다시 규제의 둘 다의 참여는 vivo에서 연구1,6</sup...

정식 노치 신호 노치 수용 체와 그들의 ligands1간의 상호 작용을 촉진 하기 위하여 세포를 이웃의 육체적 인 접촉을 필요로 하는 단거리에 셀 통신 메커니즘입니다. Ligands와 노치 수용 체 (신호 수신 세포의 표면에 존재 하는)의 상호 작용 (신호 전송의 표면에 세포) 노치 신호를 시작 하 고 트랜스로 알려져 있다-활성화2. 다른 한편으로, 노치와 동일한 셀에 있는 그것의 ligands 사이 상호 작용 노치 통로의 억제를 지도 하 고 cis로 알려져 있다-금지3. 트랜스-와 cis사이의 균형-상호 작용 최적의 ligand 의존 노치4신호를 확인 하는 데 필요한. 초파리 는 포유류, 4 개의 노치 수용 체 있고 5 개의 ligands에 반대 한 노치 수용 체 및 두 ligands (델타와 Serrate) [가변 1 (JAG1), JAG2, 델타 같은 1 (DLL1), DLL3 및 DLL4]5. 이 단순 데, 초파리 모델 부드럽게 해 부 연구 노치 ligand 상호 작용 및 이후에 노치 신호 통로 한정자의 효과를 제공 합니다. ( 초파리날개 개발 포함), 동물 개발 하는 동안 특정 상황에서 cis-및 트랜스-상호 적절 한 노치 신호를 달성 하기 위해 운명1,6 셀 관련 . 시스- 트랜스대에 이러한 상황에서 노치 통로 한정자의 효과 구별 하는 것이 중요 하다-그것의 ligands와 노치의 상호 작용.
우리의 그룹은 이전 부정적인 초파리 노치를 xylose 라는 탄수화물 잔류물의 날개 개발7을 포함 한 특정 컨텍스트에서 노치 신호 조절 보고. Shams 의 손실 (효소는 xylosylates 노치) "날개 정 맥의 손실" 형7리드. 최근에, 유전자 복용량 실험 및 클론 분석 shams 의 손실 델타 중재 노치 내 서 향상을 보여 사용 되었다. Shams 돌연변이에 향상 된 노치 신호는 감소 cis의 결과 여부를 구별 하는 것-금지 또는 증가 트랜스-활성화, 애벌레 윙 imaginal 디스크에 노치 ligands의 소성 overexpression 학문 민 진 당-GAL4 드라이버를 사용 하 여 수행 했다. Shams 트랜스규제를 제안 하는 증거를 제공 하는이 실험-노치 cis를 영향을 주지 않고 델타에 의해 노치의 활성화-ligands8에 의해 저해. 그러나, 피드-다시 규정 그리고 내 인 성 ligands의 효과 소성 overexpression 학문1,,69의 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다.
10 사용 되었다 초파리 S2 세포가이 문제를 해결 하려면는 노치 ligand 상호 작용 연구11,12간단한 체 외에 시스템을 제공 합니다. S2 셀 하지 생 노치 수용 체 델타 리간드11 을 표현 하 고 표현 Serrate13, 노치 ligand 집계 실험8에 영향을 주지 않는 낮은 수준. 따라서, S2 셀 수 수 안정적으로 또는 정도 페 노치 또는 개별 ligands 델타 (Serrate) 독점적으로 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 하나를 표현 하는 세포를 생성 하 또는 그들의 조합에 의해. Heterotypic 수용 체 ligand 바인딩11,,1214중재의 형성에 S2 셀 결과 ligand 표현 S2 노치 표현 세포의 혼합. 트랜스의 측정을 제공 하는 집계 형성의 정량화-노치와 그것의 ligands15 (그림 1) 사이의 바인딩. 마찬가지로, S2 셀 노치와 델타 또는 Serrate ligands와 공동 transfected 수 (즉, cis-ligands). Cis-S2 노치 표현 세포에 ligands 파기 트랜스와 노치의 바인딩-ligands 및 결과에 집계 형성8,,1214감소. Cis에 의해 발생 하는 집계 형성의 상대적 감소- cis의 억제 효과의 측정을 제공 하는 ligands-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-ligands (그림 2). 따라서, 셀 집계 분석 트랜스-와 cis에 xylosylation의 손실의 영향을 검토 하 활용 했다-노치와 그것의 ligands 사이 상호 작용.
여기, 선물이 상세한 프로토콜 트랜스와 노치의 바인딩을 평가를 겨냥 한 셀 집계 분석 실험-ligands 및 cis에 의해 그것의 억제-ligands 초파리 S2 세포를 사용 하 여. 예를 들어, 제공 하는 데이터 바인딩 노치와 트랜스사이 노치 xylosylation의 효과 결정 하는-델타8. 이러한 간단 분석 노치 ligand 상호 작용에서 생체 외에서 의 반 정량적 평가 제공 하 고 기본 노치 통로 한정자의 비보에 효과 분자 메커니즘을 결정 하는 데 도움이.

<table><tbody><tr><td>바이오휘태커 슈나이더 s 초파리 매체, 수정된</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 페니실린-스트렙토마이신 100X 솔루션</td><td>GE 헬스케어 생명과학&nbsp;</td><td></td><td></td>SV30010</tr><tr><td>CELLSTAR 6 웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 24 웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR 미니 쉐이커</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD 트랜스펙션 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscrip T7 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (RNA 정제 키트)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision 도립 현미경</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 현미경 디지털 카메라 + 고급 소프트웨어</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>ToupView 소프트웨어를 사용한 이미지 획득</td></tr><tr><td>PureLink 퀵 젤 추출 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>Methotrexate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>Copper sulphate</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>S2 세포</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-SerrateTom cells</td><td></td><td></td><td>R. Fleming의 선물 (Fleming et al, Development, 2013)</td></tr><tr><td>S2-Delta cells</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>S2-Notch cells</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>pMT-Delta vector</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>S. Artavanis-Tsakonas의 선물</td></tr><tr><td>pMT-톱니 벡터</td><td></td><td></td><td>Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch vector</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>S. Artavanis-Tsakonas의 선물</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Hugo Bellen의 선물</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit</td><td>Applied Biosystem</td><td>1611091</td><td></td></tr><tr><td>Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02144576_g1&nbsp;</td><td>FAM-MGB 염료 함유</td></tr><tr><td>FAM-MGB 염료를 사용한</td> <td>CG7939 (RpL32)</td> <td>Applied Biosystem</td><td>Dm02151827_g1</td>용 TaqMan 유전자 발현 분석</tr><tr><td>Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR 시스템</td><td>Applied Biosystem</td><td>4351405</td><td>96-well Block 모듈</td></tr></tbody></table>

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-ligands 및 cis에 의해 그것의 억제-ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

노치 신호 동물 개발 및 성인 유지 관리에 광범위 하 게 사용 되는 진화론 보존된 셀 통신 시스템입니다. 신호 통로의 활성화를 유도 하는 이웃 세포에서 ligands와 노치 수용 체의 상호 작용 (트랜스-활성화) 신호를 억제 하는 ligands는 동일한 세포에서와 상호 작용 하는 동안, (cis-억제). 트랜스사이의 적절 한 균형-활성화 및 cis-억제 노치 동물 개발 하는 동안 일부 컨텍스트에서 신호의 최적 수준을 확립 도움이 됩니다. 노치와 많은 세포 유형에의 ligands의 겹치는 식 도메인 및 피드백 메커니즘의 존재, 트랜스- cis대에 주어진된 포스트 번역 상 수정의 효과 공부-노치의 상호 작용 및 그것의 ligands에서 비보에 어렵습니다. 여기, 우리 노치의 트랜스 와 cis각 ligand 바인딩에 노치 통로 한정자 노크의 효과 평가 하기 위해 셀 집계 분석 실험에서 초파리 S2 세포를 사용 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. S2 셀 안정적으로 또는 정도 페 노치 표현 벡터와 각 노치 ligand (S2-델타 또는 S2 Serrate)를 표현 하는 세포와 혼합 됩니다. 트랜스-수용 체와 ligands 간의 바인딩을 heterotypic 셀의 형성 귀착되 고 mL의 구성 당 집계 수 측정 된다 &#62; 6 셀. Cis의 억제 효과 검토-ligands, S2 셀 공동 노치와 각 ligand를 표현 S2 델타 또는 S2 Serrate 세포 혼합 및 위에서 설명한 대로 집계의 수 정량은. Cis의 존재로 인해 집계 수의 상대적 감소- cis의 측정을 제공 하는 ligands-ligand- 트랜스의 저해를 중재-바인딩. 이러한 간단 분석 실험 유전 또는 약리학 바인딩에 노치의에 조작의 ligands의 효과에 반 양적 데이터를 제공할 수 있습니다 그리고 vivo에서 효과의 기본 분자 메커니즘을 파악 하는 것을 도울 수 있다 노치 신호에 같은 조작.

우리의 vivo에서 관측 제안는 노치 신호 때문에 이득에 xylosyltransferase 유전자 shams 결과의 손실 증가 델타 중재 트랜스- cis를 영향을 주지 않고 노치의 활성화-의 저해 노치 ligands8. 이 테스트 하려면 셀 집계 분석 생체 외에서 수행 했다. 첫째, shams 식 S2 셀에는 뜨 shams dsRNA를 사용 하 여. EGFP dsRNA 제어로 사용 되었다. 최저 (KD)의 실시간 PCR에 의해 시험 되었다 그리고 808보다 큰 수를 표시 했다. 그런 다음 트랜스와 노치 수용 체의 바인딩을-shams KD 집계 분석 실험을 사용 하 여 조사 되었다 시 델타. S2-노치와 S2-델타 세포 사이 집계는 그들을 혼합 ...

Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

이 응집 분석의 전반적인 목표는 Notch 수용체와 트랜스 리간드의 결합과 시스 리간드에 의한 억제를 평가하는 것입니다. 이 방법은 유전적 또는 약리학적 요인이 Notch 수용체와 리간드의 결합에 어떤 영향을 미치고 신호 전달을 변경하는지에 대한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Notch 수용체와 리간드의 트랜스 및 시스 결합을 평가할 수 있다는 것입니다.흥미롭게도, 내인성 리간드의 중첩 효과를 포함하지 않습니다. 신호 수신 셀을 스핀다운하고 Schneider's Medium에서 재현탁하여 평가를 시작합니다. 혈구계를 사용하여 수동으로 세포를 계수합니다.5 배 10에서 5 번째 S2 및 6 웰 플레이트의 각 웰에서 안정적인 S2-Notch 셀을 Schneider의 배지 웰 당 1 밀리리터로 플레이트합니다. 다음으로, 각 웰에 7.5마이크로그램의 이중 가닥 RNA를 추가하고 세포를 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다. 0.7 밀리몰의 황산구리를 첨가하여 Notch의 발현을 유도하고 세포를 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다.배양 후, 혈구계를 사용하여 신호 전달 세포를 수동으로 계수합니다. 및 6-웰 플레이트의 각 웰에서 6번째 안정한 세포를 10배 5회 플레이트하고, 보충된 슈나이더 배지의 웰당 1밀리리터를 주입한다. 그런 다음 0.7 밀리몰의 황산구리를 첨가하여 리간드의 발현을 유도하고 세포를 섭씨 25도에서 3시간 동안 배양합니다.부드러운 피펫팅으로 이중 가닥 RNA 처리된 S2-control 및 S2-Notch 세포를 수확합니다. 그리고 2.5 곱하기 10을 24-웰 플레이트에서 웰당 다섯 번째 셀에 플레이트합니다. 5번째 안정 S2-Delta 또는 S2-Serrate 토마토 세포에 10의 5배를 총 200마이크로리터의 보충된 Schneider's Medium에 추가합니다.플레이트를 150rpm의 궤도 셰이커에 놓습니다. 1분 후 각 웰의 내용물을 혼합하고 20마이크로리터를 꺼내 응집체의 수를 계산합니다. 동시에 10배 배율을 사용하여 도립 복합 현미경에서 대표 이미지를 촬영합니다.세포를 시각화하려면 현미경에 카메라를 설정하고 소프트웨어와 연결하여 이미지를 획득합니다. 혈구계를 사용하여 응집체를 수동으로 계수합니다. 셰이커에 접시를 놓습니다.5분 및 15분 집계 후 이미지 획득 및 계산을 반복합니다. S2 세포와 S2-Delta 또는 S2-Serrate Tomato 세포 사이의 밀리리터당 응집체 수를 배경 대조군으로 계산하고 S2-Notch와 S2-Delta 또는 S2-Serrate Tomato 세포 사이의 밀리리터당 응집체 수를 계산하여 트랜스 결합 정량화를 수행합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 있는 5배 10의 S2 세포를 보충된 슈나이더 배지의 웰당 1밀리리터로 5배 도금하여 신호 수신 세포를 준비합니다.각 웰에 7.5마이크로그램의 이중 가닥 RNA를 추가하고 플레이트를 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후, 상용 transfection 시약을 사용하여 well당 2마이크로그램의 총 DNA 농도에 대해 이중 가닥 RNA 처리 세포를 cotransfection합니다. 일시적으로 transfection된 S2 세포를 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다.다음날 0.7 밀리몰의 황산구리를 첨가하여 노치와 리간드의 발현을 유도하고 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 신호 전송 셀을 준비합니다. 마지막으로, 앞서 설명한 대로 신호 전송 셀과 신호 수신 셀 간의 집계를 수행합니다.1분에서 5분 사이의 응집체 수가 급격히 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그런 다음 응집체 수는 30분까지 더 느린 속도로 계속 증가했습니다. 세 가지 시점에서의 응집을 보여주는 이미지는 EGFP 이중 가닥 RNA 처리 S2-Notch 세포가 S2-Delta 세포와 응집체를 형성했으며 시간이 지남에 따라 그 수가 증가함을 보여줍니다.대조적으로, 샴 세포와 이중 가닥 RNA 처리된 S2-Notch 세포는 응집체를 더 빨리 형성했으며 응집체는 더 크고 더 많았습니다. 샴 수치가 감소하면 Notch와 Delta의 트랜스 바인딩이 향상되었음을 나타냅니다. 동일한 양의 Notch 및 Delta 발현 구조체를 S2 세포에 transfection하면 이러한 세포와 S2-Delta 세포 사이에 형성되는 응집체의 수가 크게 줄어듭니다.또한, cis-Delta의 양을 줄이면 응집체의 수가 증가합니다. 이러한 분석에 사용된 Notch/cis-Delta 비율 범위에서 cis-Delta는 투여량에 따라 Notch와 trans-Delta 사이의 결합을 억제할 수 있음을 나타냅니다. 상대 응집의 정량화는 EGFP와 shams 이중 가닥 RNA 처리에서 유사한 응집 억제를 보여주었습니다.모든 시약이 준비되면 이 분석은 간단하며 몇 시간 내에 실행할 수 있습니다.

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는 HEK 세포 응집 분석을 통해 시냅스 세포 접착 분자 간의 세포 간 상호 작용을 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 분석에서는 원하는 시냅스전 세포 접착 분자와 형광 단백질을 발현하는 동일한 수의 HEK 세포를 시냅스후 세포 접착 분자 및 다른 형광 단백질을 발현하는 HEK 세포와 혼합합니다. 세포 접착 분자 간의 상호 작용은 세포를 응집시키며, 이는 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다.

Cell Adhesion Molecules 간의 Trans Interaction을 검출하기 위한 Cell Aggregation Assay

이 동영상은 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 초파리 신경근 접합부(NMJ)에서 단백질-단백질 상호 작용의 시각화를 보여줍니다. 체벽을 분리한 후 상호 작용하는 단백질을 1차 항체 및 PLA 접합 2차 항체로 조사합니다. 상호 작용하는 단백질의 근접성은 커넥터 올리고뉴클레오티드와 프로브의 결찰을 용이하게 하여 원형 DNA를 형성한 다음 롤링 서클 증폭에 의해 증폭됩니다. 형광 프로브는 증폭된 DNA에 결합하여 NMJ에서 단백질-단백질 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila larvae using a Proximity Ligation Assay(근접 결찰 분석을 사용한 초파리 유충의 단백질-단백질 상호작용 검출)

exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

초파리는하지만 깊이있는 생화학 적 분석의 적합성에 대한, 강력한 유전자 조작으로 유명합니다. 여기에서 우리는 파리의 뇌에서 관심의 단백질의 상호 작용 파트너를 식별 할 수있는 TAP 기반의 절차를 제시한다. 이 절차는 잠재적으로 연구의 새로운 길을 초래할 수 있습니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

여기에서는 추정 세포 접착 분자의 고유 접착 특성을 특성화하기 위한 간단하고 빠른 방법을 제시합니다.  세포 접착 분자의 분비된 에피토프 태그가 붙은 엑토도메인(ectodomain)은 작고 균일한 기능화된 비드의 배양 배지에서 캡처됩니다.  그런 다음 이러한 beads를 간단한 bead aggregation assay에 즉시 사용할 수 있습니다.

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우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 Drosophila 태아

여기 우리는 초파리 S2R + 셀을 사용 하 여 수축 분석 결과 설명 합니다. Exogenous ligand, 접힌된 gastrulation (안개)의 응용 프로그램 신호 통로 세포 수축 안개의 활성화에 지도 한다. 이 분석 결과 세포 수축 단백질 안개 신호 전달 경로에서 규제 조사를 사용할 수 있습니다.

조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

여기서, 우리는 형광 현미경을 사용하여 이종 세포 시스템에서 트랜스에서 리간드 수용체 상호 작용을 신속하고 반정적으로 측정하는 최적화된 프로토콜을 제시한다.

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

학습하세요 초파리 Notch 수용체와 트랜스-리간드의 결합 및 시스-리간드에 의한 억제를 평가하는 세포 응집 분석법을 통해 신호전달 메커니즘을 규명하는 방법을 배우세요.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

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