트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

이 응집 분석의 전반적인 목표는 Notch 수용체와 트랜스 리간드의 결합과 시스 리간드에 의한 억제를 평가하는 것입니다. 이 방법은 유전적 또는 약리학적 요인이 Notch 수용체와 리간드의 결합에 어떤 영향을 미치고 신호 전달을 변경하는지에 대한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Notch 수용체와 리간드의 트랜스 및 시스 결합을 평가할 수 있다는 것입니다.

흥미롭게도, 내인성 리간드의 중첩 효과를 포함하지 않습니다. 신호 수신 셀을 스핀다운하고 Schneider's Medium에서 재현탁하여 평가를 시작합니다. 혈구계를 사용하여 수동으로 세포를 계수합니다.

5 배 10에서 5 번째 S2 및 6 웰 플레이트의 각 웰에서 안정적인 S2-Notch 셀을 Schneider의 배지 웰 당 1 밀리리터로 플레이트합니다. 다음으로, 각 웰에 7.5마이크로그램의 이중 가닥 RNA를 추가하고 세포를 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다. 0.7 밀리몰의 황산구리를 첨가하여 Notch의 발현을 유도하고 세포를 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다.

배양 후, 혈구계를 사용하여 신호 전달 세포를 수동으로 계수합니다. 및 6-웰 플레이트의 각 웰에서 6번째 안정한 세포를 10배 5회 플레이트하고, 보충된 슈나이더 배지의 웰당 1밀리리터를 주입한다. 그런 다음 0.7 밀리몰의 황산구리를 첨가하여 리간드의 발현을 유도하고 세포를 섭씨 25도에서 3시간 동안 배양합니다.

부드러운 피펫팅으로 이중 가닥 RNA 처리된 S2-control 및 S2-Notch 세포를 수확합니다. 그리고 2.5 곱하기 10을 24-웰 플레이트에서 웰당 다섯 번째 셀에 플레이트합니다. 5번째 안정 S2-Delta 또는 S2-Serrate 토마토 세포에 10의 5배를 총 200마이크로리터의 보충된 Schneider's Medium에 추가합니다.

플레이트를 150rpm의 궤도 셰이커에 놓습니다. 1분 후 각 웰의 내용물을 혼합하고 20마이크로리터를 꺼내 응집체의 수를 계산합니다. 동시에 10배 배율을 사용하여 도립 복합 현미경에서 대표 이미지를 촬영합니다.

세포를 시각화하려면 현미경에 카메라를 설정하고 소프트웨어와 연결하여 이미지를 획득합니다. 혈구계를 사용하여 응집체를 수동으로 계수합니다. 셰이커에 접시를 놓습니다.

5분 및 15분 집계 후 이미지 획득 및 계산을 반복합니다. S2 세포와 S2-Delta 또는 S2-Serrate Tomato 세포 사이의 밀리리터당 응집체 수를 배경 대조군으로 계산하고 S2-Notch와 S2-Delta 또는 S2-Serrate Tomato 세포 사이의 밀리리터당 응집체 수를 계산하여 트랜스 결합 정량화를 수행합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 있는 5배 10의 S2 세포를 보충된 슈나이더 배지의 웰당 1밀리리터로 5배 도금하여 신호 수신 세포를 준비합니다.

각 웰에 7.5마이크로그램의 이중 가닥 RNA를 추가하고 플레이트를 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후, 상용 transfection 시약을 사용하여 well당 2마이크로그램의 총 DNA 농도에 대해 이중 가닥 RNA 처리 세포를 cotransfection합니다. 일시적으로 transfection된 S2 세포를 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다.

다음날 0.7 밀리몰의 황산구리를 첨가하여 노치와 리간드의 발현을 유도하고 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 신호 전송 셀을 준비합니다. 마지막으로, 앞서 설명한 대로 신호 전송 셀과 신호 수신 셀 간의 집계를 수행합니다.

1분에서 5분 사이의 응집체 수가 급격히 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그런 다음 응집체 수는 30분까지 더 느린 속도로 계속 증가했습니다. 세 가지 시점에서의 응집을 보여주는 이미지는 EGFP 이중 가닥 RNA 처리 S2-Notch 세포가 S2-Delta 세포와 응집체를 형성했으며 시간이 지남에 따라 그 수가 증가함을 보여줍니다.

대조적으로, 샴 세포와 이중 가닥 RNA 처리된 S2-Notch 세포는 응집체를 더 빨리 형성했으며 응집체는 더 크고 더 많았습니다. 샴 수치가 감소하면 Notch와 Delta의 트랜스 바인딩이 향상되었음을 나타냅니다. 동일한 양의 Notch 및 Delta 발현 구조체를 S2 세포에 transfection하면 이러한 세포와 S2-Delta 세포 사이에 형성되는 응집체의 수가 크게 줄어듭니다.

또한, cis-Delta의 양을 줄이면 응집체의 수가 증가합니다. 이러한 분석에 사용된 Notch/cis-Delta 비율 범위에서 cis-Delta는 투여량에 따라 Notch와 trans-Delta 사이의 결합을 억제할 수 있음을 나타냅니다. 상대 응집의 정량화는 EGFP와 shams 이중 가닥 RNA 처리에서 유사한 응집 억제를 보여주었습니다.

모든 시약이 준비되면 이 분석은 간단하며 몇 시간 내에 실행할 수 있습니다.